Ćwiczenie 8 Stres oksydacyjny - oznaczanie zawartości nadtlenku

Ćwiczenie 8
Stres oksydacyjny - oznaczanie zawartości nadtlenku wodoru i anionorodnika
ponadtlenkowego
Oznaczanie zawartości nadtlenku wodoru metodą spektrofotometryczną
Odczynniki:
• 20 mM H2O2: sporządzić 3% roztwór nadtlenku wodoru (Pcode: 101308050 – 30,8% H2O2)
– rozcieńczyć odczynnik z Sigmy – 10,27 razy (1 µl H2O2 i 9.27 µl 0,1% TCA), pobrać 22,7
µl 3% roztworu H2O2 i zmieszać z 977 µl 0,1% TCA.
• 0,1% TCA
• 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,6
• 1 M KJ
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści roślin poddanych stresowi i kontrolnych:
2x 1500mg
• 20 mM H2O2 2,5ml
• 0,1% TCA 32 ml standardy + 30 ml próbki
• 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,6 35 ml
• 1 M KJ 70 ml
Sprzęt:
• waga lab.
• Wytrząsarka
• spektrofotometr
• kuwety szklane
Materiał roślinny:
zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści roślin poddanych stresowi i kontrolnych
Procedura:
Przygotowanie standardów:
• Sporządzić wzorce H2O2 w zakresie stężeń 0 – 10 µM poprzez rozcieńczenie 20 mM H2O2.
Sporządzić po 200 µl roztworów o następujących stężeniach H2O2: 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0;
8,0
• Najpierw zrobić 2 mM roztwór H2O2 poprzez 10-krotne rozcieńczenie roztworu 20 mM za
pomocą 0,1% TCA
• Zrobić 16 µM roztwór H2O2 przez 125-krotne rozcieńczenie 2 mM roztworu H2O2 –
zmieszać 5 µl roztworu 2 mM z 620 µl 0,1% TCA (razem 625 µl)
• Do 6 probówek odmierzyć po 312,5 µl 0,1% TCA
•
Do probówki dla 8 µM roztworu dodać 312,5 µl 16 µM roztworu H2O2 – otrzymuje się 8
µM roztwór H2O2. Do następnej (dla 4 µM roztworu) odmierzyć 312,5 µl roztworu 8 µM.
21
Otrzymuje się 4 µM roztwór. ITD, ITD aż do stężenia 0,25 µM.
Wyznaczenie krzywej standardowej:
• Dla każdego standardu przygotować mieszaninę reakcyjną:
500 μl standardu + 500 μl 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,6 + 1000 μl 1 M KJ
• dodatkowo przygotować próbę kontrolną (referencja):
500 μl 0,1 % TCA + 500 μl 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,6 + 1000 μl 1 M KJ
• Składniki dokładnie wymieszać i pozostawić w ciemności na 1 godz. w temp. pokojowej
• przelać do kuwet pomiarowych i umieścić w spektrofotometrze
• odczytać absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy λ = 390 nm wobec referencji.
• Wykreślić krzywą standardową
Przygotowanie ekstraktów
• Odważyć do 6 probówek (1,5ml) po 100 mg proszku z liści roślin stresowych (3 probówki)
i kontrolnych (3 probówki)
• dodać 1 ml 0,1 % kwasu trójchlorooctowego (TCA)
• wytrząsać przez 20 min na lodzie
• Homogenat wirować przez 10 min.
• Supernatant użyć do oznaczenia zawartości H2O2
Oznaczanie zawartości H2O2
• Dla każdej badanej próbki przygotować mieszaninę reakcyjną:
500 μl supernatantu + 500 μl 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,6 + 1000 μl 1 M KJ
• dodatkowo przygotować próbkę kontrolną (referencja):
500 μl 0,1 % TCA + 500 μl 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,6 + 1000 μl 1 M KJ
• Składniki dokładnie wymieszać i pozostawić w ciemności na 1 godz. w temp. pokojowej
• przelać do kuwet pomiarowych i umieścić w spektrofotometrze
• odczytać absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy λ = 390 nm wobec referencji.
• Ilość nmoli H2O2 odczytać z krzywej wzorcowej.
• Ilość nmoli H2O2 w próbie badanej obliczyć z wzoru:
C=(Cst*Vo)/(V*g)
gdzie:
Cst – ilość nmoli H2O2 - odczyt z krzywej wzorcowej
Vo – objętość całkowita supernatantu (1ml)
V – objętość supernatantu dodana do mieszaniny reakcyjnej
g – masa naważki
22