RANSOD

PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Należy użyć próbek heparynizowanej pełnej krwi lub pełnej
krwi EDTA. Zaleca się, aby erytrocyty zostały czterokrotnie
wypłukane przy użyciu 0.9% roztworu NaCl.
RANSOD
Dysmutaza Ponadtlenkowa
TYLKO DO ZASTOSOWAŃ BADAWCZYCH
PRZEZNACZENIE
Do ilościowego określenia dysmutazy ponadtlenkowej
w pełnej krwi w warunkach in vitro.
Nr Kat.
SD 125
5 x 11 t
1. Zmieszany Substrat
2. Bufor
3. Oksydaza ksantynowa
4. Standard
5 x 20 ml
1 x 105 ml
3 x 10 ml
5 x 10 ml
ZASADA OZNACZENIA
Rola dysmutazy ponadtlenkowej superoxide dismutase
(SOD) polega na przyśpieszaniu dysmutacji toksycznych
rodników ponadtlenkowych (02•), wytwarzanych w czasie
energetycznych procesów oksydacyjnych, co prowadzi do
powstawania nadtlenku wodoru i tlenu cząsteczkowego.
Metoda ta wykorzystuje ksantynę i oksydazę ksantynową
xanthine oxidase (XOD), które służą do uzyskania rodników
ponadtlenkowych i reagują z 2-(4-jodofenyl)-3-(4-nitrofenol)
-5-chlorkiem fenyltetrazoliny (I.N.T.) w celu utworzenia
czerwonego barwnika formazanowego. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej jest następnie mierzona na podstawie
stopnia inhibicji tej reakcji. Jedną jednostką SOD jest taka
jej ilość, która powoduje 50% inhibicję szybkości redukcji
INT w warunkach, w których przeprowadzane jest oznaczenie.
XOD
Ksantyna
I.N.T.
02
•
Kwas moczowy + 02•
barwnik formazanowy
LUB
02• + 02•+ 2H+
SOD
Objętość 0.5 ml pełnej krwi odwirowywać przez 10 minut
przy prędkości obrotowej 3000 obr./min, a następnie odessać osocze.
STABILNOŚĆ I PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW
1. Zmieszany substrat Mixed Substrate
Zrekonstytuować zawartość jednej fiolki zmieszanego
substratu Mixed Substrate 1 przy użyciu 20 ml bufora
Buffer 2. Zachowuje stabilność przez 10 dni pod
warunkiem, że jest przechowywany w temperaturze od
+2 do +8°C.
Następnie wypłukać erytrocyty cztery razy przy użyciu 3 ml
0.9% roztworu NaCl odwirowując przez 10 minut przy 3000
obr./min po każdym płukaniu.
2. Bufor Buffer
Zawartość gotowa do użycia. Zachowuje stabilność do
upływu daty ważności, pod warunkiem, że jest przechowywana w temperaturze od +2 do +8°C.
Wypłukane i odwirowane erytrocyty powinny następnie być
uzupełnione do uzyskania objętości 2.0 ml przy użyciu
zimnej, redestylowanej wody, zmieszane i pozostawione do
odstania w temperaturze +4°C przez 15 minut. Lizat
rozcieńcza się przy użyciu buforu fosforanowego 0.01 mol/l
Phosphate Buffer pH 7.0, tak aby uzyskać procentową wartość inhibicji w zakresie pomiędzy 30% i 60%.
3. Oksydaza ksantynowa Xanthine Oxidase
Zrekonstytuować jedną fiolkę oksydazy ksantynowej
Xanthine Oxidase 3 przy użyciu 10 ml redestylowanej
wody. Zachowuje stabilność przez 2 tygodnie, pod
warunkiem, że jest przechowywana w temperaturze od
+2 do +8°C.
W przypadku próbek ludzkich zaleca się 25-krotne
rozcieńczenie lizatu (końcowy współczynnik rozcieńczenia
Final dilution factor = 100), natomiast w przypadku próbek
wołowych 50-krotne (końcowy współczynnik rozcieńczenia =
200).
DOBÓR ODCZYNNIKÓW
Zawartość
1. Zmieszany Substrat
Ksantyna
I.N.T.
2. Bufor
CAPS
EDTA
3. Oksydaza Ksantyowa
4. Standard
Początkowe stężenie roztworów
4. Standardy Standards
Zrekonstytuować jedną fiolkę standardu Standard 4 przy
użyciu 10 ml redestylowanej wody. Kolejne
rozcieńczenia tego standardu powinny być
przygotowane przy użyciu rozcieńczalnika próbki
Ransod sample diluent.
W celu uzyskania standardowej krzywej zaleca się sporządzenie podanych poniżej rozcieńczeń standardu
Standard 4 (lub S6):Objętość
0.05 mmol/l
0.025 mmol/l
40 mmol/l, pH 10.2
0.94 mmol/l
80 U/l
patrz wartość podana na fiolce
02 + H202
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI I OSTRZEŻENIA
Tylko do przeprowadzania badań diagnostycznych w warunkach in vitro. Nie pipetować przy użyciu ust. Zachować
typowe środki ostrożności obowiązujące przy kontakcie z
odczynnikami stosowanymi w warunkach laboratoryjnych.
Na żądanie dostępne są arkusze danych dotyczących
zdrowia i bezpieczeństwa Health and Safety Data Sheets.
Odczynniki mogą być używane wyłącznie do celów
zgodnych z ich przeznaczeniem, przez odpowiednio
wykwalifikowany personel laboratoryjny, w odpowiednich warunkach laboratoryjnych.
S6
S5
S4
S3
S2
Objętość
Roztw. Standardu
Rozcieńczalnik Próbki
Nierozcieńczony Standard
5 ml - S6
5 ml - S5
5 ml - S4
3 ml - S3
5 ml
5 ml
5 ml
6 ml
S1 = Rozcieńczalnik Próbki Sample Diluent
Wszystkie rozcieńczone standardy są stabilne przez 2 tygodnie w temperaturze od +2 do +8°C.
DOSTARCZONE MATERIAŁY
Zmieszany substrat Mixed Substrate
Bufor Buffer
Oksydaza ksantynowa Xanthine Oxidase
Standard Standard
MATERIAŁY POTRZEBNE, LECZ NIE DOSTARCZONE
Rozcieńczalnik Ransod Diluent (Nr Kat. SD 124)
Test kontrolny Ransod Control (Nr Kat. SD 126)
INSTRUKCJA - RANSOD - SD 125
STRONA 2 / 2
Należy wykreślić procentową wartość inhibicji dla każdego
standardu względem Log10 (standardowe stężenie w jednostkach SOD/ml).
PROCEDURA
Długość fali światła:
Kuweta:
Temperatura:
Pomiar:
505 nm
droga światła 1 cm
37°C
względem powietrza
jednostki SOD/ml pełnej krwi =
Pipetować do kuwety:
Rozcieńczalnik Standardy Rozcieńcz.
Próbki
S2 - S6
Próbka
Rozcieńczona próbka
--Standard
--Rozcieńcz. próbki Ransod 0.05 ml
Zmieszany substrat
1.7 ml
--0.05 ml
--1.7 ml
0.05 ml
----1.7 ml
0.25 ml
0.25 ml
0.25 ml
Zmieszać, zmierzyć początkową absorbancję A1 po 30 sekundach i jednocześnie uruchomić czasomierz. Zmierzyć
końcową absorbancję A2 po 3 minutach.
OBLICZENIA
A2 - A1
= -A/min dla próbki lub standardu
Współczynnik rozcieńczenia próbki (współcz. S1) = współczynnik dla
reakcji bez inhibicji = 100 %
Wszystkie standardowe współczynniki i współczynniki
rozcieńczenia próbki muszą być poddane konwersji, tzn.
zamienione na wartość procentową współczynnika rozcieńczenia próbki i odjęte od 100 % w celu określenia
procentowej inhibicji.
(-Astd/min x 100)
= % inhibicji
(-AS1/min)
100 -
(-Apróbki/min x 100)
(-AS1/min)
Konwersja na jednostki SOD /g hemoglobiny
jednostek SOD/ml
= jednostek SOD/g Hemoglobiny
g Hemoglobiny/ml
(a) Próbka wołowa została rozcieńczona w proporcji 1 do
300 przy użyciu rozcieńczalnika próbki Ransod. Rozcieńczona próbka dała poziom inhibicji wynoszący 33 %.
Na podstawie krzywej standardowej:
Liczba jednostek SOD w próbce = 0.575
(b) Konwersja na jednostki SOD/ml pełnej krwi
3
100 -
jednostki SOD/ml z krzywej standardowej x współczynnik
rozcieńczenia
ILUSTRACJA
Dobrze wymieszać
Oksydaza ksantynowa
Użyć wartości procentowej inhibicji dla próbki w celu uzyskania liczby jednostek SOD na podstawie standardowej
krzywej.
= % inhibicji
0.575 x 300 = 172.5 jednostek SOD /ml
(c) Konwersja na jednostki SOD /g Hemoglobiny
Zawartość hemoglobiny w próbce = 0.118 g/ml
3. Sprawdzić wodę pod względem zanieczyszczenia
spowodowanego przez obecność bakterii, gdyż ich
rozmnażanie się może spowodować uzyskiwanie
niedokładnych wyników.
4. Sprawdzić temperaturę reakcji.
5. Sprawdzić termin ważności zestawu i jego zawartość.
6. Skontaktować się z firmą Randox Laboratories - działem
pomocy technicznej Customer Technical Support, Irlandia
Północna tel. (028) 94422413 lub jej autoryzowanym
przedstawicielem.
ZAKRESY NORMALNE
1102 - 1601 U/g Hb
164 - 240 U/ml
Zaleca się, aby każde laboratorium ustaliło swój własny
zakres referencyjny uwzględniający wiek, płeć, dietę i lokalizację geograficzną danej populacji.
LINIOWOŚĆ
Próbki powinny zostać rozcieńczone w taki sposób, aby
uzyskać stopień inhibicji w zakresie pomiędzy wartościami
współczynnika rozcieńczenia próbki sample diluent rate wynoszącymi 30 % i 60 % (tzn. odpowiadające reakcji bez inhibicji).
LITERATURA
1. Woolliams JA, Wiener G, Anderson PH, McMurray CH
Research in Veterinary Science 1983, 34: 253-256.
2. Suttle NF The Veterinary Record 1986, 119: 519-522.
3. Suttle NF, McMurray CH Research in Veterinary
Science 1983; 35: 47-52
4. Arthur JR, Boyne R Life Sciences 1985 36: 1569-1575.
172.5
(jedn. SOD/ml)/(g Hemoglobiny/ml) =
= 1461.9
0.118
KONTROLA JAKOŚCI
Test Ransod Control jest zalecany do stosowania dla potrzeb
codziennej kontroli jakości. Wartość kontrolna powinna być
oznaczana co najmniej raz na dzień. Uzyskane wartości powinny mieścić się w odpowiednim zakresie. Jeżeli te wartoś-ci
znajdą się poza zakresem i powtórzenie testu wyklucza błąd,
należy podjąć kroki opisane poniżej:
1. Sprawdzić ustawienia urządzenia i źródło światła.
2. Sprawdzić czystość całego wykorzystywanego sprzętu.
RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY
Tel:CRUMLIN (028)94422413 Fax.No.INT.44 (028)94452912 UK (028)94452912
Email: [email protected] Website: www.randox.com
Wersja zweryfikowana 31/05/02 wpt
Α αβχδ ΑΒΧ