Ćwiczenie 1 - aminokwasy

Ćwiczenie 1
AMINOKWASY. BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI
Część doświadczalna obejmuje:
- rozdział aminokwasów metodą chromatografii podziałowej (technika chromatografii bibułowej
wstępującej)
- miareczkowanie alaniny (wyznaczenie wartości pI i wartości pKa grupy karboksylowej i aminowej)
- wykonanie reakcji charakterystycznych dla wybranych aminokwasów
WPROWADZENIE
Aminokwasy są kwasami organicznymi zawierającymi wolną grupą karboksylową oraz wolną
grupą aminową, połoŜoną przy α-atomie węgla. Poza tymi dwoma grupami, kaŜdy aminokwas ma
charakterystyczny dla siebie łańcuch boczny R (Ryc. 1 i 2)
Ryc. 1. Schemat budowy i zróŜnicowanie funkcjonalne aminokwasów (Koolman, Röhm 2005)
Aminokwasy są składnikami budulcowymi peptydów i białek (aminokwasy proteinogenne). Niektóre aminokwasy wchodzą w skład lipidów, np. seryna występuje w fosfolipidach, a glicyna w
solach Ŝółciowych. Glutaminian, asparaginian oraz glicyna odgrywają rolę neuroprzekaźników.
Wszystkie aminokwasy, za wyjątkiem tylko lizyny i leucyny, mogą być metabolitami pośrednimi
szlaku glukoneogenezy (aminokwasy glukogenne), tzn. mogą posłuŜyć do biosyntezy glukozy.
Niektóre aminokwasy (asparaginian, glutaminian) są wykorzystywane do syntezy zasad puryno1
wych i pirymidynowych, hemu (glicyna), amin biogennych (np. seryna, glutaminian) (Ryc. 4).
Niektóre aminokwasy są donorami grup aminowych przenoszonych na ketokwasy, a inne funkcjonują w cyklu mocznikowym (ornityna, cytrulina) (Ryc. 3).
Ryc. 2. Łańcuchy boczne aminokwasów proteinogennych (Koolman, Röhm 2005)
Na ryc. 2 przedstawiono łańcuchy boczne dwudziestu aminokwasów budujących białka (aminokwasy proteinogenne), które ze względu na budowę chemiczną oraz polarność łańcuchów bocznych podzielono na siedem klas. Wartości podane na dole po lewej przedstawiają stopień polarności
danego łańcucha bocznego (najmniejszy u Phe, Cys, Met, Ala, a największy u Arg, Lys). Przy łańcuchach bocznych zdolnych do jonizacji podane są takŜe wartości pK (czerwone liczby). Szczegól-
2
ną pozycję wśród aminokwasów zajmuje prolina (Pro). Jej łańcuch boczny wraz z węglem-α i grupą
aminową przy tym węglu tworzą 5-członowy pierścień. Atom azotu w pierścieniu jest słabo zasadowy i w warunkach fizjologicznych nie jest uprotonowany. Aminokwasy, które nie mogą być syntetyzowane w organizmach ludzkich (aminokwasy egzogenne), oznaczone są czerwoną gwiazdką.
Ryc. 3. Aminokwasy rzadkie (Koolman, Röhm 2005)
Ryc. 4. Aminy biogenne pochodne aminokwasów (Koolman, Röhm 2005)
Właściwości amfoteryczne aminokwasów. Obecność w aminokwasach grupy karboksylowej i grupy aminowej powoduje, Ŝe są one związkami amfoterycznymi. W roztworach wodnych występują
głównie w formie jonów. W zaleŜności od pH środowiska jony te mogą mieć charakter kwasowy
bądź zasadowy.
3
W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton, staje się kationem i zachowuje jak kwas,
gdyŜ występujące w cząsteczce grupa karboksylowa –COOH i grupa amoniowa –NH3+ mogą być
donorami protonów. W środowisku zasadowym aminokwas oddając proton staje się anionem i
dlatego zachowuje się jak zasada, poniewaŜ zdysocjowana grupa karboksylowa –COO- i grupa
aminowa –NH2 mogą przyłączać protony. Jest taka wartość pH roztworu, w której cząsteczki aminokwasów występują w formie jonu obojnaczego, w którym liczba ładunków ujemnych jest równa
liczbie ładunków dodatnich, czyli sumarycznie ładunek równy jest zeru. Taka wartość pH nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pI).
Charakter amfoteryczny aminokwasów ujmuje graficznie krzywa miareczkowania roztworów aminokwasów mocnymi kwasami lub zasadami (Ryc. 5). Krzywa przedstawia zaleŜność wartości pH
miareczkowanego roztworu od liczby dodanych moli kwasu lub zasady. ZaleŜność między wartością
pH a stanem dysocjacji opisano równaniem Hendersona-Hasselbalcha, gdzie Ka = stała kwasowa, a
pKa = ujemny logarytm stałej kwasowej
Z powyŜszego równania wynika, iŜ w warunkach, gdy formy zdysocjowana i niezdysocjowana są w
stęŜeniach równowagowych, to pKa = pH
Ryc. 5. Krzywa miareczkowania histydyny (Karlson 1987)
4
Miareczkowanie roztworu aminokwasu połączone z jednoczesnym pomiarem pH roztworu pozwala
na doświadczalne wyznaczenie krzywej dysocjacji aminokwasu, określenie jego wartości pI oraz
wyznaczenie wartości pKa jego grup funkcyjnych.
Rozdział aminokwasów
Jedną z metod rozdziału aminokwasów pozwalającą izolować z mieszaniny pojedyncze aminokwasy jest chromatografia podziałowa. Opiera się ona na prawie podziału solutu (substancji rozpuszczonej) między dwie fazy ciekłe - ruchomą i stacjonarną. Faza stacjonarna utrzymywana jest
przez porowaty nośnik słabo adsorbujący składniki solutu. Porowatym nośnikiem moŜe być bibuła
lub Ŝel ułoŜony w kolumnie chromatograficznej lub wylany na płytkę. Warunkiem decydującym o
rozdziale substancji są róŜnice w ich rozpuszczalności w fazie ruchomej i nieruchomej, a więc
róŜnice we współczynnikach podziału między dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe. Chromatografia podziałowa opiera się więc na prawie Nernsta, które mówi, iŜ w układzie utworzonym
przez dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe i wspólny dla nich solut, stosunek stęŜenia tego
solutu w fazie 1 (c1) do jego stęŜenia w fazie 2 (c2) jest w stanie równowagi wielkością stałą, zaleŜną od temperatury i właściwości substancji tworzących roztwory, a niezaleŜną od ilości substancji rozpuszczonej: c1/c2 = k
Miarą selektywności rozdziału dwóch substancji A i B w danym układzie jest stopień rozdziału,
którego wartość określa wzór: β = KA/KB gdzie KA określa stosunek podziału substancji A, KB stosunek podziału substancji B między fazę ruchomą i nieruchomą.
Technika chromatografii bibułowej. W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy stacjonarnej,
najczęściej polarnej, jest odpowiednio spreparowana bibuła filtracyjna. Bibuła jest zbudowana z
włókien celulozowych ułoŜonych w porowatą, Ŝelową strukturę stanowiącą fazę nieruchomą. Cząsteczki wody zaadsorbowane na bibule łączą się z włóknami celulozy wiązaniami wodorowymi.
Fazę ruchomą w chromatografii bibułowej stanowią odpowiednie rozpuszczalniki organiczne pojedyncze lub zmieszane. Rozpuszczalniki muszą się częściowo mieszać z wodą np. szeroko rozpowszechnionym układem jest mieszanina n-butanolu/kwasu octowego/wody w zmiennych proporcjach.
Szybkość wędrowania danego związku w określonych warunkach jest wartością stałą. Jej miarą
jest wartość Rf : Rf = x/y, gdzie x - odległość od linii startowej do środka plamy aminokwasu, a y odległość od linii startowej do czoła rozpuszczalnika. W tabeli I podane są wartości Rf dla większo-
5
ści aminokwasów rozdzielanych w warunkach zbliŜonych do tych, w jakich będzie wykonywane
ćwiczenie.
Tabela I. Wartości Rf aminokwasów (jako fazy ruchomej uŜywano mieszaniny: n-butanol/kwas
octowy/woda zmieszanych w stosunku 4:1:1)
Lp. Nazwa aminokwasu
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
alanina
arginina
kwas asparaginowy
asparagina
cystyna
cysteina
kwas cysteinowy
fenyloalanina
glicyna
kwas glutaminowy
glutamina
histydyna
leucyna
izoleucyna
lizyna
metionina
sulfonian metioniny
prolina
hydroksyprolina
seryna
treonina
tryptofan
tyrozyna
walina
ornityna
cytrulina
Symbol aminokwasu
Ala
Arg
Asp
Asn
A
R
D
N
Cys
CysSO3H
C
Phe
Gly
Glu
Gln
His
Leu
Ile
Lys
Met
F
G
E
Q
H
L
I
K
M
MetSO3H
Pro
ProOH
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Orn
Cytr
P
S
T
W
Y
V
Wartości Rf x 100 w układzie
rozpuszczalników:
n-butanol/CH3COOH/H2O
30
15
22
12
5
8
7
60
23
28
17
11
70
67
12
50
22
34
22
22
26
50
45
51
12
18
WYKONANIE
Chromatografia bibułowa wstępująca
Na arkusz bibuły o wymiarach 15 x 20 cm z zaznaczoną linią startową, w 2 cm odstępach nanieść po kilka µl roztworu wzorcowych aminokwasów (glicyna, alanina, tyrozyna, leucyna) oraz
taką samą objętość roztworu zawierającego mieszaninę aminokwasów (próba badana). KaŜdy
aminokwas wzorcowy oraz próbkę badaną nanieść na bibułę dwukrotnie w celu wyeliminowania
ewentualnych artefaktów. W czasie nanoszenia próbek miejsce nanoszenia naleŜy suszyć suszarką
do włosów, tak by wielkość plamek była moŜliwie jak najmniejsza. Arkusz bibuły z naniesionymi
6
próbkami zwinąć w cylinder, zszyć zszywkami i umieścić do rozwinięcia w komorze chromatograficznej. Rozdział przerwać, gdy rozpuszczalnik dotrze na wysokość około 1,5 cm od górnego brzegu
bibuły. Po wyjęciu bibuły z komory, zaznaczyć ołówkiem czoło rozpuszczalnika, bibułę wysuszyć
w strumieniu ciepłego powietrza (ok. 500C), spryskać roztworem ninhydryny, a następnie wysuszyć w suszarce w temperaturze 800C w celu zlokalizowania miejsca połoŜenia rozdzielonych
aminokwasów. Pomierzyć odległości od linii startu do środka wybarwionych plamek oraz odległość
do czoła rozpuszczalnika, a następnie obliczyć wartości współczynnika Rf. Porównując wartości Rf
aminokwasów wzorcowych i aminokwasów zawartych w próbce zidentyfikować aminokwasy występujące w otrzymanej do analizy mieszaninie. NaleŜy równieŜ porównać wyliczone wartości Rf z
wartościami zamieszczonymi w Tabeli I.
Miareczkowanie aminokwasów
15 ml 50 mM roztworu alaniny w 0,1 M HCl wlać do zlewki, dodać 15 ml 0,1 M NaOH. Ustawić na
mieszadle magnetycznym i zmierzyć pH roztworu (Uwaga! Bardzo ostroŜnie opuszczać elektrodę
wodorową pHmetru). Dodawać ostroŜnie po 1 ml 0,1 M roztworu NaOH mierząc i zapisując cały
czas wartości pH. Po zakończeniu miareczkowania wykreślić krzywą zaleŜności pH roztworu od
ilości dodanego NaOH, wyznaczyć wartości pKa grupy karboksylowej i aminowej oraz wartość pI
alaniny.
Reakcje charakterystyczne aminokwasów
A, Reakcje ogólne:
Reakcja z ninhydryną
Do 0,1 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 1 kroplę 0,1% roztworu ninhydryny i ogrzać do
wrzenia. Pojawia się fioletowo-niebieskie zabarwienie. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do iminokwasów. Kolejne etapy przemian to deaminacja i dekarboksylacja oraz wytworzenie aldehydu skróconego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji utlenionej i zredukowanej w powyŜszym procesie cząsteczki ninhydryny oraz amoniaku powstaje kompleks o fioletowo-niebieskiej barwie (maksimum absorpcji przy λ = 570 nm), którego natęŜenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasu. Reakcja z ninhydryną moŜe słuŜyć do ilościowego oznaczania aminokwasów metodą spektrofotometryczną. Dodatni odczyn ninhydrynowy
dają obok aminokwasów, peptydów i białek takŜe sole amonowe, aminocukry i amoniak.
7
Reakcja z kwasem azotawym (kwasem azotowym(III))
Do 1 ml ochłodzonego w lodzie, świeŜo przyrządzonego 10% azotanu (III) sodu (azotyn sodu)
dodać taką samą objętość 2M kwasu octowego. W wyniku reakcji powstaje kwas azotawy HNO2 Po
zmieszaniu obu roztworów zaczekać do momentu zakończenia wydzielania się pęcherzyków tlenków azotu, a następnie dodać 2 ml 1% roztworu aminokwasu. Wydziela się burzliwie azot.
HOOC - CH2 - NH2 + O = N - OH
HOOC - CH2OH + H2O + N2
Reakcja z kwasem azotawym umoŜliwia manometryczne oznaczanie azotu grup aminowych polegające na mierzeniu objętości wydzielającego się azotu (reakcja Van Slyke’a).
Tworzenie związków chelatowych
Do 3 ml 1% roztworu aminokwasu dodać szczyptę węglanu miedzi (II). Ogrzać próby do wrzenia. Po minucie, intensywnie niebieski roztwór przesączyć na gorąco. Po ochłodzeniu przesączu
wykrystalizowuje kompleks aminokwasu z miedzią w postaci delikatnych igieł.
2 H2N - CH2 - COOH + CuCO3
Cu (OOC - CH2 - NH2)2 + CO2 + H2O
COO
Kompleks glicyna - miedź
H 2N
H 2C
Cu
NH2
CH2
OOC
8
B, Reakcje charakterystyczne dla wybranych aminokwasów
Reakcja ksantoproteinowa
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,25 ml stęŜonego HNO3 i kroplę stęŜonego H2SO4.
Roztwór barwi się na Ŝółto. Po zalkalizowaniu 30% roztworem NaOH, zabarwienie przechodzi w
pomarańczowe. Reakcja ta jest charakterystyczna dla aminokwasów aromatycznych i fenoli. W
wyniku działania stęŜonego HNO3 pierścień benzenowy ulega nitrowaniu, a powstałe Ŝółte pochodne wielonitrowe dają w roztworze zasadowym pomarańczowe aniony nitrofenolanowe.
Reakcja na tyrozynę – reakcja Millona
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać kilka kropel odczynnika Millona (10 g azotanu (V)
rtęci (I) rozpuścić w 100 ml 3,6 M kwasu azotowego (V), uzupełnić wodą dest. do 200 ml i lekko
podgrzać do 40oC). Roztwór barwi się na kolor ceglasto-róŜowy, następnie na czerwony. Reakcja ta
jest charakterystyczna dla monofenoli, a więc z aminokwasów tylko dla tyrozyny. SłuŜy ona do
ilościowego oznaczania tyrozyny metodą kolorymetryczną.
Reakcja na tryptofan – reakcja Cole-Hopkinsa
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać kilka kropel kwasu glioksalowego. Po wymieszaniu,
roztwór naleŜy ostroŜnie podwarstwić stęŜonym roztworem H2SO4. Na granicy cieczy powstaje
fioletowy pierścień. Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu, aminokwasu zawierającego
9
pierścień indolowy. W obecności kwasu siarkowego (VI) i aldehydu (kwas glioksalowy), dwa ugrupowania indolowe ulegają kondensacji tworząc barwny fioletowy związek.
tryptofan
kwas glioksalowy
związek barwny
Reakcja na argininę – reakcja Sakaguchi
Do 1 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,25 ml 5% roztworu NaOH, 2 krople 1% roztworu αnaftolu i jedną kroplę roztworu chloranu (I) sodu. Po wymieszaniu pojawia się powoli czerwone
zabarwienie. Pochodne guanidyny, takie jak metyloguanidyna i arginina z utlenionym przez chloran
(I) α-naftolem dają barwny związek i amoniak. Amoniak pod wpływem chloranu (I) utlenia się. Z
jednego mola guanidyny uwalnia się 1/2 mola N2.
α - naftol
arginina
związek barwny
+ 3 NaClO
2 NH3
→
N2 + 3 H2O + 3 NaCl
Reakcja cystynowa
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,5 ml 10% roztworu NaOH i kilka kropel nasyconego roztworu octanu ołowiu. Z cystyny i cysteiny przy ogrzewaniu ze stęŜonym NaOH wydziela
się siarkowodór, który w reakcji z Pb2+ daje siarczek ołowiu. Po dłuŜszym gotowaniu roztwór staje
się brunatny, a następnie wytrąca się osad PbS.
NaOH
Pb(OOC - CH3)2
NaOH
Pb(OH)3-
Pb(OH)2
10
H2S
PbS
Zagadnienia do przygotowania:
- wzory, symbole trzy- i jednoliterowe aminokwasów proteinogennych oraz aminokwasów cyklu
mocznikowego (ornityna, cytrulina)
- klasyfikacja aminokwasów oparta na budowie chemicznej łańcucha bocznego oraz jego polarności
- podstawowe funkcje aminokwasów (przykłady)
- ogólne zasady chromatografii podziałowej; technika chromatografii bibułowej wstępującej
- reakcje ogólne na aminokwasy (znajomość reakcji z ninhydryną)
-wybrane reakcje charakterystyczne dla aminokwasów
Piśmiennictwo:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Zarys biochemii – P Karlson PWN, Warszawa, 1987
Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
11