COX-1 - Diagnostyka Laboratoryjna

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 2 • 153-162
Praca oryginalna • Original Article
Badanie aktywności podjednostki cyklooksygenazowej
i podjednostki peroksydazowej cyklooksygenazy 1
(COX-1) z wykorzystaniem metody oksygraficznej
i fluorescencyjnej
Monitoring of the activities of cyclooxygenase and peroxidase
subunits of cyclooxygenase 1 (COX-1) with the use of
oxygraphic and fluorescence assays
Karolina Siewiera, Hassan Kassassir, Cezary Watała
Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Streszczenie
Długa, ponad 50-letnia historia badań nad płytkową cykloksygenazą 1 (COX-1) pozwoliła opracować liczne protokoły laboratoryjne oznaczania aktywności podjednostek tego enzymu. Mnogość protokołów stanowi źródło cennych informacji, ale jednocześnie utrudnia dobór optymalnej metody, pozwalającej kompleksowo badać funkcjonowanie tego białka, a jednocześnie
oceniać wpływ różnych inhibitorów aktywności podjednostek COX-1.
Cel badań: Celem poniższej pracy było dopracowanie metodologii kompleksowego badania cyklooksygenazy 1 oraz standaryzacja protokołów oznaczenia aktywności poszczególnych podjednostek enzymu. Kluczowe stało się określenie parametrów
wpływających na wiarygodną i powtarzalną detekcję aktywności poszczególnych podjednostek, tj. optymalnej aktywności
enzymu, optymalnego stężenia substratu, temperatury preinkubacji enzymu przed pomiarem oraz składu buforu wykorzystywanego do oznaczenia aktywności COX-1.
Materiały i metody: Aktywność podjednostki cyklooksygenazowej enzymu badano metodą polarograficzną (oksygraficzną),
natomiast aktywność podjednostki peroksydazowej badano z użyciem testu opartego o katalizowaną przez prostaglandynę G2
reakcję transformacji nienaturalnego substratu COX-1, 10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyny (ADPH) do rezorufiny o silnych
właściwościach fluorescencyjnych.
Wyniki: W przypadku badań oksygraficznych wykazano istotne znaczenie sposobu przygotowania kwasu arachidonowego, składu rozpuszczalnika oraz użytego w pomiarach buforu dla odczytywanej aktywności COX-1. Nie stwierdzono różnic
w aktywności domeny peroksydazowej COX-1 dla stężeń enzymu poniżej 100 U/ml, zanotowano natomiast wyraźny wzrost
aktywności enzymu dla stężeń powyżej 1000 U/ml. Wykazano, że preinkubacja enzymu zwiększa jego aktywność w porównaniu do enzymu nieinkubowanego, nie odnotowano jednak wpływu temperatury preinkubacji na aktywność COX-1. Wpływ
temperatury preinkubacji na stopień inhibicji COX-1 przez inhibitor SC-560 był niewielki, lecz istotny.
Wnioski: Uzyskane wyniki pozwoliły wybrać optymalne warunki oznaczania aktywności poszczególnych podjednostek COX-1
i umożliwiły dopracowanie metodologii pracy z tym enzymem.
Summary
Over 50-year of research on cyclooxygenase 1 (COX-1) a variety of laboratory protocols for determining the activities of
individual COX-1 subunits, the cyclooxygenase subunit and peroxidase subunit, has emerged. Being a source of a valuable
information, they also render the selection of the most optimal method difficult.
Aim of the study: Our major objective was to refine the methodology for a comprehensive study of the enzyme’s individual
subunits. For each subunit we aimed at verifying the parameters crucial for optimal performance of the used assays that could
affect the activities of subunits in metabolic pathways of arachidonic acid, i.e. optimal enzyme activity, optimal substrate concentration, temperature of enzyme pre-incubation prior to measurement or composition of test buffer.
Materials and Methods: The activity of cyclooxygenase subunit was examined using polarographic (oxygraphic) method, while
the peroxidase subunit activity was monitored using the fluorescence assay based on the prostaglandin G2–catalyzed transformation of 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADPH) to fluorescing resorufin.
153
Badanie aktywności podjednostki cyklooksygenazowej i podjednostki peroksydazowej cyklooksygenazy 1 (COX-1) ...
Results: We have shown that in oxygraphic measurements the preparation of arachidonic acid and test buffer composition are
major determinants of the resultant outcomes of COX-1 assay. The used COX-1 activity matters if we use enzyme activities
above 1000 U/ml. Enzyme preincubation seems adventageous, but preincubation temperature demonstrates no effect on
COX-1 activity. The slight but significant effects of pre-incubation temperatures on the extent of COX-1 inhibition by SC-560
has also been revealed
Conclusions: Our results may be helpful to choose optimal conditions for determining the activity of individual enzyme subunits. Hence, they enable to refine the methodology used for investigation of COX-1.
Słowa kluczowe:inhibitor podjednostki cyklooksygenazowej - indometacyna, inhibitor podjednostki peroksydazowej - SC560, kwas arachidonowy, metoda oksymetryczna, polarografia, oksygraf
Key words:arachidonic acid, cyclooxygenase subunit inhibitor - indomethacin, oxygraph, oxymetric assay, polarography,
peroxidase subunit inhibitor - SC-560
Praca sfinansowana z funduszy projektu naukowo-badawczego MNiSW N N401 265839.
Wstęp
Cyklooksygenaza 1 (COX-1), znana również jako syntaza
cyklicznego nadtlenku prostaglandynowego typu 1 (PGHS1), została po raz pierwszy zidentyfikowana i określona przez
dwie niezależne grupy badawcze w 1964 roku, jako enzym
przekształcający kwas arachidonowy do prostaglandyny H2
[1, 2]. Było to przyczyną znacznego wzrostu zainteresowania w latach 60. i 70. prostaglandynami oraz ich biologicznymi aktywnościami w organizmie. Przez następne lata, także
w wyniku równoległego działania wielu ośrodków naukowych na całym świecie, udało się rozszyfrować sekwencję
genetyczną (1980) oraz poznać różne izoformy tego enzymu
(1990). Dziś wiadomo, iż COX-1 wykazuje dwie właściwości
katalityczne, uwarunkowane występowaniem dwóch podjednostek (Ryc.1), a tym samym, dwóch odmiennych miejsc
aktywnych w cząsteczce białka [3, 4]. Stwarza to możliwości
badania obu podjednostek enzymu niezależnie [5].
Określenie aktywności domeny cyklooksygenazowej polega
na monitorowaniu zużycia tlenu wykorzystywanego przez
enzym do utlenienia kwasu arachidonowego w reakcji prowadzącej do powstania prostaglandyny G (PGG2) [6]. Metoda ta, chociaż nie pozbawiona ograniczeń, jest chętnie wykorzystywana do oceny kinetyki enzymu i wpływu różnych
inhibitorów. Najprostszym sposobem oznaczenia aktywności domeny peroksydazowej COX-1 jest wykorzystanie zjawiska redukcji PGG2 z jednoczesnym utlenieniem substratu
do barwnego produktu, którego obecność można mierzyć
technikami spektroskopowymi [7]. Aktywność podjednostki
peroksydazowej w niniejszej pracy zbadano z użyciem testu opartego o reakcję utleniania przez prostaglandynę G2
substratu - ADPH (10-acetylo-3,7 dihydroksyfenoksazyny),
z wytworzeniem produktu o silnych właściwościach fluorescencyjnych - rezorufiny. Alternatywą dla badań poszczególnych podjednostek enzymu COX-1 może być, stosowana przez niektórych badaczy, ocena końcowych produktów
jego aktywności, czyli PGH2 (lub częściej prostaglandyny
E2, będącej produktem nieenzymatycznego rozpadu prostaglandyny H2). Chociaż jest to metoda charakteryzująca się
największą czułością, pozwala ona oceniać jedynie efekt
końcowy, a nie poszczególne etapy aktywności COX-1.
154
Celem niniejszej pracy było dopracowanie metod niezależnej oceny aktywności dwóch podjednostek COX-1: cyklooksygenazowej i peroksydazowej, opierających się na dwóch
rodzajach badań/testów: metodzie polarograficznej i metodzie fluorescencyjnej, oraz ustalenie warunków pomiarów
pozwalających na szybkie testowanie stopnia hamowania
Rycina 1
Metabolizm kwasu arachidonowego opiera się o aktywność dwóch
różnych podjednostek COX-1. W pierwszym etapie domena cyklooksygenazowa katalizuje przyłączenie dwóch moli tlenu cząsteczkowego do cząsteczki kwasu arachidonowego i powstanie produktu pośredniego PGG2. Następnie, ze względu na aktywności podjednostki
peroksydazowej dochodzi do redukcji PGG2 do postaci PGH2.
aktywności COX-1 przez nowo-badane inhibitory enzymu.
Materiał i Metody
Odczynniki
Owczą cyklooksygenazę 1 (izolowaną z pęcherzyków nasiennych barana) zakupiono w firmie Cayman Chemicals
(USA), podobnie jak test do fluorescencyjnego wykrywania
aktywności COX (COX Fluorescent Activity Assay Kit). Kwas
arachidonowy użyty w badaniu polarograficznym zakupiono
w firmie Nu-Chek Prep. Inc. (USA). Pozostałe odczynniki
(fenol, hemina, kwas etylenodiaminoczterooctowy [EDTA],
chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu [Tris-HCl]
oraz dimetylosulfotlenek [DMSO]), o ile nie zaznaczono inaczej, pochodziły z firmy Sigma-Aldrich.
Opracowanie metody oksygraficznej pomiaru aktywności COX-1
Aktywność cyklooksygenazową COX-1 monitorowano metodą ciągłego pomiaru zużycia tlenu, korzystając z oksygrafu
Oroboros-O2k (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria).
Ilość zużytego tlenu wyrażano w pmol O2/(s*ml). Reakcję
utleniania zainicjowano poprzez dodanie substratu dla enzymu - kwasu arachidonowego. Podstawowe (tuż przed dodaniem kwasu arachidonowego) i maksymalne (po dodaniu
kwasu arachidonowego) zużycie tlenu było obliczane jako
pochodna zmiany stężenia tlenu w czasie przy wykorzystaniu programu do analizy danych oksymetrycznych DatLab
4 (Oroboros Instruments, Innsbuck, Austria). Sprawność
przekształcania przez COX-1 kwasu arachidonowego do
prostaglandyny G2 oceniano na podstawie różnicy wartości
maksymalnej i wartości podstawowej zużycia tlenu w komorze pomiarowej.
W celu wykonania pomiaru komory reakcyjne oksygrafu (każda o pojemności 2 ml) wypełniono odpowiednim buforem, a następnie szczelnie zamknięto.
W celu ustabilizowania pracy elektrod, zamknięcia komór
unoszono powoli w górę, aby do komory przedostawał
się tlen z powietrza. Kiedy sygnał zużycia tlenu (a konkretnie, pochodna zmiany stężenia tlenu w czasie) był
stabilny, komory zamknięto. Do każdej komory dodano
odpowiednią ilość COX-1 zrekonstytuowanego uprzednio w 50 µl roztworu. Proces rekonstytuowania COX1 polegał na 1-minutowej inkubacji enzymu na lodzie
z niewielkim nadmiarem heminy. Wyjściowy roztwór heminy o stężeniu 1 mM w DMSO rozcieńczano 1000-krotnie
buforem do pomiarów aktywności COX-1, a ilości enzymu
i heminy dobierano w taki sposób, aby ich molarny stosunek
wynosił 1:1.2. W celu zainicjowania reakcji katalizowanej
przez COX-1, po 6 minutach od dodania enzymu do komory dodawano 20 µl kwasu arachidonowego (AA) o stężeniu
10 mM (stężenie końcowe w komorze 100 µM). Pomiar
zużycia tlenu prowadzony był w temperaturze 37°C.
Wybór buforu do pomiarów
W celu dobrania odpowiedniego środowiska do pomiarów
oksygraficznych, aktywność podjednostki cyklooksygenazowej COX-1 zbadano dla trzech różnych buforów: a) 0.1
M Tris-HCl, 0.5 mM fenol, 1µM hemina, pH 8.1 (bufor A),
b) 0.1 M Tris-HCl, 2 mM fenol, 1 µM hemina, 5 mM EDTA,
pH 8.1 (bufor B) oraz c) 0.1 M Tris-HCl, 1 µM hemina, pH 8.1
(bufor C). Badanie przeprowadzono z wykorzystaniem 200
U enzymu na pomiar. Do zainicjowania reakcji i wywołania
odpowiedzi COX-1 użyto roztworu kwasu arachidonowego
w DMSO (w stężeniu 100 mM), który następnie rozcieńczano 10-krotnie przed pomiarem. W tym celu również zastosowano odpowiedni bufor (bufor A, B lub C).
Sposób przygotowania kwasu arachidonowego
W celu dostosowania najwłaściwszego rozpuszczalnika dla
substratu reakcji (kwasu arachidonowego) oraz optymalnej
procedury przygotowania roztworu AA, przetestowano następujące warianty a) kwas arachidonowy o stężeniu 10 mM,
rozpuszczony w wodzie (AA/H2O), b) kwas arachidonowy
o stężeniu 10 mM, rozpuszczony w DMSO (AA/DMSO),
c) kwas arachidonowy rozpuszczony w DMSO (w stężeniu
100 mM), a następnie rozcieńczany 10-krotnie przed pomiarem w buforze A (0.1 M Tris-HCl, 0.5 mM fenol, 1 µM hemina, pH 8.1) do końcowego stężenia 10 mM (AA/DMSO/
bufor A). Do każdego pomiaru wykorzystano 200 jednostek
(U) COX-1 na komorę (na pomiar). Jedna jednostka enzymatyczna aktywności została zdefiniowana przez producenta, jako ilość enzymu, która katalizuje zużycie 1 nmola tlenu
na minutę w polarografie Gilson Model 5/6 w 37°C. Kontrolę
dla danego rozpuszczalnika stanowiły pomiary w próbach
nie zawierających enzymu, do których dodawano kwas arachidonowy rozpuszczony w odpowiedni sposób.
Dobór stężenia kwasu arachidonowego
W celu oceny znaczenia stopnia wysycenia podjednostki cyklooksygenazowej COX-1 jej substratem, kwasem arachidonowym, przetestowano szybkość zużywania tlenu dla dwóch
stężeń AA, 100 i 200 µM. Zastosowano kwas arachidonowy
rozpuszczony w DMSO w stężeniu 100 mM lub 200 mM rozcieńczany 10-krotnie tuż przed pomiarem w buforze A (0.1 M
Tris-HCl, 0.5 mM fenol, 1µM hemina, pH 8.1). Badanie przeprowadzono z wykorzystaniem 200 U enzymu/komorę. Kontrolę dla danego stężenia kwasu arachidonowego stanowiły
pomiary w próbach nie zawierających enzymu, do których
dodawano kwas arachidonowy w odpowiednim stężeniu.
Dobór czasu preinkubacji enzymu
W celu określenia czasu niezbędnego do osiągnięcia maksymalnej aktywności COX-1 zbadano zużycie tlenu przez
COX-1 w temperaturze 37° po preinkubacji enzymu w komorze oksygraficznej przez 3, 6, 9, 12 minut przed dodaniem
AA. Komora pomiarowa była wypełniona buforem o składzie
0.1 M Tris-HCl, 0.5 mM fenol, 1 µM hemina, pH 8.1 (bufor A).
Badanie przeprowadzono z wykorzystaniem 200 U enzymu
na pomiar. Do wywołania odpowiedzi COX-1 użyto roztworu kwasu arachidonowego w DMSO (w stężeniu 100 mM),
155
Badanie aktywności podjednostki cyklooksygenazowej i podjednostki peroksydazowej cyklooksygenazy 1 (COX-1) ...
który następnie rozcieńczano 10-krotnie przed pomiarem
w wyżej wymienionym buforze.
Dobranie optymalnej aktywności enzymu w próbie
W celu wyboru optymalnej aktywności enzymu w próbie do
badania zmian aktywności COX-1 pod wpływem różnych
czynników badano zużycie tlenu w próbach zawierających
50, 100 lub 200 U COX-1 w komorze pomiarowej. Badania
wykonano wykorzystując bufor A (0.1 M Tris-HCl, 0.5 mM
fenol, 1 µM hemina, pH 8.1) oraz roztworu kwasu arachidonowego w DMSO (o stężeniu 100 mM), który następnie
rozcieńczano 10-krotnie tuż przed pomiarem w tym samym
buforze.
Kontrola działania metody
W celu sprawdzenia metody przebadano hamowanie aktywności enzymu przez 100 µM indometacynę – inhibitor
cyklooksygenazowaj podjednostki COX-1. W tym celu użyto roztwór wyjściowy 100 mM indometacyny zawieszonej
w DMSO, rozcieńczanej przed pomiarem 10-krotnie buforem
A (0.1 M Tris-HCl, 0.5 mM fenol, 1 µM hemina, pH 8.1). Do
komory zawierającej 2 ml buforu A dodawano 20 µl porcje
indometacyny po 1 minucie od dodania enzymu do komory,
a następnie próbę inkubowano przez kolejne 5 minut. Po
tym czasie do komory pomiarowej dodawano roztwór kwasu
arachidonowego, przyrządzony w DMSO (w stężeniu 100
mM) i rozcieńczany 10-krotnie tuż przed pomiarem w buforze do pomiarów aktywności COX-1.
Opracowanie metody fluorescencyjnego pomiaru aktywności COX-1
Aktywność podjednostki peroksydazowej zbadano za pomocą gotowego zestawu COX Fluorescent Activity Assay Kit.
Oznaczanie aktywności peroksydazowej tą metodą opiera
się na pomiarze fluorescencji rezorufiny powstałej na skutek
reakcji PGG2, powstałej w wyniku utlenienia i cyklizacji kwasu
arachidonowego, z 10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyną
(ADHP). Pomiar przeprowadzono na czytniku do płytek
VICTOR X4 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, USA) w warunkach wzbudzenia przy 530-540 nm
i detekcji przy 585-595 nm.
Tło dla niespecyficznego świecenia odczynników stanowiła próba bez kwasu arachidonowego. Dodatkową kontrolę
reakcji kwasu arachidonowego z odczynnikami stanowiła
próba bez enzymu. Aktywność enzymu oceniano na podstawie różnicy wartości fluorescencji pomiędzy próbami właściwymi zawierającymi enzym a kontrolami bez enzymu po
odjęciu wartości tła. Stopień inhibicji COX-1 przez inhibitor
podjednostki peroksydazowej, SC-560, wyrażono jako proporcję wartości prób z inhibitorem i bez inhibitora. Pomiaru
fluorescencji dokonywano co 3 minuty od momentu dodania
kwasu arachidonowego w ciągu 25 minut.
Wybór optymalnej aktywności enzymu COX-1 do oznaczenia
aktywności domeny peroksydazowej metodą fluorescencyjną
156
W celu określenia minimalnej ilości COX-1 w próbie, która
dawałaby wartości mierzalne w warunkach pomiaru i która
odstawałaby wyraźnie od wartości tła, zbadano kinetykę reakcji dla następujących stężeń enzymu: 10000, 5000, 2500,
1000, 100, 50, 25 oraz 10 U/ml. Enzym nie był preinkubowany przed pomiarem. Na podstawie otrzymanych krzywych
zależności fluorescencji od czasu pomiaru (od momentu dodania kwasu arachidonowego) dokonano wyboru optymalnej ilości enzymu w próbie, która może być wykorzystana do
badania wpływu różnych czynników na aktywność COX-1.
Wybór temperatury preinkubacji enzymu COX-1 do oznaczenia aktywności domeny peroksydazowej metodą fluorescencyjną
Aktywność enzymu COX-1 oznaczano po 10-minutowej preinkubacji w temp. 4°C (warunki najwyższej aktywności enzymatycznej COX-1, zgodnie ze specyfikacją producenta),
25°C (warunki „normalne” otoczenia) oraz 37°C (warunki
fizjologiczne). W tych samych warunkach oznaczono wpływ
5-(4-chlorofenylo)-1-(4-metoksyfenylo)-3-(trifluorometylo)1H-pirazolu (SC-560) - selektywnego inhibitora jednostki peroksydazowej COX-1. Na podstawie uzyskanych wyników
wybrano optymalne warunki pomiaru aktywności, zarówno
samego COX-1, jak i enzymu preinkubowanego z wybranym
inhibitorem.
Analiza statystyczna
Analizę rozkładu normalności przeprowadzono z użyciem
testu Shapiro–Wilka. Jednorodność wariancji sprawdzano testem Levenea. Dane posiadające rozkład normalny
nie wykazujące homogenności wariancji analizowane były
z użyciem testu nieparametrycznego Kruskala-Wallisa
a następnie nieparametrycznego testu post-hoc ConoveraInmana. Wszystkie obliczenia statystyczne wykonane były
z wykorzystaniem programów Statistica (StatSoft) oraz
StatsDirect (StatsDirect Limited).
Wyniki
Metoda oksygraficzna
Wybór buforu do pomiarów
Przebadano wpływ trzech różnych buforów pomiarowych na
aktywność COX-1. Wykazano, że bufor A o składzie 0.1 M
Tris-HCl, 0.5 mM fenol, 1 µM hemina, pH 8.1, jak i bufor
B (0.1 M Tris-HCl, 2 mM fenol, 1 µM hemina, 5 mM EDTA,
pH 8.1) sprzyjały wysokiemu zużyciu tlenu przez enzym.
W przypadku buforu B wyniki charakteryzowały się jednak większym rozrzutem (Ryc. 2). Bufor C (0.1 M Tris-HCl,
1 µM hemina, pH 8.1) różniący się od buforów A i B jedynie
brakiem fenolu w składzie, nie sprzyjał poprawnemu działaniu COX-1. Pomiary wykonane z jego użyciem wykazały
minimalne zużycie tlenu przez enzym w odpowiedzi na kwas
arachidonowy.
Sposób przygotowania kwasu arachidonowego
Przebadano wpływ trzech różnych sposobów rozpuszczania
powodował zwiększoną konsumpcję tlenu zarówno w obecności, jak i przy braku enzymu w próbie. Najwyższe zużycie
tlenu przez COX-1 następowało po dodaniu AA, który rozpuszczono najpierw w DMSO, a następnie, przed dodaniem
do komory rozcieńczono 10-krotnie buforem A. Ten sposób
przygotowania AA wykazał minimalne zużycie tlenu w próbach nie zawierających enzymu, porównywalne do tego dla
AA rozpuszczonego w wodzie.
Rycina 2
Zużycie tlenu przez podjednostkę cyklooksygenazową COX-1
w zależności od składu zastosowanego buforu. Dane przedstawiono jako mediany (■) i zakresy kwartylowe (dolny kwartyl, 25%
- górny kwartyl, 75%; prostokąty) (n=3). Istotność statystyczną różnic oceniono t nieparametrycznym testem Kruskala-Wallisa oraz testem post-hoc Conovera-Inmana: p< 0.003, bufor C wzgl. bufor A;
p< 0.03, bufor C wzgl. bufor B.
kwasu arachidonowego na jego zdolność do metabolizowania przez COX-1 (Ryc. 3). Kwas arachidonowy rozpuszczony w wodzie wykazał najmniejszą zdolność do „zainicjowania” działania enzymu, jednak nie wykazywał również
wzrostu zużycia tlenu w próbach nie zawierających enzymu,
w przeciwieństwie do AA rozpuszczonego w DMSO, który
Rycina 3
Zużycie tlenu przez podjednostkę cyklooksygenazową COX-1
w zależności od zastosowanego sposobu rozpuszczenia kwasu
arachidonowego. Dane przedstawiono jako mediany (■) i zakresy
kwartylowe (dolny kwartyl, 25% - górny kwartyl, 75%; prostokąty)
(n=4). Istotność statystyczną różnic oceniono nieparametrycznym
testem Kruskala-Wallisa oraz testem post-hoc Conovera-Inmana:
p< 0.0001, kontrola dla AA w DMSO wzgl. kontrola dla AA w wodzie
i wzgl. kontrola w DMSO/buforze A; AA w wodzie wzgl. AA w DMSO/
buforze A; p< 0.004, AA w DMSO wzgl. AA w DMSO/buforze A;
p< 0.04, AA w DMSO wzgl. AA w wodzie.
Dobór stężenia kwasu arachidonowego
Sprawdzono wpływ dwóch stężeń kwasu arachidonowego
(100 µM i 200 µM) na aktywność COX-1. Nie wykazano
wzrostu zużycia tlenu przez enzym w obecności wyższego
stężenia AA (Ryc. 4). Zanotowano jednak nieznaczny wzrost
konsumpcji tlenu przez sam kwas arachidonowy (bez enzymu) dodany do próby w stężeniu 200 µM w porównaniu
z jego niższym stężeniem, 100 µM.
Dobór czasu preinkubacji enzymu
W celu określenia czasu potrzebnego enzymowi do osiągnięcia maksymalnej aktywności w temperaturze 37°C zbadano
zużycie tlenu przez COX-1 po preinkubacji enzymu (przed
dodaniem AA) w komorze oksygraficznej przez 3, 6, 9 lub
12 minut. Zanotowano zużycie tlenu przez enzym odpowiednio na poziomie 213 ± 11, 226 ± 2, 233 ± 6 oraz 240 ± 10
pmol O2/(s*ml) (n=3), nie obserwując różnic w aktywności
enzymu zależnej od czasu jego preinkubacji.
Dobranie optymalnej aktywności enzymu w próbie
Ze względu na duże zużycie enzymu COX-1 do oznaczeń
aktywności metodą oksygraficzną i wiążące się z tym koszty,
dokonano wyboru ilości jednostek enzymu, które zapewniły-
Rycina 4
Zużycie tlenu przez podjednostkę cyklooksygenazową COX-1 w zależności od zastosowanego stężenia kwasu arachidonowego. Dane
przedstawiono jako mediany (■) i zakresy kwartylowe (prostokąty)
(n=3). Istotność statystyczną różnic oceniono nieparametrycznym
testem Kruskala-Wallisa oraz testem post-hoc Conovera-Inmana:
p< 0.05, kontrola dla AA 100 μM wzgl. kontrola dla AA 200 μM; AA
100 μM wzgl. AA 200 μM - nieistotne.
157
Badanie aktywności podjednostki cyklooksygenazowej i podjednostki peroksydazowej cyklooksygenazy 1 (COX-1) ...
by racjonalne gospodarowanie enzymem i umożliwiły wiarygodne pomiary wpływu czynników hamujących aktywność
COX-1. W tym celu porównano zużycie tlenu przez enzym
dodany w ilości 50, 100 i 200 U na próbę (komorę). Wartości
wynosiły odpowiednio 57 ± 5, 128 ± 9 oraz 226 ± 2 pmol O2/
(s*ml), (n=3).
Kontrola działania metody
W celu sprawdzenia działania metody zastosowano inhibitor
COX-1, indometacynę, jako kontrolę pozytywną. Indometacyna w stężeniu końcowym 100 µM zahamowała działanie
cyklooksygenazy w 97.4 ± 1.5% (n=3).
Metoda fluorescencyjnego pomiaru aktywności COX-1
Wybór optymalnej ilości enzymu do oznaczenia aktywności
domeny peroksydazowej metodą fluorescencyjną
Ze względu na duże zużycie enzymu do oznaczeń aktywności poszczególnych podjednostek COX-1 i wiążące się z tym
koszty, staraliśmy się stworzyć wariant „mikro” oryginalnego testu. Dokonano wyboru minimalnej aktywności enzymu
w próbie, dla której fluorescencja nadal byłaby mierzalna
w warunkach pomiaru i dla której odczytywana wartość fluorescencji pozostawałaby istotnie wyższa od wartości tła.
Tak dobrane stężenie enzymu powinno dawać wartości
fluorescencji istotnie i liniowo wyższe od stężenia niższego
w szeregu rozcieńczeń oraz fluorescencja taka powinna
wzrastać w czasie zachodzenia reakcji enzymatycznej.
Wykazano, iż minimalne stężenie enzymu, przy której zauważalny jest wzrost fluorescencji w czasie pomiaru wynosi
1000 U/ml (Ryc. 5). Nie wykazano takich różnic we fluorescencji dla niższych testowanych stężeń enzymu, tj. 100, 50, 25
oraz 10 U/ml. Stwierdzono natomiast wyraźny wzrost fluorescencji dla enzymu testowanego w stężeniu powyżej 1000 U/
ml, charakteryzujący się szybkim narastaniem krzywej kinetycznej w początkowej fazie i stopniowym osiąganiem plateau
w dalszym etapie reakcji, wynikającym z zużycia substratu lub destabilizacji enzymu. Jednocześnie, zanotowano
wyraźne różnice w obserwowanej fluorescencji pomiędzy
stężeniami enzymu powyżej 1000 U/ml. Otrzymane wyniki
wskazują na zasadność doboru odpowiedniego stężenia
COX-1 w zależności od podejmowanej tematyki badań, potrzeb eksperymentalnych czy aspektów ekonomicznych.
Wybór temperatury preinkubacji COX-1 przed oznaczeniami
aktywności domeny peroksydazowej metodą fluorescencyjną
Uzyskane wyniki wskazują, że temperatura 10-minutowej
preinkubacji enzymu nie wpływa na jego aktywność katalityczną (Ryc. 6). Wykazano zbliżoną aktywność enzymu
zarówno dla temperatury preinkubacji 4°C (w której enzym,
zgodnie z danymi producenta, powinien być przechowywany przed oznaczeniami aktywności), dla temperatury pokojowej (25°C) oraz dla warunków odzwierciedlających środowisko fizjologiczne (37°C). Dodatkowo, uzyskano znacznie
wyższą fluorescencję dla enzymu poddanego preinkubacji
w każdej z wyżej wymienionych temperatur niż dla enzymu
nieinkubowanego (oznaczenie aktywności natychmiast po
rozmrożeniu z -70°C), co wskazuje na konieczność odpowiedniego przygotowania enzymu przed oznaczeniem jego
aktywności. Określenie i porównanie wpływu różnych temperatur preinkubacji na kinetykę oddziaływań enzym-inhibitor
wskazuje, iż dla wszystkich zastosowanych w oznaczeniu
temperatur SC-560 - selektywny inhibitor COX-1 hamuje
aktywność enzymu w ponad 80%, przy czym najsilniej dla
enzymu inkubowanego z inhibitorem w temp. 37°C, słabiej
dla temperatury 25°C i 4°C, i najsłabiej dla enzymu nie preinkubowanego (Ryc. 7).
Rycina 5
Wpływ stężenia enzymu na kinetykę reakcji katalizowanej przez peroksydazową podjednostkę COX-1. (a) Zmiany fluorescencji produktu
reakcji, rezorufiny, w czasie 25 min. od dodania kwasu arachidonowego. Krzywe opisują średnie wartości pomiarów zebrane w interwałach
3-minutowych (n=3). Oś rzędnych przedstawiono w skali logarytmicznej. Istotność różnic w czasie oceniano na podstawie współczynników
kierunkowych zlinearyzowanych krzywych regresji. (b) Przyrosty fluorescencji/min obliczono dla czasu 25 min ([F25.min-F1.min]/24). Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, n=3. Istotność statystyczną różnić oceniano nieparametrycznym testem Kruskala-Wallisa oraz testem post-hoc
Conovera-Inmana: (a) p< 0.0001 dla 1000 U/ml i 2500 U/ml; p< 0.005 dla 1000 U/ml; p< 0.001 dla 10000 U/ml. (b) p< 0.001, 10-100 U/ml
wzgl. 2500-10000 U/ml.
158
Rycina 6
Wpływ temperatury preinkubacji enzymu na kinetykę reakcji katalizowanej przez peroksydazową podjednostkę COX-1. (a) Zmiany fluorescencji produktu reakcji, rezorufiny, w czasie 25 min od dodania kwasu arachidonowego. Krzywe opisują średnie wartości pomiarów zebrane
w interwałach 3-minutowych (n=3). Istotność różnic w czasie oceniano na podstawie współczynników kierunkowych zlinearyzowanych krzywych regresji: p< 0.001 dla wszystkich wariantów inkubacji. (b) Przyrosty fluorescencji/min obliczone dla czasu 25 min ([F25.min-F1.min]/24). Dane
przedstawiono jako średnie ± SEM, n=3. Istotność statystyczną różnić oceniano nieparametrycznym testem Kruskala-Wallisa oraz testem
post-hoc Conovera-Inmana: nie wykazano istotnych różnic między wariantami inkubacji.
Dyskusja
Opisywane w literaturze procedury oznaczania aktywności
poszczególnych podjednostek COX-1 charakteryzują się
różnorodnością warunków pomiaru, szczególnie dotyczy to
temperatury pomiaru, stosowanego stężenia enzymu, czy
ewentualnej preinkubacji enzymu. Brak typowych publikacji
metodologicznych dotyczących tego enzymu, jak również
nieprecyzyjnie zestawione instrukcje załączone do komercyjnych zestawów do oznaczania aktywności COX-1, nie ułatwiają dobrania odpowiednich warunków pomiarowych przez
badaczy rozpoczynających pomiary aktywności tego enzymu. Użyteczne jest zatem sprecyzowanie warunków oznaczania aktywności poszczególnych podjednostek COX-1.
W przypadku pomiarów oksygraficznych kluczowe jest nie
tylko dobranie odpowiedniego buforu do pomiarów, ale również ważny jest sposób rozpuszczenia substratu dla COX-1,
kwasu arachidonowego. W części metodologicznej publikacji, w których wykorzystano ten sposób pomiaru aktywności
cyklooksygenazowej domeny COX-1, często spotyka się informacje, iż kwas arachidonowy rozpuszczony był w wodzie
lub w DMSO. W niniejszej pracy przebadano wpływ trzech
różnych sposobów rozpuszczenia kwasu arachidonowego
na jego dostępność dla COX-1 oraz zdolność jego wykorzystania. Zarówno substrat rozpuszczony w wodzie, jak
i rozpuszczony w DMSO, wykazały odpowiednio o ok. 60%
i o ok. 50% słabszą zdolność do „aktywacji” enzymu niż substrat rozpuszczony w DMSO i następnie rozcieńczony buforem przed dodaniem do komory pomiarowej. W pierwszym
przypadku mogło to wynikać z pogorszonej rozpuszczalności AA w wodzie, a tym samym ograniczonej dostępności
substratu dla enzymu, w drugim wynikało prawdopodobnie
z niekorzystnego wpływu DMSO na funkcjonowanie enzymu,
pomimo, iż zawartość tego rozpuszczalnika nie przekraczała 1% objętości końcowej w komorze reakcyjnej. Wykorzystanie AA rozpuszczonego w DMSO mogło również sprzyjać artefaktualnie podwyższonej aktywności COX-1, która
w rzeczywistości mogła być wynikiem pochłaniania tlenu
przez DMSO. Najlepszym rozwiązaniem, nie opisanym
w części metodologicznej żadnego znanego autorom artykułu wykorzystującego powyższy sposób pomiaru aktywności COX-1, okazało się przygotowanie zatężonego 100 mM
roztworu AA w DMSO i jego 10-krotnie rozcieńczanie buforem tuż przed dodaniem do komory pomiarowej. Sposób ten
znacznie poprawił dostępność AA dla enzymu minimalizując
jednoczenie skutki działania DMSO na białko oraz na pochłanianie tlenu przez sam rozpuszczalnik. Dalsze badania na
tak przygotowanym AA potwierdziły również, że najczęściej
wykorzystywane w publikacjach stężenie kwasu arachidonowego 100 µM jest wystarczające do wywołania maksymalnej
odpowiedzi COX-1 [8, 9]. Poza kwasem arachidonowym największy wpływ na pomiar aktywności enzymu miał wybrany
bufor. Enzym wykazywał najwyższą aktywność w najczęściej
wykorzystywanym w pracach buforze A (Tris-HCl, fenol, hemina). Bufor B zawierający wyższe stężenie fenolu niż bufor
A oraz dodatkowo EDTA (Tris-HCl, fenol, hemina, EDTA),
wykorzystywany przez firmę produkującą enzym w celu oceny aktywności preparatów, również nie obniżał aktywności
COX-1 monitorowanej w badaniu oksygraficznym. Jednakże
wyniki pomiaru aktywności enzymu nie były równie powtarzalne. Najprostszy w swym składzie bufor C zawierający
jedynie Tris-HCl i heminę, w którym zawieszone jest białko
dostarczane przez producenta, nie nadaje się do pomiarów
z użyciem oksygrafu. Pomiary na nim wykonane wykazały
minimalne zużycie tlenu przez enzym w odpowiedzi na kwas
159
Badanie aktywności podjednostki cyklooksygenazowej i podjednostki peroksydazowej cyklooksygenazy 1 (COX-1) ...
Rycina 7
Wpływ temperatury preinkubacji enzymu na stopień zahamowania aktywności peroksydazowej podjednostki COX-1 przez inhibitor SC-560.
(a) Zmiany stopnia inhibicji COX-1 w czasie 25 min od dodania kwasu arachidonowego. Krzywe opisują średnie wartości inhibicji zanotowane
w interwałach 3-minutowych (n=3). Istotność różnic w czasie oceniano na podstawie współczynników kierunkowych zlinearyzowanych krzywych regresji: p< 0.0001 dla wariantów preinkubacji w temp. 25°C lub 37°C. (b) Zahamowanie aktywności COX-1 i wytwarzania rezorufiny
w 25 minucie pomiaru. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, n=3. Istotność statystyczną różnić oceniano nieparametrycznym testem
Kruskala-Wallisa oraz testem post-hoc Conovera-Inmana: p< 0.001 dla wariantów preinkubacji w temp. 25°C lub 37°C wzgl. enzymu nieinkubowanego; p< 0.02 dla temp. 4°C wzgl. enzymu nieinkubowanego oraz wzgl. temp. 37°C.
arachidonowy. Przyczynę powyższego można upatrywać
w braku fenolu w składzie medium. Pomimo obecności wysokiego stężenia tlenu w komorze pomiarowej, mógł on być
nierównomiernie dostępny dla białka.
Kinetyka reakcji enzymatycznych zależy m.in. od temperatury środowiska, w którym działa enzym. Preinkubacja enzymu przez pewien czas w określonej temperaturze może
wpływać na wzrost lub spadek jego aktywności. W różnych
pracach autorzy podają różne czasy preinkubacji enzymu
w 37°C przed dodaniem substratu, czyli kwasu arachidonowego [9,11], Określenie wpływu czasu inkubacji enzymu
na jego aktywność może być pomocne, gdy chcemy badać
enzym w warunkach jego najwyższej aktywność. Dodatkowo, etap preinkubacji jest niezbędny przy badaniu wpływu różnych substancji na aktywność enzymu, co wymaga
jego inkubacji z badaną substancją przez pewien czas.
W przypadku COX-1 nie odnotowano zmian w aktywności
białka związanych z jego preinkubacją w temperaturze 37°C
w czasie do 12 minut przed dodaniem substratu. Wynik ten
przekonuje, iż możliwa jest krótka inkubacja COX-1 z substancjami wpływającymi na jego aktywność w komorze inkubacyjnej.
W pracach dotyczących pomiaru aktywności COX-1 metodą
polarograficzną bardzo często wykorzystuje się duże stężenia białka [8]. Jak wiadomo, różne preparaty białkowe, nawet
te pochodzące od tego samego producenta, charakteryzują
się odmienną aktywnością enzymu, dlatego też standaryzacja metody powinna raczej dotyczyć aktywności enzymu niż
ilości białka enzymatycznego użytego w badaniu. Zatem, dobranie optymalnej, ekonomicznie uzasadnionej ilości enzymu do badania jest niezwykle istotnym problemem. Zużycie
tlenu, zarówno przez 50 U/ml, jak i przez 100 U/ml enzymu,
pozwala na zastosowanie tych stężeń w pracach nad inhibi160
torami aktywności COX-1. Zastosowanie mniejszych stężeń
enzymu (np. 25 U/ml) najprawdopodobniej nie pozwoliłby na
zauważenie niewielkich, rozróżnialnych zmian aktywności.
Kontrolą dla powyższych ustawień metody było sprawdzenie możliwości rejestracji zmian w aktywności COX-1 pod
wpływem wybranego inhibitora – indometacyny. Zaobserwowano niemal całkowity spadek aktywność enzymu pod
wpływem działania tego związku. Potwierdziło to, iż dobranie optymalnego rodzaju buforu, stężenia enzymu i substratu, oraz sposobu przygotowania substratu, pozwala na wiarygodne monitorowanie działania substancji obniżających
aktywność enzymu.
Obecne doniesienia naukowe dotyczące badań podjednostki
peroksydazowej wykorzystują, opisywaną w niniejszej pracy,
bezpośrednią metodę fluorescencyjną do badań aktywności
COX-1 w różnym materiale biologicznym [12]. Inne metody oznaczenia aktywności domeny peroksydazowej COX-1
to metody pośrednie opierające się na pomiarze produktów
końcowych aktywności całego enzymu, tj. stężenia TXB2
[13], PGE2 [14] czy 6-keto-PGF1α [15]. Zaletą powyższych
metod pośrednich jest prosty i zdefiniowany protokół, nierzadko dostosowany komercyjnie do potrzeb badacza. Niemniej jednak, metody całościowe nie dają pełnej informacji
o funkcjonowaniu cyklooksygenazowej lub peroksydazowej
podjednostki enzymu. W przypadku badań wpływu różnych
naturalnych lub syntetycznych związków na aktywność peroksydazową COX-1, niezbędne wydaje się poznanie optymalnych warunków funkcjonowania enzymu, co zapewni
powtarzalność uzyskiwanych danych i wyeliminuje przypadkową detekcję artefaktualnej aktywności enzymu [16].
W pierwszej kolejności, istotne jest wskazanie odpowiedniego stężenia enzymu, pozwalające obserwować oczekiwane
zmiany bez konieczności wykorzystania całego dostępnego
materiału. Brak wyraźnych doniesień na ten temat przyczynił
się do sprawdzenia w niniejszej pracy optymalnego stężenia
enzymu, pozwalającego mierzyć aktywność peroksydazowej podjednostki preparatu COX-1. Wykazano, iż dla stężenia COX-1 poniżej 100 U/ml różnice pomiędzy aktywnością enzymu nie były wyraźne, co w znaczniej mierze może
ograniczyć monitorowanie spadku lub wzrostu aktywności
enzymu w obecności różnych związków modyfikujących.
Dla stężeń enzymu powyżej 1000 U/ml zaobserwowano wyraźny wzrost zużycia substratu fluorescencyjnego, a różnice
w aktywności COX-1 pomiędzy wysokimi stężeniami enzymu
były znaczące. Otrzymane wyniki pozwalają dobrać stężenie
enzymu zgodnie z oczekiwanym wynikiem oraz eliminują zużycie nadmiernej ilości enzymu, gdy jest to bezzasadne.
Biorąc pod uwagę sugestie producenta COX-1 na temat
wysokiej niestabilności enzymu w warunkach temperatury
pokojowej, niezwykle istotnym parametrem decydującym
o stabilności COX-1 wydaje się być temperatura, w której
badanie przeprowadzamy. Sprawdzono aktywność enzymu
po 10-minutowej inkubacji dla trzech opcji temperaturowych:
4°C, 25°C oraz 37°C. Czas inkubacji dobrano na podstawie
badań Smitha i Zhanga [17]. Nie stwierdzono, by temperatura preinkubacji COX-1 wpłynęła w sposób istotny na aktywność enzymu, niemniej enzym preinkubowany w każdej
z powyższych temperatur wykazywał wyższe zużycie substratu niż enzym przechowywany w -70°C i nieinkubowany
przed pomiarami. Może to sugerować, iż powyżej 0°C enzym
przyjmuje najprawdopodobniej odpowiednią konformację
niezbędną do jego katalitycznej aktywności. Brak istotnych
różnic w aktywności enzymu dla zastosowanego zakresu temperatur świadczy o zachowaniu stabilności enzymu
w badanych warunkach. W świetle braku doniesień na temat
warunków inkubacji, obserwacja ta może stanowić znaczne
ułatwienie dla badacza w przypadku oznaczeń wpływu różnych związków modyfikujących, wymagających odmiennych
temperatur inkubacji. Przykładem takiego związku modyfikującego może być zastosowany selektywny inhibitor COX1, SC-560 [18], dla którego nie sprecyzowano optymalnych
warunków funkcjonowania. W niniejszej pracy sprawdzono
stopień inhibicji COX-1 po 10-minutowej inkubacji enzymu
z SC-560 w trzech temperaturach: 4°C, 25°C oraz 37°C. Zaobserwowano, iż SC-560 hamuje wyraźnie aktywność enzymu po preinkubacji w każdej z zastosowanych temperatur,
przy czym najsilniej dla enzymu inkubowanego z inhibitorem w temp. 37°C i najsłabiej dla enzymu nieinkubowanego.
Uzyskane wyniki wskazują, iż dobór temperatury przy oznaczaniu aktywności COX-1 pod wpływem SC-560 może być
dowolny w powyższym zakresie, niemniej jednak, w literaturze sugerowany jest dobór warunków fizjologicznych.
Wnioski
Wyniki zawarte w niniejszej pracy pozwoliły na krytyczną
walidację metod oznaczania aktywności cyklooksygenazowej i peroksydazowej podjednostki COX-1. Wykazano, iż
aktywność enzymu, temperatura i czas preinkubacji COX-
1, stężenie kwasu arachidonowego, czy rodzaj buforu to
czynniki warunkujące prawidłowe oznaczenie aktywności
COX-1. Ich nieuwzględnienie w planowaniu badań może
niekiedy skutkować generowaniem artefaktów i błędnych
wyników. Aktywność COX-1 należy rozpatrywać pod kątem
aktywności poszczególnych domen enzymu, co też uczyniono w prezentowanej pracy. Przedstawione kompleksowe
badanie domeny peroksydazowej oraz cyklooksygenazowej
pozwoliło ustalić warunki funkcjonowania całego enzymu.
Opracowane procedury i zebrane wyniki zwróciły jednocześnie uwagę na krytyczne elementy związane z pomiarem
oksygraficznym aktywności COX-1. Jak pokazały niniejsze
badania, w przypadku metody fluorescencyjnej, pomimo
dostępności gotowych kitów, brak precyzyjnych protokołów
wymaga uwzględnienia i sprawdzenia wielu dodatkowych
czynników w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Wskazówki metodyczne zawarte w pracy mogą pomóc innym badaczom w ustaleniu własnych wariantów metody związanej
z monitorowaniem aktywności COX-1.
Piśmiennictwo
1. Van D, Beerthuis RK, Nugteren DH, et al. The biosynthesis of
prostaglandins. Biochim Biophys Acta 1964; 90: 204-207.
2. Bergstrom S, Danielsson H, Samuelsson B. The enzymatic formation of prostaglandin E2 from arachidonic acid: prostaglandins and related factors 32. Biochim Biophys Acta 1964; 90:
207-210.
3. Hamberg M, Samuelsson B. Detection and isolation of an endoperoxide intermediate in prostaglandin biosynthesis. Proc
Natl Acad Sci USA 1973; 70: 899-903.
4. Van der Ouderaa FJ, Buytenhek M, Nugteren DH, et al. Purification and characterization of prostaglandin endoperoxide
synthetase from sheep vasicular glands. Biochim Biophys Acta
1977; 487: 315-331
5. Rouzer CA, Marnett LJ. Mechanism of free radical oxygenation
of polyunsaturated fatty acids by cyclooxygenases. Chem Rev
2003; 103: 2239-2304.
6. Simmons DL, Botting RM, Hla T. Cyclooxygenase Isozymes:
The Biology of Prostaglandin Synthesis and Inhibition. Pharmacol Rev 2004; 56: 387-437.
7. Markey CM, Alward A, Weller PE, et al. Quantative studies of
hydroperoxide reduction by prostaglandin H synthase. Reducing substrate specificity and relationship of peroxidase to cyclooxygenase activities. J Biol Chem 1987; 262: 6266-6279.
8. Walker MC, Kurumbail RG, Kiefer JR, at al. A three-step kinetic
mechanism for selective inhibition of cyclo-oxygenase-2 by diarylheterocyclic inhibitors. Biochem J 2001; 357: 709-718.
9. Rudra-Ganguly N, Reddy ST, Korge P, et al. Diesel exhaust
particle extracts and associated polycyclic aromatic hydrocarbons inhibit cox-2-dependent prostaglandin synthesis in murine
macrophages and fibroblasts. J Biol Chem 2002; 277: 3925939265.
10. Walker MC, Gierse JK. In vitro assays for cyclooxygenase activity and inhibitor characterization. In: Ayoub SS, Flower RJ,
Seed M, eds. Cyclooxygenases. Methods and protocols. Humana Press, London, 2010.
11. Wu C-M, Wu S-C, Chung W-J, et al. Antiplatelet effect and selective binding to cyclooxygenase (COX) by molecular docking
analysis of flavonoids and lignans. Int J Mol Sci 2007; 8: 830841.
12. Dai M, Shi X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear
blood flow. PLoS One 2011; 6: e20652
13. Gendron ME, Thorin E. A change in the redox environment and
161
Badanie aktywności podjednostki cyklooksygenazowej i podjednostki peroksydazowej cyklooksygenazy 1 (COX-1) ...
thromboxane A2 production precede endothelial dysfunction in
mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 293: H2508-2515.
Anrather J, Gallo EF Kawano T et al. Purinergic signaling induces cyclooxygenase-1-dependent prostanoid synthesis in
microglia: roles in the outcome of excitotoxic brain injury. PLoS
One 2011; 6: e25916.
14. Anrather J, Gallo EF, Kawano T, et al. Purinergic signaling induces cyclooxygenase-1-dependent prostanoid synthesis in
microglia: roles in the outcome of excitotoxic brain injury. PLoS
One 2011; 6: 25916.
15. Guo Q, Chang S, Diekman L, et al. Comparison of prostaglandin H synthase isoform structures using limited proteolytic digestion. Arch Biochem Biophys 1997; 344: 150-158.
16. Vanhorn J, Altenburg JD, Harvey KA, et al. Attenuation of niacininduced prostaglandin D(2) generation by omega-3 fatty acids in
THP-1 macrophages and Langerhans dendritic cells. J Inflamm
Res 2012; 5: 37-50.
17. Smith CJ, Zhang Y. Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 133138.
18. Perrone MG, Scilimati A, Simone L, et al. Selective COX-1 inhibition: A therapeutic target to be reconsidered. Curr Med Chem
2010; 17: 3769-3805.
Zaakceptowano do publikacji: 30.05.2012
Adres do korespondencji:
prof. dr hab. Cezary Watała
Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi
Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Centralny Szpital Weteranów
90-549, Łódź, ul. Żeromskiego 113
tel. 426393471, faks. 426787567
e-mail: [email protected]
162