Laboratorium 12

Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
ĆWICZENIE 12
OCENA TOKSYCZNOŚCI ZANIECZYSZCZEŃ WODY I GLEBY
METODAMI BIOLOGICZNYMI
/Opiekun merytoryczny: dr hab. Teodora M. Traczewska, prof. nadzw. PWr
modyfikacja: dr inż. Agnieszka Trusz-Zdybek i mgr inż. Maciej Bełcik/
1.
Zagadnienia szczegółowe:
ryzyko środowiskowe; narażenie środowiskowe; ksenobiotyki; toksyczność; toksyczność
ostra i chroniczna; LC; NOEC; LOEC; EC; IC; działanie ogólnoustrojowe i chroniczne;
rodzaje działania ksenobiotyków; wchłanianie i wewnątrzustrojowe przemiany
ksenobiotyków; biologiczne działanie zanieczyszczeń pyłowych, gazowych, metali
ciężkich; pierwiastków radioaktywnych i związków organicznych; toksyczne metabolity
wewnątrzustrojowe; definicja biotestu; podział biotestów na letalne i fizjologiczne;
warunki jakim powinien odpowiadać organizm testowy; testy krótko- i długoterminowe
2.
Literatura zalecana
 Traczewska T.M. Biologiczne metody oceny skażenia środowiska. Oficyna
Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2011, Strony: 27-38, 70-72
 Pawlaczyk-Szpilowa M. Biologia i ekologia. Oficyna Wydawnicza Politechniki
Wrocławskiej, Wrocław 1997, Strony: 351-374
 Łebkowska M., Załęska-Radziwiłł M., Słomczyńska B. Toksykologia środowiska.
Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 1999, Strony: 6-9
3.
Załączniki
Obliczanie LC50 metodą Reeda.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
Zad. 1: Szybki test określający toksyczność związku rozpuszczonego w wodzie wobec
bakterii Pseudomonas fluorescens
Wykonanie:
Na podłożu mineralnym z dodatkiem glukozy posiać dywanowo/powierzchniowo
bakterie Pseudomonas fluorescens (tzn. pobrać sterylną końcówką pipety
automatycznej 0,1 cm3 zawiesiny bakteryjnej i umieścić na powierzchni podłoża,
następnie sterylną głaszczką, ostrożnie i dokładnie rozprowadzić zawiesinę po
powierzchni pożywki stałej)
UWAGA: wykonanie alternatywne:
Wprowadzić na podłoże mineralne z glukozą 1 cm3 zawiesiny bakterii Pseudomonas
fluorescens, delikatnie przechylać szalkę Petriego, tak aby równomiernie
rozprowadzić zawiesinę po całej powierzchni. Następnie nadmiar ściągnąć sterylną
końcówką przy pomocy pipety automatycznej.
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Szalkę Petriego od spodu dna podzielić (pisząc markerem do szkła) na cztery części,
jedną pozostawić na kontrolę, pozostałe trzy opisać zgodnie z zastosowanymi w
zadaniu stężeniami substancji toksycznej wskazanej przez prowadzącego.
Na każdej ćwiartce położyć sterylny krążek bibułowy zamoczony wcześniej w
roztworze związku toksycznego zgodnie z opisem na szalce Petriego, w przypadku
kontroli krążek zamoczyć w sterylnym roztworze fizjologicznym.
Płytki inkubować przynajmniej 48 godzin w temperaturze 26oC, a po inkubacji
odczytać wyniki w postaci strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka,
świadczący o toksycznym wpływie badanego związku.
Wyjaśnić przyczynę wystąpienia strefy zahamowania wzrostu wzorcowej bakterii
Zad. 2: Test określający toksyczność ostrą na larwach ochotek
Wykonanie:
Do zadania użyć rozcieńczeń związków toksycznych wskazanych przez
prowadzącego.
Przygotować szkło w dwóch powtórzeniach dla kontroli i dla każdego z badanych
rozcieńczń wszystkich związków (podpisać odpowiednio). Na przygotowane szkło
wprowadzić po 10 cm3 badanych roztworów, w przypadku kontroli zastosować
roztwór fizjologiczny. Odliczyć po 5 larw ochotek (możliwie porównywalnych
wielkościowo i kondycyjnie – ruchliwość) i przenieść kroplomierzem z hodowli
matecznej do kontroli i przygotowanych rozcieńczeń.
Po 20, 40 i 60 minutach policzyć organizmy padłe (brak ruchu nawet po
zastosowaniu bodźca mechanicznego np. trącenia bagietką).
Wyniki uzyskane dla wszystkich badanych związków i ich rozcieńczeń porównać z
kontrolą i zestawić w tabeli do obliczenia LC50 metodą Reeda (załącznik do
instrukcji). Wyznaczyć LC50 dla każdego z czasów.
Zad. 3: Test określający toksyczność chroniczną
a) z wykorzystaniem glonów
Wykonanie:
Do zadania użyć rozcieńczeń związków toksycznych wskazanych przez
prowadzącego.
Opisać probówki dla kontroli i każdego badanego rozcieńczenia. Do probówek
wprowadzić po 10 cm3 badanych roztworów, w przypadku kontroli zastosować
roztwór fizjologiczny. Do każdej z probówek wprowadzić 0,5 cm3 zawiesiny glonów
i inkubować 7 dni w temperaturze pokojowej z dostępem do światła.
Po czasie inkubacji odczytać wyniki poprzez wizualne sprawdzenie intensywności
zielonego zabarwienia roztworu (co świadczy o rozwoju glonów) w porównaniu do
kontroli.
b) z wykorzystaniem rzęsy Lemna minor
Wykonanie:
Do zadania użyć rozcieńczeń związków toksycznych wskazanych przez
prowadzącego.
Przygotować 6 dołkową płytkę
podpisując dołki dla kontroli i każdego
rozcieńczenia (najmniejsze stężenie w jednym powtórzeniu, dwa kolejne w dwóch
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
powtórzeniach). Do odpowiednich dołków wprowadzić po 10-20 cm3 badanych
roztworów, w przypadku kontroli zastosować roztwór fizjologiczny. Odliczyć po 5
roślinek Lemna minor (możliwie porównywalnych wielkościowo i stanem
fizjologicznym np. intensywnością zabarwienia liści) i przenieść do dołków z płytki
zawierającymi badane roztwory.
Hodowle umieścić na przynajmniej 7 dni w temperaturze pokojowej z dostępem do
światła. Po tym czasie odczytać wyniki poprzez obserwację zmian morfologicznych
roślin np. wielkość i kształt liści, ich barwa (chloroza), długość korzonków.
Zad. 4: Test określający toksyczność chroniczną z wykorzystaniem dżdżownic - pokaz
Wykonanie:
Do czterech zamykanych pojemników wprowadzono po 50g gleby. Jeden pojemnik z
glebą stanowi kontrolę, do której wprowadzono 2 cm3 roztworu fizjologicznego
podczas gdy do pozostałych trzech wprowadzono po 2 cm3 badanych roztworów
związków toksycznych w różnych stężeniach.
Do każdego pojemnika z glebą wprowadzono po 5 dżdżownic (możliwie
porównywalnych wielkościowo i stanem ruchliwości) i zamknięto je wieczkiem tak,
aby organizmy testowe nie miały możliwości wydostania się.
Próby inkubowano 7 dni w ciemności w temperaturze pokojowej.
Wyniki odczytać poprzez sprawdzenie ilości żywych organizmów testowych oraz ich
stanu fizjologicznego (np. reakcja na bodźce mechaniczne).