Jacek Olender, Ma gorzata Stachowicz, Justyna Szota, Pawe
Transkrypt
Jacek Olender, Ma gorzata Stachowicz, Justyna Szota, Pawe
&ARMACEUTYCZNY0RZEGLD.AUKOWY %.$/4%,).!*!+/#%,4%2!0%549#:.9 72!+5*%,)4!'25"%'/ *ACEK/LENDER -AGORZATA3TACHOWICZ *USTYNA3ZOTA 0AWE.OGAJ %WA.OGAJ 0RZEMYSAW"ESSER 5RSZULA-AZUREK +ATEDRAI:AKAD"IOLOGII-OLEKULARNEJgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY :AKAD!NALIZY)NSTRUMENTALNEJ+ATEDRA!NALIZY)NSTRUMENTALNEJgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY +ATEDRAI:AKAD4OKSYKOLOGIIgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY .:/:0OLIKLINIKA$OKTORA"ESSERA Streszczenie Rodzina endotelin składa się z trzech zbliżonych budową do siebie peptydów: endoteliny 1-3 (EDN 1-3), kodowanych przez trzy różne geny, wykazujące różne powinowactwo do receptorów EDNRA – aktywujące kaskady prowadząc do proliferacji, indukcji angiogenezy i i inwazji nowotworu oraz EDNRB, którego aktywacja prowadzi do apoptozy komórek nowotworowych. Celem przedstawionej pracy było porównanie aktywności transkrypcyjnej genów, które kodują endoteliny1-3, jej receptory oraz ocenę, który z analizowanych genów może stanowić cel terapeutyczny w raku jelita grubego. Materiałem do badań były wycinki jelita grubego ocenione na podstawie badania histopatologicznego jako prawidłowe oraz wycinki zmienione nowotworowo w stadium zaawansowania klinicznego1-4 i stopniu złośliwości histopatologicznej G2. Profil ekspresji genów wyznaczano techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HGU 133A (Affymetrix) Otrzymane wyniki wskazują, 3- krotny wzrost ekspresji genu kodującego receptor dla endoteliny typu A, oraz ok. 4 razy wyciszenie aktywności transkrypcyjnej genu endoteliny 3 w wycinkach raka jelita grubego w porównaniu do tkanki prawidłowej. Słowa kluczowe: EDN1, EDN2, EDN3, , EDNRA, EDNRB, rak jelita grubego '|ª-J®RylR Endoteliny (EDN) są to trzy zbliżone do siebie budową peptydy, kodowane przez trzy różne geny, wykazujące różne powinowactwo do swoich receptorów. /1, 2, 3/ Należą do peptydów powodujących skurcz naczyń krwionośnych, uczestniczących w modulacji mitogenezy, angiogenezy, apoptozy, inwazji miejscowej raka oraz w przerzutach nowotworu /4/. Badania lat dziewięćdziesiątych wykazały obecność podwyższonych poziomów endotelin w rakach w tym także w raku jelita grubego. Odkryto, że komórki raka jelita grubego produkują i wydzielają endotelinę (EDN-1). Potwierdzenie uzyskano wykazując wyższą aktywność proliferacyjną endoteliny-1 w hodowlach komórek nowo- Summary The family of endothelin consists of three peptides which structures are similar. Endothelin – 1 (ET-1), ET-2, ET-3 are coded by three different genes which have different relationship to EDNRA and EDNRB receptors. ET–1, ET-2 and ET-3 activate cellular signaling cascades leading to proliferation, apoptosis and cancer invasion via EDNRA receptor. The activation of EDNRB leads to apoptosis of cancer cells. The aim of the study was to compare the transcription activity of genes coding ET–1, ET-2, ET-3, EDNRA, EDNRB. It was analyzed which from investigated genes may be a therapeutic factor in colon cancer. Material of researchers was fragments of tumor colonic tissue in clinical stages from 1 to 4 (according to TNM classification). The Histologic Grade was from G1 to G4. There were histologically normal tissues of patients with colon cancer, which were a control in the study. The expression profile of investigated genes assayed with oligonucleotide microarray technique (HG-U133A, Affymetrix). The received results showed threefold increase of EDNRA expression, and fourfold decrease of ET-3 expression in colon cancer tissue compared with normal tissue. Key words: EDN1, EDN2, EDN3, , EDNRA, EDNRB, colon cancer tworowych /5, 6/. Plejotropowość endotelin związana jest z aktywacją różnych kaskad sygnałowych. Aktywacja receptora EDNR A mającego kilkunastokrotnie większe powinowactwo do EDN-1 niż do EDN-3 najczęściej jest łączona ze wzrostem aktywności proliferacyjnej komórek, podczas gdy z apoptozą najczęściej łączona jest aktywacja EDNRB nie wykazującego zróżnicowanego powinowactwa do entotelin /3/. -p-J¬¬ay-t|ªRlyJ¥p|ª-yR ®R®RyJ| Rqly¬ Receptory endotelin należą do nadrodziny receptorów związanych z białkiem G. Połączenie endoteliny z receptorem EDNRA uaktywnia białko Gq które aktywuje fosfo- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. - Rl-t¬luR |J¬ Aktywność transkrypcyjną genów kodujących endoteliny i ich receptory wyznaczano w wycinkach raka jelita grubego i wycinkach jelita prawidłowego, ocenianych na podstawie analizy histopatologicznej. Na pobranie wycinków otrzymano zgodę Komisji Biotycznej Ślaskiej Akademii Medycznej (obecnie Ślaskiego Uniwersytetu Medycznego) w Katowicach. Wycinki tkanek pobierano po uzyskaniu świadomej zgody pacjentów, którzy zapoznani zostali z celem badania. Około 100-150 mg tkanki ucierano w ciekłym azocie, a następnie homogenizowano przy użyciu homogenizatora Polytron® (Kinematyka AG, Szwajcaria) i ekstrahowano całkowity RNA z zastosowaniem odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA) zgodnie z protokołem producenta. Otrzymany ekstrakt trawiono DNazą I i oczyszczano na kolumienkach zestawu RNeasy Mini Kit firmy Qiagen. Ilość i jakość RNA oceniano spektrofotometrycznie przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech) (wynik pomiaru absorbancji równy jest jeden dla RNA o stężeniu 40μg/ml), oraz poprzez analizę ¬Aly- -p-J¬ ¬ay-t|ªR -p ¬ª|ª-yR | |tÔA®Ryl¥ w 1% żelu agarozowym (ryc.2). Profil ekspresji genów RAR |-Jq-RyJ| Rqly¬l®RyJ| RqlyÔG kodujących endoteliny i ich receptory wyznaczano me¤q¥7¡G¥A®R ylA®ÔARªRa¥q-Aol-p ¬ªy|²Al7l|k todą mikromacierzy HGU 133A (Affymetrix), oligonukleotydowych, zgodnie z z zaleceniami Affymetrix q|alA®yRop|u}Rp Gene Expression Analisys Technical Manual. Sygnały lipazę C typu β (PLC β), katalizującą hydrolizę fosfaty- fluorescencji na płytkach odpowiadające 22283 mRNA dyloinozytoli do diacyloglicerolu (DAG) powodującego odczytano w skanerze GeneArray (Agilent). Raporty aktywację kinaz białkowych i trifosforanu inozytolu analiz wygenerowano w programie Affymetrix Data Mi(IP3) powodującego otwarcie kanałów wapniowych. ning Tool. Analizę absolutną i porównawczą wykonaBiałko Gq może aktywować alternatywną kaskadę sy- no przy użyciu oprogramowania Affymetrix GeneChip gnałową poprzez aktywację kinazy tyrozynowej (PTK), Analysis Suite 5.0. Otrzymane wyniki normalizowano kinazy proteinowej (RAF-1), kinazy MEK i kinazy w programie RMA Express. Zmiany aktywności transMAPK. Inna kaskada sygnałowa również aktywowana krypcyjnej genów w tkance nowotworowej w odniesieprzez receptor EDNRA rozpoczyna się od kinazy PI3K niu do kontroli, oceniano w programie Microsoft Excel aktywowanej poprzez białko Gq a następnie: Akt. oraz i SAM (significance analysis of microarrays), mTOR - centralny regulator syntezy protein. Ponadto PTK może fosforylować tyrozyny w białkach cytosz- '¬ylpl kieletu jak paxillina. (ryc.1) EDNRA może również uaktywniać fosfolipazę A2 uwalniającą z fosfolipidów Analizę profilu ekspresji genów kodujących endoteliny błonowych kwas arachidonowy który przekształcony i ich receptory w wycinkach jelita prawidłowego i gruczozostaje pod wpływem cyklooksygenaz (COX1,COX2) lakoraka, rozpoczęto od porównania raportów wygenerowaw prostaglandyny/4/. nych w programie Microarray Suite Affymetrix bezpośredCelem pracy było porównanie aktywności transkrypcyj- nio po odczycie sygnałów fluorescencji na mikromacierzy, nej genów kodujących endotelinę i jej receptory w wycin- zgodnie z zaleceniami producenta płytek – firmy Affymekach gruczolakoraka i jelita ocenionego na podstawie anali- trix („Technical Manual GeneChip Expression Analysis”). zy histopatologicznej jako prawidłowe. Następnie zaakceptowane do analizy porównawczej wyniki znormalizowano w programie RMA Express, w celu wyrównania zróżnicowanych wartości tła oraz szumu, zmniejszającego prawdopodobieństwo poprawnej interpretacji wyników. Porównanie aktywności transkrypcyjnej analizowanych genów w jelicie prawidłowym (grupa kontrolna) i tkance nowotworowej (grupa badana), rozpoczęto od wyznaczenia stop¬Aly-¤7-®RqRp |\|Ra-u¥®RJ -ªl-oÔARa|ª¬ylp-y-ql®¬o-k nia zróżnicowania sygnałów fluorescencji p|²Al|ªRoRp -p }ªA-tp|ªl Ra|®ª¬Alyp}ªoRql --ªlJt|ªRa| pomiędzy grupą kontrolną i badaną, na podstawie współczynnika SLR (signal log ratio), la¥A®|q-p|-p- &ARMACEUTYCZNY0RZEGLD.AUKOWY ¤°```¨¨- ¤°U¡zz¨¨- ¤°°¨«¨- ¤°^U¨- ¤Uzz^¨¨- ¡ ¤ RAR | yJ| Rqly-¡ RAR | yJ| Rqly-¤ yJ| Rqly- 'lRq|p| y|²É ®ul-y¬ ¤ G¤ k¡G° kGz m¡G¡ k°G°U mG°^ -0,23 m1,17 GU k¤G¤ "R " 2.104412 -2.62709 -0.35669 -0.37703 0.29779 0 0 8.5 28.7 52.4 "-7Rq-"-yp¬ ¬}¸ylA¥oÔARª¬Alypla¥A®|q-p|-p-|JoRql --ªlJt|ªRa| ¤ Xªp-®¥oRªlRq|p| y|²É®ul-y¬qlA®7¬p|llu|pR²q|yRa| -yp¬ ¥ª p-yARy|ª| ª||ªRoª|}ªy-yl¥ J| p-ypl-ªlJt|ªRoG R "X R " ¥JRy -®-y-ql®ÔRu¥ -AolA|R X|pR²q-®y-ulRyy|²É - ¬ ¬A®yÔ|}ªy¬ª-k y¬Aiª¬ylp}ªGª}tA®¬yylpk©-q¥R ªp-®¥oR-ªJ||J|7lRÍ ª-®¬-Jp|ª|²Al|7Rª|ª-yRo}¸ylA¬ określającego logarytm różnicy uśrednionych sygnałów fluorescencji transkryptu w grupie badanej w porównaniu do kontroli (tabela 1). Otrzymane wyniki wykazały, istotne różnice aktywności transkrypcyjnej genów receptora dla endoteliny EDNRA oraz endoteliny EDN1, które w wycinkach raka charakteryzowały się nadekspresją w porównaniu do kontroli, podczas gdy gen EDN3 uległ wyciszeniu (tabela 1). W dalszym etapie analizy w programie SAM (significance analysis of microarrays) wyznaczono współczynnik Q, który wskazywał procent prawdopodobieństwa przypadkowości obserwowanych różnic oraz oceniono znamienność statystyczną wyników na podstawie parametru „score” – wyznaczonego testem T studenta z analizą permutacji (Tabela 1). Ten etap analizy wykazał, że z grupy genów kodujących endoteliny i ich receptory, do grupy genów różnicujących można zaliczyć tylko gen receptora EDNRA i enoteliny EDN3 poszczególnych szlaków dawały efekty w postaci redukcji wzrostu komórek raka w hodowlach lini komórkowych /9/. Wydaje się więc, że istnieje potrzeba dokładniejszej analizy poszczególnych szlaków by móc odpowiedzieć na pytanie który z mechanizmów odpowiada za progresję i przerzuty nowotworowe. Już dziś pojawiają się nieśmiałe próby zastosowania inhibitorów receptora EDNRA w walce z niektórymi nowotworami np. z rakiem prostaty /10/ czy rakiem jajnika /11/. Warto ustalić które składowe kaskady sygnałowej odpowiadają za angiogenezę, które za przerzuty, które za utrzymanie zdolności przeżycia zmutowanej komórki nowotworowej, a które wreszcie za progresję nowotworu. Są to pytania na które będziemy chcieli odpowiedzieć, mając możliwości analizowania poszczególnych etapów kaskad sygnałowych przez pryzmat aktywności transkrypcyjnej genów. ¬p¥o- 1. Koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku to okres wzmożonego zainteresowania endoteliną w nowotworach. Analizowano sekrecję endoteliny-1 przez komórki kultur gruczolakoraka jelita grubego. Stwierdzono, że komórki te produkują i wydzielają endotelinę1 /5, 6, 7/. Wyniki dotyczące EDN1 otrzymane w naszej pracy są dyskusyjne. Biorąc pod uwagę współczynnik SLR można podkreślić zgodność wyników z danymi literaturowymi, jednak współczynnik Q wskazuje aż 52,4% prawdopodobieństwa, że obserwowana różnica może być przypadkowa a wynik testu T studenta z analizą permutacji wskazuje brak znamienności statystycznej otrzymanych wyników. Jest to związane z dużym rozrzutem stężenia mRNA EDN1 w wycinkach jelita (podczas gdy dla innych transkryptów wyniki są porównywalne w badanych grupach). Obserwacje takie wskazują, że do oceny aktywności transkrypcyjnej EDN1 wymagana jest znacznie większa liczba powtórzeń oraz sprawdzenie, jak zmienia się ekspresja tego genu w zależności od indywidualności osobniczej i od stopnia zaawansowania transformacji nowotworowej. Z danych literaturowych wynika, że właśnie endotelina-1 (EDN-1) należy do peptydów, które stymulują proliferację komórek nowotworowych lub indukują proces apoptozy. EDN-1 wykazuje działanie mitogenne poprzez aktywację kaskad sygnałowych. Na chwilę obecną trudno powiedzieć który ze szlaków w kaskadzie sygnałowej odgrywa najistotniejszą rolę, tym niemniej próby blokady Piśmiennictwo 2. 3. 4. 5. 6. 7. Inoue A, Yanagisawa M, Kimura S et al /1989/: The human endothelin family: three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes. Proc. Natl. Acad. Sci,86,2863-2867. Inoue A, Yanagisawa M, Takuwa Y et al./1989/ The human preproendothelin-1 gene. Complete nucleotide sequence and regulation of expression. J.Biol.Chem.,264,14954-14959. Karne S, Jayawickreme C.K, Lerener M.R./1993/: Cloning and characterization of an endothelin-3 specific receptor (ETC receptor) from Xenopus Laevis dermal melanophores.J.Biol.Chem.,268,19126-19133 Bagnato A, Spinella F, Rosano L/2005/ Emerging role of the endothelin axis in ovarian tumor progression.Endocr Relat Cancer 12(4):761-772. Nakayama M, Takahashi K, Hara E et al/1998/ Production and secretion of two vasoactive peptides, endothelin-1 and adrenomeduullin, by a colorectal adenocarcinoma cell line,DLD-1. J Cardiovasc Pharmacol. 31 Suppl 1: 534-536 Asham E, Shankar A, Loizidou M et al. /2001/ Increased endothelin-1 in colorectal cancer and reduction of tumour growth by ET(A) receptor antagonism. Br J Cancer.,85(11): 1759-1763 Takahashi k, Totsune K, Kitamuro T et al /2002/ Three vasoactive peptides, endothelin-1, adrenomedullin and urotensin-II, in human tumour cell lines of origin: expression and effects on proliferation. Clin Sci(Lond), 103 Suppl 48: 35S-38S. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 8. Peduto Eberi L, Bovey R, Juillerat-Jeanneret L /2003/ Endothelin-receptor antagonist are proapoptotic and antiproliferative in human colon cancer cells.Br J Cancer 88(5):788-795 9. Grant K, Knowies J, Dawas K et al /2007/ Mechanisms of endothelin-1 stimulated proliferation in colorectal cancer lines. Br J Surg 94(1):106-112. 10. Thakkar SG, Choueiri TK, Garcia JA/2006/ Endothelin receptor antagonist: rationale, clinical development, and role in prostate cancer theraputics. Curr Oncol Rep.8(2):108-113 11. Rosano L, Di Castro V, Spinella F et al/2007/Combined targeting of endothelin A receptor and epidermal growth factor in ovarian cancer shows enhanced antitumo activity. Cancer Res. 67(13):6351-6359. 12. Kusuhara M, Yamaguchi K,Nagasaki K et al/1990/ Production of endothelin in human cancer cell lines.Cancer Res 50(11):3257-61