Instrukcje do ćwiczeń

METODY SEPARACYJNE
CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA
analityka chemiczna III rok 1 stopień
dr Monika Skowron
TLC1 — IDENTYFIKACJA JONÓW HALOGENKOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII
CIENKOWARSTWOWEJ
Chromatografia jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego
ich podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Jeżeli fazą ruchomą
jest ciecz, zaś faza nieruchoma umieszczona jest na płaszczyźnie, to mówimy o chromatografii
cienkowarstwowej.
Identyfikacja substancji sprowadza się do porównania wartości współczynników opóźnienia RF
wzorca i próbki badanej. W tym celu wykonuje się chromatogram dla roztworów wzorcowych
rozdzielanych substancji o stężeniach zbliżonych do zakładanego w próbce badanej.
Wartość RF plamek substancji otrzymanych z roztworu badanego powinna odpowiadać RF plamek
otrzymanych z odpowiednich roztworów wzorcowych.
Składniki analizowanej w ćwiczeniu próbki nie są barwne, należy więc przeprowadzić ich
wizualizację. Chromatogram wywołuje się spryskując go w pierwszej kolejności roztworem AgNO3,
a następnie roztworem K2CrO4.
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie studenta z metodą chromatografii cienkowarstwowej (z ang.
Thin Layer Chromatography - TLC) oraz rozdzielenie mieszaniny halogenków i ich identyfikację.
Odczynniki
roztwór amoniaku (1+3),
aceton do HPLC,
n-butanol do HPLC,
roztwory wrozcowe KCl, KBr i KI o stężeniu 0.1 mol/l,
roztwory AgNO3 i K2CrO4 o stężeniu 0.1 mol/l,
badana mieszanina halogenków.
Aparatura i sprzęt laboratoryjny
zlewka pojemności 25 ml
1 szt.
pipeta o pojemniści 1 ml
1 szt.
pipeta o pojemniści 2 ml
1 szt.
pipeta o pojemności 5 ml
1 szt.
płytka aluminiowa pokryta celulozą
1 szt.
komora chromatograficzna
1 szt.
spryskiwacz TLC
2 szt.
automatyczny aplikator Linomat 5
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotowanie płytki chromatograficznej:
UWAGA: PODCZAS PRACY Z PŁYTKĄ CHROMATOGRAFICZNĄ NALEŻY UWAŻAĆ ABY NIE
USZKODZIĆ POWIERZCHNI SORBENTU.
- z aluminiowego arkusza wyciąć płytkę o wymiarach 5x5 cm;
- umieścić płytkę w suchej komorze w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie
konieczności przyciąć ją;
- w odległości 4.5 cm od jednego z brzegów płytki narysować linię końca do której będzie
rozwijany chromatogram.
2. Przygotowanie fazy ruchomei i komory chromatograficznej:
- przygotowanie fazy ruchomej: do zlewki o pojemności 25 ml odmierzyć amoniak, aceton
i n-butanol w stosunku objętościowym 0.8 : 2.6 : 1.2. Roztwór dobrze wymieszać;
- ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną;
- przykryć komorę pokrywką i pozostawić ją w celu nasycenia parami eluentu (jest to czas na
aplikację roztworów).
3. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora
- aplikację roztworów wzorcowych KCl, KBr i KI o objętości 0.5 μl oraz próbki badanej o
objętości 0.2 μl przeprowadzić zgodnie z instrukcją obsługi aplikatora Linomat 5.
4. Rozwijanie chrmatogramu:
- płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia
chromatogramu,
- obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do lini końca wyjąć ją z komory
i lekko wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza.
5. Wizualizacja chromatogramu:
- do jednej butelki spryskiwacza wlać roztwór AgNO3, a do drugiej K2CrO4. Dokręcić butelki do
korpusu spryskiwaczy;
- spryskać płytkę roztworem AgNO3, lekko podsuszyć, a następnie roztworem K2CrO4;
- płytkę dobrze osuszyć i zaznaczyć ołówkiem uwidocznione plamki.
Opracowanie wyników
1. Wyznaczyć wartość współczynników Rf
Rf = A/B
gdzie:
Rf – określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do
środka plamki – A) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od lini startu do czoła fazy
ruchomej – B), gdzie B w tym przypadku wynosi 8 cm.
2. Zinterpretować otrzymane wyniki.
TLC2 ILOŚCIOWE OZNACZANIE ESPERALU W TABLETKACH „ANTICOL”
Esperal (disulfiram, disiarczek bis[dietylokarbamoilu]) jest substancją czynną leków stosowanych
w leczeniu alkoholizmu. Zaburza on metabolizm alkoholu etylowego. Blokuje działanie
dehydrogenazy aldehydowej (enzymu) przez co spowalnia utlenieniu aldehydu octowego do mniej
szkodliwej substancji - kwasu octowego. Spożycia alkoholu (we wszelkiej postaci, nawet produkty
spożywcze zawierające niewielkie ilości alkoholu) podczas kuracji esperalem towarzyszą bardzo
nieprzyjemne reakcje: pulsujący ból głowy, gwałtowne bicie serca, wymioty, mdłości, silne
zaczerwienienie twarzy, uczucie braku tchu.
Ćwiczenie ma na celu ilościowe oznaczanie esperalu w tabletach ANTICOL metodą dodatku
wzorca. W tym celu mierzy się pole powierzchni pików otrzymanych z plam odpowiadających
roztworowi nieznanemu oraz roztworom sporządzonym przez wielokrotny dodatek znanej ilości
wzorca do próbki badanej. Wykonuje się wykres jak na rysunku poniżej.
pole powierzchni piku
15
10
5
0
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
masa dodatku wzorca [mg]
Punkt przecięcia linii z osią x odpowiada zawartości oznaczanej substancji.
Odczynniki
Roztwór siarczanu (VI) miedzi (II) o stężeniu c(CuSO4)=0.5 mol/l
Disiarczek tetraetylotiuramu (esperal, disulfiram)
Metanol, cz.d.a.
Preparat farmaceutyczny ANTICOL disulfiramum 500 mg - Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne,
Warszawa
Aparatura i sprzęt laboratoryjny
Kolby miarowe pojemności 5 ml
2 szt.
Kolby miarowe pojemności 1 ml
4 szt.
Kolbki Eppendorfa o pojemności 1.5 ml
4 szt.
Zlewka o pojemności 25 ml
1 szt.
Lejki
2 szt.
Pipeta pojemności 5 ml
1 szt.
pipeta o pojemności 1 ml
1 szt.
Pipeta automatyczna nastawna pojemności 200 l
1 szt.
Pipeta automatyczna nastawna pojemności 0.1-1 l
1 szt.
Naczynka wagowe
2 szt.
Moździerz
1 szt.
Łopatka
1 szt.
Płytka pokryta żelem krzemionkowym Silica gel S60 RP-18 (wymiary 5 cm x 5 cm)
Komora chromatograficzna DESAGA
Spryskiwacz TLC
Wykonanie ćwiczenia
1. Włączyć suszarkę laboratoryjną (temp. 50oC).
2. Przygotowanie roztworów.
a) odważyć 50 mg wzorca esperalu, przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 5 ml, rozpuścić
w około 2 ml metanolu i uzupełnić kolbkę metanolem do kreski. Całość dobrze wymieszać
b) jeśli to konieczne rozetrzeć w moździerzu jedną tabletkę preparatu farmaceutycznego.
Odważyć 50 mg i przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 5 ml. Dodać około 2 ml
metanolu i wytrząsać przez 5 minut na płuczce ultradźwiękowej. Kolbkę uzupełnić
metanolem do kreski i całość dobrze wymieszać.
c) do 2 probówek Eppendorfa o pojemności 1.5 ml wlać przygotowany roztwór preparatu
farmaceutycznego z punktu 2b i odwirować mieszaninę na wirówce.
d) Do 4 kolbek o pojemności 1 ml przenieść po 100 l roztworu leku z punktu 2c, a następnie
odpowiednio 0, 50, 100 i 150 l roztworu wzorca esperalu z punktu 2a. Kolbki uzupełnić
metanolem do kreski i całość dobrze wymieszać.
3. Przygotowanie płytki chromatograficznej.
a) z arkusza wyciąć płytkę chromatograficzną o wymiarach 5x5 cm
b) w odległości 0.5 cm od dołu płytki zaznaczyć cienko ołówkiem linię startu, a w odległości 4
cm od linii startu zaznaczyć koniec drogi rozwijania chromatografu. Na linii startu w
odległości 1 cm od siebie delikatnie zaznaczyć ołówkiem punkty, na które będą nanoszone
roztwory;
c) płytkę przymierzyć do komory chromatograficznej i dopasować ją do wymiarów jej wymiarów
odcinając fragment poza linia końca.
b) na linię startu nanieść mikropipetą po 0.5 l każdego z roztworów z punktu 2d.
c) płytkę wysuszyć suszarką.
4. Przygotowanie komory chromatograficznej
a) do zlewki o pojemności 25 ml przenieść 3.6 ml metanolu oraz 0.4 ml wody. Całość
wymieszać
i napełnić zbiorniczek komory chromatograficznej sąsiadujący z paskiem z materiału
porowatego.
b) płytkę umieścić w komorze chromatograficznej dociskając ją płytkę do materiału porowatego
c) obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do linii końca (4 cm) wyjąć
płytkę
z komory i wysuszyć suszarką fryzjerską.
5. Wizualizacja płytki
Wysuszona płytkę spryskać roztworem siarczanu (VI) miedzi (II) za pomocą spryskiwacza
w odpowiedniej komorze spryskującej. Suszyć w suszarce w temperaturze 50oC przez 2 min.
6. Skanowanie płytki.
a) Otwieramy program Centrum Obsługi HP poprzez podwójne kliknięcie lewym przyciskiem
myszy ikony ->
znajdującej się na Pulpicie.
b) Następnie klikamy przycisk ->Skanuj obraz – w tym momencie komputer sam uruchomi
skaner
i na monitorze wyświetli się skanowany obraz.
c) Zaznaczamy skanowany obszar (płytkę) poprzez przeciągnięcie lewym przyciskiem myszy
obszaru aktywnego (ilustracja 1).
Ilustracja 1. Obszar aktywny skanowania
d) Naciskamy lewym przyciskiem myszy -> Akceptuj.
e) Komputer zapisze zeskanowaną płytkę w folderze ustawionym jako domyślny.
f) Zamykamy program Centrum Obsługi HP poprzez klikniecie krzyżyka w prawym górnym
rogu lewym przyciskiem myszy.
6. Instrukcja obsługi programu TLSee
1. Uruchamiamy program TLSee poprzez podwójnie kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony
->
znajdującej się na Pulpicie
2. Następnie wybieramy opcję File->New Experiment->Without calibration poprzez pojedyncze
kliknięcie lewym przyciskiem myszy owej funkcji (ilustracja 2).
Ilustracja 2. Without calibration mode
3. Następuje otwarcie pełnej wersji programu TLSee (ilustracja 3.)
Ilustracja 3. Pełne otwarcie programu TLSee
4. W wierszu Image klikamy lewym przyciskiem myszy ikonkę ->
i wybieramy ścieżkę
dostępu zeskanowanej płytki (np. D:\(data)\plytka(nr).jpg). Na monitorze wyświetla się
zeskanowana płytka.
5. Aktywujemy lewym przyciskiem myszy zakładkę Plate (u dołu aktywnego okna) i
suwaczkami (na ilustracji 4. zaznaczone strzałkami) określamy linię startu i końca
przeciągając je lewym przyciskiem myszy do odpowiedniej wysokości.
Ilustracja 4. Określanie linii startu i końca.
6. Aktywujemy funkcję Fixed Band poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony ->
(w pasku na górze) zaznaczonej na ilustracji 4. Najeżdżamy myszką na obraz płytki
i zaznaczamy tzw. „pasmo”, czyli drogę migracji plamki oraz fazy ruchomej od linii startu aż
do linii końca, tak by cała plamka mieściła się między ogranicznikami (patrz ilustracja 5.).
Postępujemy tak dla wszystkich otrzymanych plamek.
Ilustracja 5. Funkcja - Fixed Band
7. Klikamy lewym przyciskiem myszy ikonę View Profiles ->
i na monitorze pojawiają się
chromatogramy pikowe. Lane 1 odpowiada ścieżce 1, Lane 2 – ścieżce 2 itd. By poruszać
się między ścieżkami wystarczy lewym przyciskiem myszy kliknąć interesującą nas Lane.
Integracja pików
8. W celu wyznaczenia pola powierzchni poszczególnych pików należy aktywować funkcję
Band Integration poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony ->
(zaznaczonej
na ilustracji 4.).
9. Następnie trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy przeciągamy strzałką pik u podstawy
po całej jego szerokości, jak na ilustracji 6. Robimy tak dla wszystkich czterech pików (Lane
1, Lane 2, Lane 3, Lane 4), które otrzymaliśmy. Komputer automatycznie liczy wartość Rf
(Peak Rf) oraz pole powierzchni (Area) poszczególnych pików.
10. Sporządzamy tabelę, w której umieszczamy dane dotyczące wartości Rf oraz pola
powierzchni każdego z otrzymanych pików.
Ilustracja 6. Integracja piku.
11. Zamykamy program klikając lewym przyciskiem myszy krzyżyk znajdujący się w prawym
górnym rogu monitora.
12. Klikamy „NIE”.
Opracowanie wyników
ANALIZA JAKOŚCIOWA
1. Wyznaczyć współczynnik opóźnienia Rf każdej z plamek.
Rf 
a
b
gdzie:
Rf określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do
środka plamki – a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od linii startu do czoła fazy
ruchomej – b).
2. Zinterpretować otrzymane wartości. Czy w tabletce znajduje się esperal?
ANALIZA ILOŚCIOWA
1. Sporządzić wykres jak na rysunku we wstępnie zaznaczając na osi x punkt określony jako mx,
w odległości 20 mm na prawo punkt opowiadający pierwszemu dodatkowi czyli 0.5 mg, dalej
w odległości 40 mm od mx i 60 mm od mx punkty odpowiadające dodaniu do próbki badanej
kolejnym wzorcom (1.0 i 1.5 mg)
2. Przez otrzymane punkty poprowadzić prostą i znaleźć jej przecięcie z osią x. Odcinek osi x od
przecięcia z osią x do punktu mx odpowiada zawartości esperalu w kolbce. Jeśli skorzysta się
z programu EXCEL to wyznaczyć równanie prostej i zleźć punkt x odpowiadający y=0.
3. Obliczyć zawartość esperalu w 1 tabletce, wiedząc że 1 tabletka ma masę 668 mg. Wyciągnąć
wnioski.
INSTRUKCJA OBSŁUGI AUTOMATYCZNEGO APLIKATORA TLC LINOMAT 5
1. Załadowanie płytki TLC (Rys. 1)
- przesunąd, znajdującą się z prawej strony dźwignię stolika ( 1 ) do góry i w tylne położenie dla obniżenia
płyty stolika;
- mieścid płytkę TLC ( 2 ) w lewym górnym rogu stolika w taki sposób aby stykała się z tylną krawędzią i
dwoma kołkami pozycjonującymi ( 3 );
- zabezpieczyd położenie płytki za pomocą listwy ( 4 );
- przemieścid uważnie dźwignię stolika ( 1 ) w poprzednie położenie.
Kierowanie dźwignią powinno odbywad się w taki sposób aby uniknąd zbyt szybkiego unoszenia się
ruchomej płaszczyzny stolika.
Rys. 1
2. Odkręcid butlę z azotem.
3. Włączyd aplikator przyciskiem O/I umieszczonym na lewym boku obudowy (świeci się dioda POWER
ON).
Aplikator będzie teraz spełniad następujące funkcje kontrolne:
- inicjowanie napędu płyty.
- inicjowanie napędu strzykawki.
Jeśli uruchomienie się powiodło na ekranie pojawi się napis:
** Linomat 5 ** Instrument ready
3. Wprowadzanie parametrów metody.
- w celu wybrania metody nacisnąd przycisk RUN:
zostanie wyświetlona metoda, która w ostatnim okresie czasu była najczęściej używana. Przy pomocy
klawiszy ▲ i ▼ można wybrad inną przechowywaną metodę.
- w celu zmiany parametrów dla wybranej metody nacisnąd przycisk DIALOG:
przy pomocy klawiszy ▲ i ▼ wybrad grupę parametrów, które chcemy zmienid. Aby zmienid parametry
z danej grupy nacisnąd ENTER.
- dostępne są następujące grupy parametrów:
wybór kolejnego parametru, który ma byd zmieniony następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER, a
wybrany parametr zmienia się przy pomocy klawiszy ▲ i ▼. Zatwierdzenie i jednocześnie przejście do
kolejnego parametru następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER.
UWAGA! Po zapisaniu metody naciśnięcie kolejne przycisku ENTER powoduje rozpoczęcie procedury
aplikacji
Aplikacja badanych roztworów na płytkę
2. Napełnienie strzykawki dozującej
1 trzykrotnie przemyd strzykawkę wodą dejonizowaną
2 trzykrotnie strzykawkę roztworem, który ma byd nanoszony na płytkę
3 napełnid strzykawkę roztworem, który ma byd nanoszony na płytkę w objętości przynajmniej takiej jak
jest wyświetlana na wyświetlaczu;
Kroki 2-3 powtórzyd dla wszystkich roztworów, które mają byd aplikowane.
Po zakooczeniu aplikacji wszystkich roztworów przemyd strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a
następnie siedmiokrotnie metanolem.
3. Umieszczanie napełnionej strzykawki dozującej w aplikatorze (Rys. 2)
- upewnid się czy płyta jest w odpowiednim położeniu i poziome ramię wieżyczki znajduje się w górnym
położeniu;
- przy pomocy lewej ręki przesunąd ramię dźwigni ( 1 ) w lewo i pozostawid w tym położeniu;
- ostrożnie przełożyd strzykawkę przez uchwyt strzykawki ( 2 ) i ostrożnie obniżad aż do oparcia
strzykawki w głowicy rozpylającej ( 3 ).
Rys. 2.
4. Rozpoczęcie aplikacji próbki
- nacisnąd przycisk ENTER co spowoduje inicjację napędu strzykawki i ustawienie stolika.
- nacisnąd ponownie przycisk ENTER:
Napęd strzykawki będzie teraz wykonywad automatyczne wypuszczanie ustalonej objętości wstępnego
dozowania, a następnie nastąpi aplikacja pierwszej próbki.
- po aplikacji pierwszej próbki napęd strzykawki i stolik powrócą automatycznie do pozycji wstępnego
dozowania.
- napełnid strzykawkę kolejnym dozowanym roztworem i postępując analogicznie jak w przypadku
pierwszej próbki zaaplikowad go na płytkę.
Całą procedurę powtórzyd dla wszystkich roztworów.
5. Zakooczenie aplikacji
- wyłączyd aplikator przyciskiem O/I i zakręcid butlę z gazem;
- przemyd strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem.