TLC1 — IDENTYFIKACJA JONÓW HALOGENKOWYCH METODĄ

TLC1 — IDENTYFIKACJA JONÓW HALOGENKOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII
CIENKOWARSTWOWEJ
Chromatografia jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich
podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Jeżeli fazą ruchomą jest
ciecz, zaś faza nieruchoma umieszczona jest na płaszczyźnie, to mówimy o chromatografii
cienkowarstwowej.
Identyfikacja substancji sprowadza się do porównania wartości współczynników opóźnienia RF wzorca
i próbki badanej. W tym celu wykonuje się chromatogram dla roztworów wzorcowych rozdzielanych
substancji o stężeniach zbliżonych do zakładanego w próbce badanej.
Wartość RF plamek substancji otrzymanych z roztworu badanego powinna odpowiadać RF plamek
otrzymanych z odpowiednich roztworów wzorcowych.
Składniki analizowanej w ćwiczeniu próbki nie są barwne, należy więc przeprowadzić ich wizualizację.
Chromatogram wywołuje się spryskując go w pierwszej kolejności roztworem AgNO 3, a następnie
roztworem K2CrO4.
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie studenta z metodą chromatografii cienkowarstwowej (z ang. Thin
Layer Chromatography - TLC) oraz rozdzielenie mieszaniny halogenków i ich identyfikację.
Odczynniki
roztwór amoniaku (1+3),
aceton do HPLC,
n-butanol do HPLC,
roztwory wrozcowe KCl, KBr i KI o stężeniu 0.1 mol/l,
roztwory AgNO3 i K2CrO4 o stężeniu 0.1 mol/l,
badana mieszanina halogenków.
Aparatura i sprzęt laboratoryjny
zlewka pojemności 25 ml
1 szt.
pipeta o pojemniści 1 ml
1 szt.
pipeta o pojemniści 2 ml
1 szt.
pipeta o pojemności 5 ml
1 szt.
płytka aluminiowa pokryta celulozą
1 szt.
komora chromatograficzna
1 szt.
spryskiwacz TLC
2 szt.
automatyczny aplikator Linomat 5
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotowanie płytki chromatograficznej:
UWAGA: PODCZAS PRACY Z PŁYTKĄ CHROMATOGRAFICZNĄ NALEŻY UWAŻAĆ ABY NIE
USZKODZIĆ POWIERZCHNI SORBENTU.
- z aluminiowego arkusza wyciąć płytkę o wymiarach 5x5 cm;
- umieścić płytkę w suchej komorze w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie konieczności
przyciąć ją;
- w odległości 4.5 cm od jednego z brzegów płytki narysować linię końca do której będzie rozwijany
chromatogram.
2. Przygotowanie fazy ruchomei i komory chromatograficznej:
- przygotowanie fazy ruchomej: do zlewki o pojemności 25 ml odmierzyć amoniak, aceton
i n-butanol w stosunku objętościowym 0.8 : 2.6 : 0.8. Roztwór dobrze wymieszać;
- ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną;
- przykryć komorę pokrywką i pozostawić ją w celu nasycenia parami eluentu (jest to czas na
aplikację roztworów).
3. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora
- aplikację roztworów wzorcowych KCl, KBr i KI o objętości 0.5 μl oraz próbki badanej o objętości
0.2 μl przeprowadzić zgodnie z instrukcją obsługi aplikatora Linomat 5.
4. Rozwijanie chrmatogramu:
- płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia
chromatogramu,
- obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do lini końca wyjąć ją z komory i lekko
wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza.
5. Wizualizacja chromatogramu:
- do jednej butelki spryskiwacza wlać roztwór AgNO3, a do drugiej K2CrO4. Dokręcić butelki do
korpusu spryskiwaczy;
- spryskać płytkę roztworem AgNO3, lekko podsuszyć, a następnie roztworem K2CrO4;
- płytkę dobrze osuszyć i zaznaczyć ołówkiem uwidocznione plamki.
Opracowanie wyników
1. Wyznaczyć wartość współczynników Rf
Rf = A/B
gdzie:
Rf – określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka
plamki – A) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od lini startu do czoła fazy ruchomej – B),
gdzie B w tym przypadku wynosi 8 cm.
2. Zinterpretować otrzymane wyniki.
TLC2 — ILOŚCIOWE OZNACZANIE ESPERALU W TABLETKACH „ANTICOL”
Esperal (disulfiram, disiarczek bis[dietylokarbamoilu]) jest substancją czynną leków stosowanych
w leczeniu alkoholizmu. Zaburza on metabolizm alkoholu etylowego. Blokuje działanie dehydrogenazy
aldehydowej (enzymu) przez co spowalnia utlenieniu aldehydu octowego do mniej szkodliwej substancji
- kwasu octowego. Spożycia alkoholu (we wszelkiej postaci, nawet produkty spożywcze zawierające
niewielkie ilości alkoholu) podczas kuracji esperalem towarzyszą bardzo nieprzyjemne reakcje: pulsujący
ból głowy, gwałtowne bicie serca, wymioty, mdłości, silne zaczerwienienie twarzy, uczucie braku tchu.
Ćwiczenie ma na celu ilościowe oznaczanie esperalu w tabletach ANTICOL metodą dodatku wzorca. W
tym celu mierzy się pole powierzchni pików otrzymanych z plam odpowiadających roztworowi
nieznanemu oraz roztworom sporządzonym przez wielokrotny dodatek znanej ilości wzorca do próbki
badanej. Wykonuje się wykres jak na rysunku poniżej.
pole powierzchni piku
30
25
20
15
10
5
0
-2
-1
0
1
2
masa dodanego wzorca [mg]
Punkt przecięcia linii z osią x odpowiada zawartości oznaczanej substancji.
Odczynniki
Roztwór siarczanu (VI) miedzi (II) o stężeniu c(CuSO4)=0.5 mol/l
Disiarczek tetraetylotiuramu (esperal, disulfiram)
Metanol, cz.d.a.
Preparat farmaceutyczny ANTICOL disulfiramum 500 mg - Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne,
Warszawa
Aparatura i sprzęt laboratoryjny
Kolby miarowe pojemności 10 ml
2 szt.
Kolby miarowe pojemności 5 ml
4 szt.
Kolbki plastikowe o pojemności 1,5 ml
4 szt.
Zlewka o pojemności 25 ml
1 szt.
Lejki
2 szt.
Pipeta o pojemności 2 ml
2 szt.
Pipeta automatyczna nastawna pojemności 5000 l
1 szt.
Pipeta automatyczna nastawna pojemności 0,1-1 l
1 szt.
Naczynka wagowe
2 szt.
Moździerz
1 szt.
Łopatka
1 szt.
Płytka pokryta żelem krzemionkowym Silica gel S60
Suszarka fryzjerska
Komora chromatograficzna
Spryskiwacz TLC
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotowanie roztworów.
- ROZTWÓR
LEKU
ANTICOL
(L)
-
w
moździerzu
rozetrzeć
jedną
tabletkę
preparatu
farmaceutycznego. Odważyć 80 mg i przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 10 ml. Dodać
około 5 ml metanolu i wytrząsać przez 5 minut na płuczce ultradźwiękowej. Kolbkę uzupełnić
metanolem do kreski.
- ROZTWÓR WZORCOWY ESPERALU (W) - odważyć 60 mg wzorca esperalu, przenieść ilościowo
do kolbki o pojemności 10 ml, rozpuścić w około 5 ml metanolu i uzupełnić kolbkę metanolem do
kreski.
- do 4 kolbek o pojemności 5 ml przenieść po 500 l roztworu leku (L), a następnie odpowiednio 0,
500, 1000, 1500 l roztworu wzorca esperalu (W). Kolbki uzupełnić metanolem do kreski.
2. Przygotowanie płytki chromatograficznej.
- z arkusza wyciąć płytkę chromatograficzną o wymiarach 5x5 cm
- umieścić płytkę w suchej komorze w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie konieczności
przyciąć ją;
- w odległości 4.5 cm od jednego z brzegów płytki narysować linię końca do której będzie rozwijany
chromatogram.
3. Przygotowanie fazy ruchomej i komory chromatograficznej
- do zlewki o pojemności 25 ml przenieść 2 ml metanolu oraz 2 ml wody. Całość wymieszać
i napełnić komorę chromtograficzną.
- ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną;
- przykryć komorę pokrywką i pozostawić ją w celu nasycenia parami eluentu (jest to czas na
aplikację roztworów).
4. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora
- aplikację 0.5 μl roztworów przygotowanych zgodnie z pktem 2c przeprowadzić zgodnie
z instrukcją obsługi aplikatora Linomat 5.
5. Rozwijanie chrmatogramu:
- płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia
chromatogramu,
- obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do lini końca wyjąć ją z komory i lekko
wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza.
6. Wizualizacja chromatogramu
- wysuszona płytkę ustawić w komorze spryskującej i spryskać ją za pomocą spryskiwacza
roztworem siarczanu (VI) miedzi (II). Suszyć płytkę w suszarce w temperaturze 150 0C przez ok. 5
min.
7. Skanowanie płytki.
a) Otwieramy program Centrum Obsługi HP.
b) Następnie klikamy przycisk ->Skanuj obraz – w tym momencie komputer sam uruchomi skaner i
na monitorze wyświetli się skanowany obraz.
c) Zaznaczamy skanowany obszar (płytkę) poprzez przeciągnięcie lewym przyciskiem myszy
obszaru aktywnego (Rys. 1).
Rys. 1.
d) Naciskamy lewym przyciskiem myszy -> Akceptuj
e) Komputer zapisze zeskanowaną płytkę w folderze domyślnym -> D:\(data)\plytka(nr).jpg
7. Otrzymywanie chromatogramu pikowego za pomocą programu TLSee
a) uruchamiamy program TLSee korzystając ikony ->
znajdującej się na Pulpicie
b) z menu File wybieramy opcję New Experiment -> Without calibration (Rys. 2) co powoduje
otwarcie zakładki wyboru zeskanowanego obrazu płytki (Rys. 3).
Rys. 2.
c) w wierszu Image klikamy lewym przyciskiem myszy ikonkę
i wybieramy ścieżkę dostępu
zeskanowanej płytki (np. D:\(data)\plytka(nr).jpg). (Rys. 3.).
Rys. 3.
d) lewym
przyciskiem
myszy
aktywujemy
zakładkę
Plate
(u
dołu
aktywnego
okna)
i suwaczkami (na Rys. 4. zaznaczone strzałkami) określamy linię startu i końca przeciągając je
lewym przyciskiem myszy do odpowiedniej wysokości.
Rys. 4.
e) poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony ->
Rys.
4
aktywujemy
funkcję
Fixed
Band.
(w pasku na górze) zaznaczonej na
Najeżdżamy
myszką
na
obraz
płytki
i zaznaczamy tzw. „pasmo”, czyli drogę migracji plamki oraz fazy ruchomej od linii startu aż do
linii końca, tak by cała plamka mieściła się między ogranicznikami (Rys. 5.). Postępujemy tak dla
wszystkich otrzymanych plamek.
Rys. 5.
f)
klikamy lewym przyciskiem myszy ikonę View Profiles
(Rys. 4). Pojawia się chromatogram
pikowy (Rys. 6). Zakładka Lane 1 odpowiadający ścieżce 1, Lane 2 – ścieżce 2 itd. By poruszać
się między ścieżkami wystarczy lewym przyciskiem myszy kliknąć interesującą nas zakładkę.
Rys. 6.
g) W celu wyznaczenia pola powierzchni poszczególnych pików należy je zintegrować. Poprzez
kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony
aktywujemy funkcję Band Integration (Rys. 6.).
h) trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy przeciągamy strzałkę wzdłuż podstawy piku
zaznaczając pole jego integracji (Rys. 6). Robimy tak dla wszystkich czterech pików (Lane 1,
Lane 2, Lane 3, Lane 4), które otrzymaliśmy. Komputer automatycznie liczy wartość Rf (Peak Rf)
oraz pole powierzchni (Area) poszczególnych pików.
i)
sporządzamy tabelę, w której umieszczamy dane dotyczące wartości Rf oraz pola powierzchni
każdego z otrzymanych pików.
j)
zamykamy program bez zapisywania otrzymanych wyników.
Opracowanie wyników
ANALIZA JAKOŚCIOWA
1. Wyznaczyć współczynnik opóźnienia Rf każdej z plamek.
Rf 
a
b
gdzie:
Rf określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka
plamki – a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od linii startu do czoła fazy ruchomej – b.
2. Zinterpretować otrzymane wartości. Czy w tabletce znajduje się esperal?
ANALIZA ILOŚCIOWA
1. Sporządzić wykres jak na rysunku we wstępnie zaznaczając na osi x punkt określony jako m x, w
odległości 20 mm na prawo punkt opowiadający pierwszemu dodatkowi czyli 0.6 mg, dalej w
odległości 40 mm od mx i 60 mm od mx punkty odpowiadające dodaniu do próbki badanej kolejnym
wzorcom (1.2, 1.8 mg)
2. Przez otrzymane punkty poprowadzić prostą i znaleźć jej przecięcie z osią x. Odcinek osi x od
przecięcia z osią x do punktu mx odpowiada zawartości esperalu w kolbce. Jeśli skorzysta się z
programu EXCEL to wyznaczyć równanie prostej i zleźć punkt x odpowiadający y=0.
3. Obliczyć zawartość esperalu w 1 tabletce, wiedząc że 1 tabletka ma masę 672 mg. Wyciągnąć
wnioski.
INSTRUKCJA OBSŁUGI AUTOMATYCZNEGO APLIKATORA TLC LINOMAT 5
1. Załadowanie płytki TLC (Rys. 1)
- przesunąć, znajdującą się z prawej strony dźwignię stolika ( 1 ) do góry i w tylne położenie dla obniżenia płyty
stolika;
- mieścić płytkę TLC ( 2 ) w lewym górnym rogu stolika w taki sposób aby stykała się z tylną krawędzią i dwoma
kołkami pozycjonującymi ( 3 );
- zabezpieczyć położenie płytki za pomocą listwy ( 4 );
- przemieścić uważnie dźwignię stolika ( 1 ) w poprzednie położenie.
Kierowanie dźwignią powinno odbywać się w taki sposób aby uniknąć zbyt szybkiego unoszenia się ruchomej
płaszczyzny stolika.
Rys. 1
2. Odkręcić butlę z azotem.
3. Włączyć aplikator przyciskiem O/I umieszczonym na lewym boku obudowy (świeci się dioda POWER ON).
Aplikator będzie teraz spełniać następujące funkcje kontrolne:
- inicjowanie napędu płyty.
- inicjowanie napędu strzykawki.
Jeśli uruchomienie się powiodło na ekranie pojawi się napis:
** Linomat 5 ** Instrument ready
3. Wprowadzanie parametrów metody.
- w celu wybrania metody nacisnąć przycisk RUN:
zostanie wyświetlona metoda, która w ostatnim okresie czasu była najczęściej używana. Przy pomocy
klawiszy ▲ i ▼ można wybrać inną przechowywaną metodę.
- w celu zmiany parametrów dla wybranej metody nacisnąć przycisk DIALOG:
przy pomocy klawiszy ▲ i ▼ wybrać grupę parametrów, które chcemy zmienić. Aby zmienić parametry z
danej grupy nacisnąć ENTER.
- dostępne są następujące grupy parametrów:
wybór kolejnego parametru, który ma być zmieniony następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER, a
wybrany parametr zmienia się przy pomocy klawiszy ▲ i ▼. Zatwierdzenie i jednocześnie przejście do
kolejnego parametru następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER.
parametr
syringe volume
objętość strzykawki
GLOBALS
dosage speed
prędkość dozowania
predosage volume
objętość wstępnego dozowania
plate size
wielkość płytki
number of tracks
ilość ścieżek
number of samples
ilość próbek
PARAMETERS
band length
szerokość plamki
first position X
pozycja X
track distance
odległość między plamkami
app. position Y
pozycja Y
track No.
numer ścieżki
TRACK ASSIGNMENT
SAVE METHOD
wartość
100 µl
25 µl/s
0.2 µl
10x10cm
4
4
0 mm
10 mm
10 mm
10 mm
kolejno: 1, 2, 3, 4
dozowana objętość
0.5 µl
ID próbki
kolejno: 1, 2, 3, 4
save as?
method No. ...
zapisz jako?
metoda nr ...
metoda 5
UWAGA! Po zapisaniu metody naciśnięcie kolejne przycisku ENTER powoduje rozpoczęcie procedury aplikacji
Aplikacja badanych roztworów na płytkę
2. Napełnienie strzykawki dozującej
1 trzykrotnie przemyć strzykawkę wodą dejonizowaną
2 trzykrotnie strzykawkę roztworem, który ma być nanoszony na płytkę
3 napełnić strzykawkę roztworem, który ma być nanoszony na płytkę w objętości przynajmniej takiej jak jest
wyświetlana na wyświetlaczu;
Kroki 2-3 powtórzyć dla wszystkich roztworów, które mają być aplikowane.
Po zakończeniu aplikacji wszystkich roztworów przemyć strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a
następnie siedmiokrotnie metanolem.
3. Umieszczanie napełnionej strzykawki dozującej w aplikatorze (Rys. 2)
- upewnić się czy płyta jest w odpowiednim położeniu i poziome ramię wieżyczki znajduje się w górnym
położeniu;
- przy pomocy lewej ręki przesunąć ramię dźwigni ( 1 ) w lewo i pozostawić w tym położeniu;
- ostrożnie przełożyć strzykawkę przez uchwyt strzykawki ( 2 ) i ostrożnie obniżać aż do oparcia strzykawki w
głowicy rozpylającej ( 3 ).
Rys. 2.
4. Rozpoczęcie aplikacji próbki
- nacisnąć przycisk ENTER co spowoduje inicjację napędu strzykawki i ustawienie stolika.
- nacisnąć ponownie przycisk ENTER:
Napęd strzykawki będzie teraz wykonywać automatyczne wypuszczanie ustalonej objętości wstępnego
dozowania, a następnie nastąpi aplikacja pierwszej próbki.
- po aplikacji pierwszej próbki napęd strzykawki i stolik powrócą automatycznie do pozycji wstępnego
dozowania.
- napełnić strzykawkę kolejnym dozowanym roztworem i postępując analogicznie jak w przypadku pierwszej
próbki zaaplikować go na płytkę.
- całą procedurę powtórzyć dla wszystkich roztworów.
5. Zakończenie aplikacji
- wyłączyć aplikator przyciskiem O/I i zakręcić butlę z gazem;
- przemyć strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem.