ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA Cel ćwiczenia

ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA
Chromatografia jest to metoda chemicznej analizy instrumentalnej, w której
dokonuje się podziału substancji (w przeciwprądzie) między fazę nieruchomą i fazę
ruchomą. Fazę nieruchomą może stanowić bibuła filtracyjna, cienka warstwa
adsorbentu naniesiona na płytkę lub wypełnienie kolumny. Fazę ruchomą stanowi
natomiast roztwór ciekły. W metodzie tej wykorzystywana jest:
1) różnica w zdolności adsorpcyjnej fazy stacjonarnej względem różnych
składników znajdujących się w fazie ruchomej;
2) różnica wielkości współczynnika podziału składników rozdzielanych;
3) różnica wielkości cząsteczek separowanych składników;
4) zatrzymywanie jonów na podłożu jonitowym.
Stopień
rozdziału
można
zwiększyć
dobierając
zarówno
odpowiedni
rozpuszczalnik (eluent), jak i substancję tworzącą fazę stacjonarną. Obraz analizy
chromatograficznej otrzymany bezpośrednio w fazie stacjonarnej (np. barwne plamy
w chromatografii planarnej pochodzące od poszczególnych składników) lub wykres
przedstawiający wyniki analizy w postaci pików odpowiadających rozdzielanym
składnikom (uzyskany dzięki zastosowaniu odpowiedniego detektora) nosi nazwę
chromatogramu. Chromatografia może być stosowana do badań jakościowych,
ilościowych i dla celów preparatywnych.
Zalety chromatografii cienkowarstwowej

próbki przygotowywane tą techniką nie muszą być bardzo staranne, a
niewielkie zanieczyszczenia nie stanowią istotnej przeszkody

próbkę można nanosić na płytkę w dużej objętości, dlatego nie ma potrzeby
zagęszczania roztworów

na jednej płytce można analizować dużą liczbę próbek jednocześnie –
znacznie szybciej niż HPLC

nie potrzeba dobierać rozpuszczalnika do detektora

możliwe jest porównanie składników próbek ze wzorcami

w wielu przypadkach można obserwować przebieg rozdziału i po osiągnięciu
zadowalającego poziomu przerwać proces

cena jednej analizy jest o około 80% niższa niż HPLC
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Nanoszenie próbek
Próbki nanosi się w postaci plamek (rozdział analityczny) lub pasm (rozdział
preparatywny).
1 – płytka chromatograficzna,
2 – linia startu,
3 – czoło fazy ruchomej,
4 – eluent,
5 – komora chromatograficzna,
A – odległość od linii startu do
środka plamki,
B – odległość od linii startu do czoła
fazy ruchomej
tka
chromatograficzn
a, 2 – linia startu,
3 – czoło fazy
ruchomej, 4 –
eluent,
– mm od brzegu płytki) nie może być zanurzona w eluencie. Próbę
Linia startu5(10-20
można nanosić ręcznie (za pomocą mikrostrzykawki lub mikropipety) lub stosując
komora
automatyczne aplikatory (100nl - 100ml).
chromatograficzn
Komory do chromatografii cienkowarstwowej
a, A – odległość
Wykorzystuje
się
zwykle
prostopadłościenne
lub
od linii startu do cylindryczne, szczelnie zamykane komory szklane.
umieszcza się kilka lub kilkanaście płytek, z
środka plamki, B Wewnątrz
–
odległość od linii zastrzeżeniem, ze nie mogą się stykać ze sobą.
Na dno komory wlewa się rozpuszczalnik, aby płytki
startu do czoła były zanurzone 5-10 mm. (nie może być zanurzona linia
fazy ruchomej startu próbek). W dużych komorach ściany wykłada się
bibułą – wysycenie atmosfery parami rozpuszczalnika
zapewnia krótszy czas chromatografowania i lepszy rozdział.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Wizualizacja chromatogramów
Po rozwinięciu chromatogram suszy się. W
przypadku,
gdy
mieszaniny
są
składniki
barwne
analizowanej
otrzymuje
się
chromatogram w postaci barwnych plamek.
Powinny być okrągłe, nierozmyte, rozłożone
równomiernie między linią startu, a czołem
fazy ruchomej, bez „ogonów”.
Jeśli składniki analizowanej substancji są bezbarwne wówczas należy
wywołać chromatogram. Do wywoływania używa się odczynników chemicznych
reagujących z plamkami rozdzielonych związków bezpośrednio po zadziałaniu lub po
ogrzaniu, np. 1200C. Płytki spryskuje się reagentem lub zanurza w roztworze.
Prócz odczynników w postaci ciekłej wykorzystuje się czasem związki gazowe
np. amoniak, pary jodu lub bromu.
Substancję
identyfikowaną
można
porównywać ze
wzorcem
na
podstawie
porównania ich współczynników RF.
RF 
b
a
RF (retardation factor) – stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej (od
punktu startu do środka plamki) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od startu do
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
czoła). Najdokładniejsze wartości osiąga się dla RF w zakresie od 0,1 do 0,7. W tym
przedziale substancje nie muszą być chromatografowane na tej samej płytce, jednak
rodzaj płytki i warunki analizy muszą być identyczne.
Ta sama wartość RF nie stanowi 100% pewności identyczności. Należy
przeprowadzić rozwijanie w innych warunkach i potwierdzić uzyskane wcześniej
wyniki.
Do identyfikacji można wykorzystać densytometr i porównać dane z wzorcami.
Przy nieznanej substancji rozdziela się ją preparatywnie i identyfikuje
poszczególne składniki innymi metodami, np. spektrofotometrycznie.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
Cześć praktyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 3: CHROMATOGRAFIA PLANARNA
Cel ćwiczenia
1. Ocena jakościowa karotenoidów pochodzenia roślinnego.
Materiały
1. Płytki TLC
2. Mikropipeta
3. Szpinak
4. Marchew
5. Heksan, aceton, faza ruchoma: heksan : aceton – 70 : 30
Przebieg ćwiczenia
1. Rozdrobnić liście szpinaku oraz korzeń marchwi na drobne kawałki.
2. Przenieść do moździerza około 2 g próbki i rozcierać z 2 ml acetonu.
Następnie dodać jeszcze 3 ml acetonu, rozetrzeć i przesączyć przez sączek
karbowany do suchej i czystej probówki.
3. Moździerz przepłukać jeszcze 2 ml acetonu i przelać zawartość na sączek.
4. Do probówek dodać po 2 ml heksanu, wytrząsnąć i po rozdzieleniu warstw,
odebrać pipetą do probówek Eppendorf warstwę heksanu.
5. Na płytkach z żelem krzemionkowym narysować linię startową miękkim
ołówkiem ok. 1 cm od krawędzi płytki.
6. Nanieść „plamki startowe” przygotowanych ekstraktów w heksanie za pomocą
mikrostrzykawki, w ilości 20 l (dla ekstraktu ze szpinaku) i 100 l (dla
ekstraktów z marchwi). Plamki nanosić, przy jednoczesnym odparowywaniu
rozpuszczalnika za pomocą nawiewu powietrza.
7. Po wysuszeniu, płytki rozwijać za pomocą mieszaniny heksan : aceton w
proporcjach: 70 : 30.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
Cześć praktyczna
___________________________________________________________________________
8. Zaznaczyć na płytce linię czoła i określić wartości Rf (Rf = a/b, gdzie a-droga
przebyta przez środek plamy analizowanej substancji, droga czoła fazy
ruchomej) dla poszczególnych „plamek”
Opracowanie wyników

Wszystkie wartości Rf zestawić w tabeli.

Zidentyfikować związki wiedząc, że kolejność elucji przebiega następująco:
o Karoten – żółty
o Feofityna a – szary
o Feofityna b – oliwkowo-zielony
o Chlorofil a – niebiesko-zielony
o Luteina – żółty
o Chlorofil b – zielony
o Ksantofile - żółty

Porównać skład barwników roślinnych liści szpinaku i korzenia marchwi.
Sprawozdania powinno zawierać
1. Krótki wstęp teoretyczny.
2. Cel przeprowadzonego ćwiczenia.
3. Tabelę z wynikami pomiarów i obserwacjami.
4. Dyskusję i wnioski.