Wykład 15

Aminokwasy
Aminokwasy – to związki dwufunkcyjne zawierające:
- grupę kwasową (grupa karboksylowa –COOH
lub grupa sulfonowa –SO3H)
- grupę zasadową (aminową –NH2)
Aminokwasy występujące w przyrodzie to głównie α-aminokwasy.
ε
δ
γ
β
α
R CH2CH2CH2CH2CHCOOH
4
3 NH 1
6
5
2
Węgiel Cα jest węglem asymetrycznym
(za wyjątkiem glicyny wszystkie aminokwasy są optycznie czynne).
1
W przyrodzie większość aminokwasów to L - aminokwasy
COOH
H2N H
R
2
Ponieważ aminokwasy zawierają zarówno grupę kwasową, jaki
i zasadową, ulegają one wewnątrzcząsteczkowej reakcji
kwas-zasada i występują głównie w formie jonu dipolowego,
inaczej jonu obojnaczego (zwitterjonu)
O
H N CH C O H
HR
H
O
H N CH C O
HR
jon obojnaczy
Jony obojnacze aminokwasów są rodzajem wewnętrznych soli
i dlatego charakteryzują się wieloma właściwościami fizycznymi
typowymi dla soli.
Mają duże momenty dipolowe, są rozpuszczalne w wodzie,
ale nierozpuszczalne w węglowodorach,
są substancjami krystalicznymi
o wysokich temperaturach topnienia.
3
Aminokwasy zawierają co najmniej 2 słabo kwaśne grupy: COOH i –NH3+.
W roztworze obie formy występują w równowadze
protonowej:
R COOH
R NH3
R COO
R NH2
+ H
+
H
W pH osocza krwi (7,4), czy przestrzeni śródkomórkowej (7,1)
grupy karboksylowe istnieją prawie całkowicie jako jony
karboksylowe -COOa większość grup aminowych (przy Cα )
występuje w formie protonowanej –NH3+ .
4
To anion karboksylanowy, -COO-, a nie grupa aminowa działa
jako centrum zasadowe i przyłącza proton w roztworze
kwaśnym:
H
O
H N CH C O
HR
jon obojnaczy
+ H3O
H
O
H N CH C OH +
HR
H2O
5
Podobnie, to kation amoniowy, -NH3+,
nie zaś grupa karboksylowa
działa jako centrum kwasowe i oddaje proton w roztworze
zasadowym:
H
O
H N CH C O
HR
jon obojnaczy
+
OH
O
H N CH C O
HR
+
HOH
pK1 - grupa α-COOH
pK2 - grupa α-NH3+
pK3 - grupa w łańcuchu bocznym
6
RCHCOOH
NH3
K1
NaOH
RCHCOO
NH3
NaOH
RCHCOO
NH2
K2
Równanie Hendersona - Hasselbacha
[ zasada ]
pH = pKa + log
[ kwas ]
pH = pKa gdy [zasada] = [ kwas ]
nz
pH = pKa + log n
k
7
RCHCOOH
NH3
kwas 1
1 mol
RCHCOO
NH3
sprzężona zasada
RCHCOO
NH3
kwas 2
RCHCOO
NH2
sprzężona zasada
nz
pH = pKa + log n
k
po dodaniu 0,5 M NaOH
0,5 mol kwas 1 + 0,5 mola zasad.
pH = pK1
po dodaniu 1,5 M NaOH
0,5 mola kwasu2 + 0,5 mola zasad.
pH = pK2
8
Krzywa miareczkowania alaniny
pH
14
12
pK2 = 9,69
10
8
pI = 6,02
6
4
2
pK1 = 2,34
0,5
CH3CHCOOH
NH3
1,0
OH
1,5
2,0
CH3CHCOO
NH3
NaOH [mole]
OH
CH3CHCOO
NH2
9
Punkt izoelektryczny
Punkt izoelektryczy pI to jest takie pH środowiska,
w którym aminokwas jako cała cząsteczka nie jest obdarzona
żadnym ładunkiem.
10
-H
RCHCOOH
NH3
-H
RCHCOO
NH3
+H
A
RCHCOO
NH2
+H
A
A
A
K1 =
H
K2 =
A
A
=
H
K1
A
H
A
A
W punkcie izoelektrycznym, pI
A
A
=
=
A
A
K2
H
11
A
=
A
A
=
A
H
K1
H
2
= K1 K2
A
H
A
K1
=
=
A
K2
H
A
K2
H
H
=
K1 K2
1/2
pH = 0,5 (pK1 + pK2)
pI =
pK1 + pK2
2
pK1 = pK monokationu
pK2 = pK formy dipolarnej
12
Punkt izoelektryczny
Punkt izoelektryczy pI to jest takie pH środowiska,
w którym aminokwas jako cała cząsteczka nie jest obdarzona
żadnym ładunkiem.
pI =
pK1 + pK2
2
pK1 = pK monokationu
pK2 = pK formy dipolarnej
Dla alaniny
pK1 = 2,34
a
pK2 = 9,69
i pI = 12,03 / 2 = 6,02
13
Aminokwasy białkowe:
Aminokwasy obojętne:
Glicyna
Gly
α
CH2 COOH
NH2
kwas 2-aminoetanowy
pK1 = 2,4
Ala
Alanina
3
2
G
1
CH3 CH COOH
NH2
pK1 = 2,4
pK2 = 9,6
pI 5,97
A
kwas 2-aminopropanowy
pK2 = 9,7
pI 6,00
14
Walina
Val
2
1
CH3 3
CH CH COOH
CH3
NH2
4
V
kwas 2-amino-3-metylobutanowy
pK1 = 2,2
Leucyna
pK2 = 9,7
Leu
2
CH3
CHCH CH COOH
CH3 4 3 2
1
NH
2
5
pK1 = 2,3
Egzogenny
L
pI 5,97
Egzogenny
kwas 2-amino-4-metylopentanowy
pK2 = 9,7
pI 5,98
15
Izoleucyna
5
4
3
Ile
2
I
1
CH3CH2CH CH COOH
CH3NH2
pK1 = 2,3
Egzogenny
kwas 2-amino-3-metylopentanowy
pK2 = 9,8
pI 6,02
W przyrodzie występuje:
COOH
H2N
H
H3C
H
CH2CH3
16
Aminokwasy obojętne zawierające grupę hydroksylową
Ser
Seryna
3
2
1
kwas 2-amino-3-hydroksypropanowy
CH2 CH COOH
OH NH2
pK1 = 2,2
Treonina
4
3
pK2 = 9,2
Thr
2
S
pI 5,68
T
1
CH3 CH CH COOH
OH NH2
pK1 = 2,1
pK2 + 9,1
pK3 = ~13
pK3 = ~13
Egzogenny
kwas 2-amino-3-hydroksybutanowy
COOH
pI 5,60
H2N
H
H
OH
CH3
17
Aminokwasy obojętne zawierające siarkę:
Cysteina
3
2
Cys
1
CH2 CH COOH
SH NH2
pK1 = 1,9
C
kwas 2-amino-3-merkaptopropanowy
pK2 = 10,8
pI =
pK3 = 8,3
pK1 + pK3
2
pI 5,07
Cystyna
CH2CHCOOH
S
NH2
S
CH2CHCOOH
NH2
18
Aminokwasy obojętne zawierające siarkę:
Cysteina
3
2
Cys
C
1
CH2 CH COOH
SH NH2
pK1 = 1,9
kwas 2-amino-3-merkaptopropanowy
pK2 = 10,8
pK3 = 8,3
pI 5,07
pI =
Metionina
4
Met
3
2
M
1
CH3 S CH2CH2 CH COOH
NH2
pK1 = 2,1
pK2 = 9,3
pK1 + pK3
2
Egzogenny
kwas
2-amino-4-metylotiobutanowy
pI 5,70
19
Aminokwasy obojętne zawierające 2o atom azotu:
Prolina
N
H
Pro
α
2
COOH
P
pK1 = 2,0
pK2 = 10,6
pI 6,30
1
4-Hydroksyprolina
HO
N
H
COOH
20
Aminokwasy obojętne zawierające układ aromatyczny
lub heteroaromatyczny:
Fenyloalanina
Phe F
Egzogenny
3
2
CH2 CH COOH
NH2
kwas 2-amino-3-fenylopropanowy
pK1 = 1,8
pK2 = 9,2
Tyrozyna
HO
1
Tyr
3
pI 5,48
Y
2
1
CH2 CH COOH
NH2
kwas
2-amino-3-(4’-hydroksyfenylo)propanowy
pK1 = 2,2
pK2 = 9,2
pK3 = 10,1
pI 5,65
21
Aminokwasy kwasowe:
Asp
Kwas Asparaginowy
4
3
2
1
HOOC CH2 CH COOH
NH2
pK1 = 1,9
pK2 = 9,6
Kwas Glutaminowy
5
4
3
2
HOOC CH2 CH2 CH COOH
NH2
pK1 = 2,2
pK2= 9,7
kwas 2-aminobutanodiowy
pK3 = 3,9
Glu
1
D
pI 2,87
E
kwas 2-aminopentanodiowy
pK3 = 4,2
pI 3,22
22
Tryptofan
Trp
W
N
H
pK1 = 2,4
Egzogenny
CH2 CH COOH
NH2
pK2 = 9,4
pI 5,88
23
Asparagina
4
3
Asn
2
N
1
pK1 = 2,1; pK2 = 8,8; pI 5,45
H2N C CH2 CH COOH
O
NH2
Glutamina
5
4
Gln
3
2
1
Q
H2N C CH2 CH2 CH COOH
NH2
O
pK1 = 2,2; pK2 = 9,1; pI 5,65
Jeżeli nie rozróżniamy między kwasem i amidem zaznaczamy:
Asx (B) i Glx (Z)
24
Aminokwasy zasadowe :
Lizyna
Lys
K
kwas 2,6-diaminoheksanowy
H2N CH2(CH2)2CH2 CH COOH
NH2
pK1 = 2,2
pK2 = 9,0
pK3 = 10,6
pI 9,74
Arg R
Arginina
Aminokwas niezbędny dla młodych rozwijających się organizmów
5
4
3
2
1
H2N C NH CH2CH2CH2 CH COOH
NH
NH2
pK1 = 1,8
pK2 = 9,0
pK3 = 12,5
pI 10,76
25
L-5-hydroksylizyna
COOH
H2N
H
CH2
CH2
HO
H
CH2NH2
26
Histydyna
His
H
Aminokwas niezbędny dla młodych rozwijających się organizmów
H
N
pK1 = 1,8
N
CH2 CH COOH
NH2
pK2 = 9,3
pK3 = 6,0
pI 7,64
27
Niektóre niebiałkowe aminokwasy naturalne:
β-alanina
H3N
H2NCH2CH2COOH
O
O
W połączeniu z L-histydyną, 1-metylo- i 3-metylo-L-histydyną
tworzy dipeptydy karnozynę, baleninę i anserynę
obecne w mięśniach różnych zwierząt
H
N
H3N
O
R=
COO
R
CH2
CH2
CH2
N
N
N
HN
Karnozyna
CH3
N
Balenina
CH3
N
Anseryna
28
β-alanina w koenzymie A
NH2
O
N
N
x
HS
O H3C
OH
5
4
N
O
O
CH3
O P O P O
OH
O
OH
O
3
O P OH
N
OH
N
N
1
OH
koenzym A
1
3
4
5
3’-fosforyloadenozyna
kwas pantoinowy
β-alanina
β-merkaptoetyloamina
3+4
kwas pantotenowy
Wit B5
3 + 4 + 5 Panthethein
29
Skręcalność właściwa aminokwasów w wodzie zależy od pH.
Dla aminokwasów obojętnych minimum osiąga w środowisku
obojętnym i rośnie po dodaniu kwasu lub zasady.
aminokwas
L-alanina
L-leucyna
Rozpuszcz.
Temp. [oC]
[α ]D
1M HCl
15
+14,7o
woda
22
+2,7o
3M NaOH
20
+3,0o
6M HCl
26
+15,1o
woda
25
-10,8o
3M NaOH
20
+7,6o
30
Synteza α-aminokwasów
1.
CH3
O
CH3CHCH2CH2COH
kwas
4-metylopentanowy
NH3
nadmiar
1. Br2, PBr3
2. H2O
CH3
O
CH3CHCH2CHCOH
Br
kwas
2-bromo-4-metylopentanowy
O
CH3
CH3CHCH2CHCOH
NH2
(R,S) - leucyna
31
2. Redukcyjne aminowanie α-oksokwasów:
O
CH3CCOOH
kwas
pirogronowy
NH3
NaBH4
CH3CHCOOH
NH2
(R,S) - alanina
32
3. Synteza Streckera
O
CH2CH
NH4Cl / KCN
H2 O
CH2CHCN
NH2
α-aminonitryl
fenyloacetaldehyd
H 3O+
CH2CHCOOH
NH2
(R,S)-fenyloalanina
33
Rozdzielanie R,S-aminokwasów
1 Reakcja z chiralnym kwasem lub zasadą z utworzeniem
mieszaniny diastereoizomerycznych soli,
które następnie rozdziela się przez krystalizację frakcyjną.
2. Metody biologiczne – np.: enzym karboksypeptydaza
selektywnie katalizuje hydrolizę S-amidokwasów,
ale nie R-amidokwasów
34
Reakcje aminokwasów to reakcje obu grup:
karboksylowej i aminowej.
Każda inna obecna grupa może ponadto ulegać
charakterystycznej dla niej reakcji
Np. w wyniku wyczerpującego metylowania grupy aminowej
powstają betainy:
H2NCHCOOH
R
CH3I
(CH3)3NCHCOOH
betaina
R
35
Peptydy
Peptydy są to polimery aminokwasów, w których pojedyncze
jednostki aminokwasowe zwane resztkami aminokwasowymi, są
połączone razem wiązaniami amidowymi.
O
O
-H2O
H2N CH C OH + H2N CH C OH
R
R'
O
O
H2N CH C N CH C OH
R
H R'
dipeptyd
Reakcja powyższa jest jedynie ideogramem.
Pamiętaj: grupa karboksylowa nie reaguje z grupą aminową,
nie jest wydzielana cząsteczka H2O,
grupa karboksylowa musi być zaktywowana
w laboratorium jest to chlorek kwasowy, w naturze jest
aktywowana poprzez kondensację z ATP.
36
Umownie peptydy zapisuje się tak, by
N-końcowy (terminalny) aminokwas
(ten, który ma wolną grupę –NH2) był po lewej stronie,
a C-końcowy (terminalny) aminokwas
(ten, który ma wolną grupę –COOH) był po prawej.
O
O
H2N CH C OH + H2N CH C OH
R
R'
N-końcowy
C-końcowy
O
O
H2N CH C N CH C OH
R
H R'
dipeptyd
wiązanie peptydowe
37
Rysowanie sekwencji aminokwasów w peptydach
O
O
H N CHC OH + H N CHC OH
H R2
H R1
O
O
O
H N CHC N CHC OH + H N CHC OH
H R2
H R3
H R1
O
O
O
H N CH C N CH C N CH C OH
H R2
H R1
H R3
tripeptyd
O
O
O
O
H N CH C N CH C N CH C N CH C
H R2
H R1
H R3
H R4
wiązania peptydowe
38
Aby w prosty sposób zapisać wzór strukturalny peptydu,
powstałego z połączeń grup α-COOH i α-NH2
można najpierw narysować szkielet (zyg-zag):
Dopisać atomy węgla α (Cα) , grupy α-karboksylowe i α-aminowe
O
H2N
H
Cα
N
N
Cα
H
Cα
COOH
O
Dopisać właściwe grupy R i atomy wodoru α do atomów węgla α
H2N
O H R2
Cα
N
Cα
H R1
H
H
N
COOH
Cα
3
R
H
O
39
O
H2N
N
N
R1
H
O
H
R2
O
R4
N
R3
COOH
H
40
Budowa peptydów – wiązania kowalencyjne w peptydach
Wiązanie amidowe:
O
C
O
C
N
N
zahamowana
rotacja
Cα
C
O
H
N
Cα
N
H
Cα
C
O
H
N
Cα
O
C
N
H
Cα
C
O
41
Amidy zasadowość azotu
Azot w amidach nie wykazuje właściwości zasadowych.
R C
O
NH2
R C
O
NH2
Amidy protonowane są na tlenie:
R C
O
NH2
H
R C
O H
NH2
42
Budowa peptydów – wiązania kowalencyjne w peptydach
Wiązanie disulfidowe (RS-SR):
powstaje między resztami cysteinowymi
CyS CyS
Wiązania disulfidowe mogą łączyć dwa samodzielne łańcuchy,
mogą też powstać między resztami cysteinowymi w tym samym
łańcuchu co powoduje powstanie pętli w tym łańcuchu:
CyS-Tyr-Phe-Glu-Asn-CyS-Pro-Arg-Gly-NH2
wazopresyna
43
Ala + Ser
Ala-Ser
i
O
H2NCHCNHCHCOOH
CH2
CH3
OH
Ser-Ala
O
H2NCHCNHCHCOOH
CH2
CH3
OH
alanylo-seryna
Gly-Ala-Ser
Gly-Ser-Ala
serylo-alanina
Gly + Ala + Ser
Ala-Gly-Ser
Ala-Ser-Gly
Ser-Ala-Gly
Ser-Gly-Ala
6 tripeptydów
44
γ
Kwas glutaminowy
β
2
α
HOOC CH2 CH2 CH COOH
5
4
3
NH2 1
α - COOH Glu
np. w sekretynie His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser~
5
CH2COOH
O 3 CH2
NHCHCNHCHCONHCHCO
2
1
CH2
CH2OH
CH(CH3)2
4
γ-COOH
γ-Glu
np.: w glutationie γ - Glu-Cys-Gly
2
O
O
HOOCCHCH2CH2CNHCHCNHCH2COOH
3
4
5
1
CH2SH
NH2
α
β
γ
45
Często w zapisach polipeptydów, jeżeli połączenie następuje
z użyciem grupy funkcyjnej w łańcuchu bocznym ,
tego rodzaju połączenia zaznacza się stosując pionową
kreskę.
Glu
γ - Glu-Cys-Gly
=
Cys
Gly
Cys
Gly
Cys
Gly
forma
zredukowana
S-H
Glu
wiązanie disiarczkowe S-S
forma
utleniona
S-S
Glu
46
γ - Glu-Cys-Gly
O
O
HOOCCHCH2CH2CNHCHCNHCH2COOH
CH2SH
NH2
α
β
γ
Glutation (GSH),
Występuje we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych, jest
najbardziej rozpowszechnionym i najobfitszym tiolem wewnątrzkomórkowym .
Glutation jest najważniejszym nieenzymatycznym czynnikiem
antyoksydacyjnym, jakim dysponuje organizm.
Występuje w każdej komórce organizmu,
szczególnie bogate w jego zasoby są nerki, wątroba i soczewka .
Glutation jako antyoksydant neutralizuje wolne rodniki w wątrobie
i detoksyfikuje pestycydy (nawet do 60%).
Zredukowany glutation jest syntetyzowany w każdej komórce organizmu w
obecności witaminy C i N-acetylocysteiny.
47
Lizyna
ε
δ
γ
β
α
H2N CH2CH2CH2CH2CHCOOH
NH2
α - NH2
Lys
ε- NH2
ε -Lys
48
Często C-końcowy aminokwas zamiast grupy karboksylowej
ma grupę amidową zaznaczamy to dopisując na końcu
polipeptydu –NH2
CyS-Tyr-Phe-Glu-Asn-CyS-Pro-Arg-Gly-NH2
wazopresyna
49
Kwas piroglutaminowy - pGlu
O
N
H
γ
4
3
2
α
β
HOOC CH2 CH2 CH COOH
NH2
Kwas glutaminowy
5
COOH
4
1
HOOC CH2 CH2 CH COOH
NH2
5
O
3
N
H
2
COOH
1
50
Synteza peptydów
Blokowanie- blokuje się wszystkie grupy aminowe i kwasowe,
z wyjątkiem tych które mają ze sobą przereagować.
Na przykład chcemy połączyć alaninę z leucyną,
ale tak by otrzymać Ala-Leu.
W tym celu należy zablokować grupę –NH2 alaniny
i grupę –COOH leucyny,
czyniąc je niereaktywnymi,
następnie utworzyć pożądane wiązanie amidowe
i w końcu usunąć grupy blokujące.
H2NCHCOOH
CH3
H2NCHCOOH
CH2CH(CH3)2
zablokowanie
grupy NH2
zablokowanie
grupy COOH
H2NCHCOOH
CH3
H2NCHCOOH
CH2CH(CH3)2
51
Grupy karboksylowe często blokuje się przez przekształcenie
ich w estry metylowe lub benzylowe.
Blokadę usuwa się przez łagodną hydrolizę wodnym
roztworem NaOH.
52
Osłony grupy aminowej:
1. Grupy aminowe często są blokowane w formie pochodnych
tert –butoksykarbonyloamidowych (BOC, Boc ),
H2NCHCOOH
CH3
+
CH3 O O CH3
CH3C O C O C O CCH3
CH3
CH3
BOC
(CH3CH2)3N
diwęglan di-tert-butylu
CH3 O
CH3C O CNHCHCOOH
CH3
CH3
BOC-Ala
Grupy blokujące BOC wprowadza się łatwo przez
reakcję aminokwasu z diwęglanem di-tert-butylu w reakcji SNAc
(nukleofilowego podstawienia acylu),
a usuwa przez krótkie traktowanie silnym kwasem, takim jak
kwas trifluorooctowy CF3COOH.
53
2. Osłona benzyloksykarbonylowa – Z (Cbo, Cbz)
O
CH2 O C
O
CH2 O C Cl
Benzyloksykarbonyl
Z (Cbo, Cbz)
BzlOCOCl
+ H2NCHRCOOH
H2O
H+
BzOCOCl
NaOH
Z-NHCHRCOONa
Z-NHCHRCOOH
54
Wiązanie peptydowe zwykle tworzy się, działając na
mieszaninę blokowanego kwasu i aminy
dicyklokarbodiimidem (DCC)
DCC działa przez przekształcenie grupy karboksylowej w
reaktywny czynnik acylujący, który ulega dalszemu
nukleofilowemu podstawieniu aminą.
N CN
dicykloheksylokarbidiimid
DCC
55
H2NCHCOOH
CH3
1. utworzenie amidu
2. zdjęcie grupy blokującej
H2NCHCOOH
CH2CH(CH3)2
O
H2NCHC N CHCOOH
CH3 H CH2CH(CH3)2
x
Ala-Leu
Sumując, do syntezy dipeptydu Ala-Leu konieczne jest 5 etapów:
1 i 2 - Grupa aminowa alaniny zostaje zablokowana w formie
pochodnej np. BOC, a grupa karboksylowa leucyny
zostaje zablokowana jako ester np. metylowy.
3 - Dwa blokowane aminokwasy zostają połączone przy użyciu
DCC
4 - Grupę BOC usuwa się za pomocą kwasu
5 - Ester metylowy usuwa się przez hydrolizę zasadową.
56
Automatyczna synteza peptydów :
technika Merrifielda stałego podłoża.
Synteza na podłożu stałym (ang. Solid-phase synthesis) –
sposób przeprowadzania reakcji chemicznej, w którym rosnąca
cząsteczka produktu jest związana na powierzchni ciała stałego,
zwanego podłożem reakcji, matrycą lub fazą, zaś
niskocząsteczkowe substraty znajdują się w roztworze, w którym
znajduje się podłoże.
Synteza z fazą stałą jest wieloetapowym cyklem rekcji, w których
istotne jest filtrowanie fazy stałej i związanego z nią produktu.
Zadaniem podłoża jest z jednej strony uproszczenie
wyodrębniania produktu po zakończonej syntezie, a z drugiej
precyzyjna kontrola jej przebiegu.
57
Określenie struktury peptydów
Oligopeptydy – do 10 aminokwasów
di-, tri-, tetra-, pentapeptyd itd
Polipeptydy –
Białka – Mcz > 10 000 > 10 kdal
> ~100 aminokwasów
58
Określenie struktury peptydów
Przed analizą peptyd zostaje rozłożony na składowe
aminokwasy
– w wyniku redukcji wszystkich wiązań disulfidowych
i hydrolizy wszystkich wiązań amidowych.
Otrzymaną mieszaninę aminokwasów analizuje się następnie
przy pomocy chromatografii jonowymiennej.
Różne aminokwasy migrują w dół kolumny z różną
prędkością, zależnie od struktury,
i są rozdzielane, w miarę jak wychodzą
(eluują) z kolumny.
59
Każdy aminokwas po elucji z kolumny miesza się z
roztworem np. ninhydryny.
Intensywność zabarwienia jest rejestrowana przez
spektrometr
i otrzymuje się wykres zależności absorbancji od czasu elucji.
Zastosowanie ninhydryny pozwala na wykrycie 10 nmoli
danego aminokwasu.
Zastosowanie fluoreskaminy pozwala na wykrycie 10 pmoli
danego aminokwasu.
O
OH
O
OH
O
ninhydryna
O
O
O
fluoreskamina
60
Analiza składu aminokwasowego pozwala wyznaczyć ilość
każdego aminokwasu w peptydzie, ale nic nie mówi o
kolejności ich ułożenia.
Np.: skład aminokwasowy oligopeptydu
Ala-Gly-Ser-Cys-Ala-Glu-Lys-Gly-Ser-Phe
jest następujący:
(Ala2,Cys,Gly2,Glu,Lys,Phe,Ser2 )
gdzie nawias i przecinki między aminokwasami oznaczają,
że mamy do czynienia ze składem aminokwasowym a nie
sekwencją.
61
Sekwencjonowanie peptydów.
Struktura pierwszorzędowa białek – sekwencja aminokwasów –
ustalenie kolejności w jakiej aminokwasy są ze sobą połączone
Ustalenie N-końcowego aminokwasu:
przeprowadza się reakcję białka ze związkiem tworzącym
stabilne wiązanie kowalencyjne z wolną grupą NH2
N-końcowego aminokwasu zanim białko to zostanie poddane
hydrolizie w 6M HCl.
62
1. Metoda Sangera
NO2
O 2N
F
+
O
H2NCHCN peptyd
R H
2,4-dinitrofluorobenzen
NO2
O
NHCHCN peptyd
R H
O 2N
H3O
NO2
O2N
NHCHCOOH
R
pochodna N-2,4-dinitrofenylowa
+
aminokwasy
63
2. Degradacja Edmana
NC S
H2NCHCO NHCHCO~~itd
R
R'
+
fenyloizocyjanian
S
NH C NHCHCO NHCHCO~~itd
R
R'
S
C
N NH
C CH
O R
+
OH- , pH 9
H+
lekko kwaśne
H2NCHCO~~itd
R'
fenylohydantoina
itd. skrócone białko poddane jest kolejnej reakcji z fenyloizocyjanianem.
Zautomatyzowana technika - do 50 aminokwasów.
Aby ustalić sekwencję dużego białka należy je najpierw rozszczepić na
mniejsze fragmenty.
64
3. Częściowa hydroliza – można przeprowadzić na drodze
chemicznej (wodnym roztworem kwasu). Ta hydroliza kwasowa
jest nieselektywna i prowadzi do przypadkowej mieszaniny
małych fragmentów.
Specyficzne rozszczepienie można osiągnąć metodami
chemicznymi lub enzymatycznymi.
Np. bromocyjan ( CNBr ) rozcina łańcuchy polipeptydowe po
stronie karboksylowej metioniny Met.
A enzymy:
Trypsyna katalizuje hydrolizę jedynie po stronie karboksylowej
zasadowych aminokwasów argininy i lizyny ( Arg, Lys )
Chymotrypsyna rozszczepia peptyd jedynie po stronie
karboksylowej aminokwasów podstawionych grupą arylową,
takich jak fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan
( Phe , Trp, Tyr ).
65
Val-Phe-Leu-Met-Tyr-Pro-Gly-Trp-Cys-Glu-Asp-Ile-Lys-Ser-Arg-His
Te wiązania rozszczepia
chymotrypsyna
Te wiązania
trypsyna
66
x
Sekwencjonowanie peptydów – oznaczanie reszty C-końcowej
Analizę wykonuje się przez inkubowanie polipeptydu z
karboksypeptydazą i śledzenie, jaki aminokwas pojawia się w
roztworze jako pierwszy.
Enzym karboksypeptydaza hydrolizuje wiązanie amidowe
C-końcowego aminokwasu.
67
Ustalamy strukturę angiotensyny II, hormonu oktapeptydowego
biorącego udział w kontrolowaniu ciśnienia krwi przez
regulowanie równowagi sodowo-potasowej w organizmie
1. Analiza aminokwasowa angiotensyny II wykazuje obecność 8
różnych aminokwasów w równoważnych ilościach molowych:
Arg, Asp, His, Ile, Phe, Pro, Tyr i Val
2. Analiza N-końcowa metodą Edmana wykazuje, że
angiotensyna II ma na N-końcu kwas asparaginowy Asp.
3. Częściowa hydroliza rozcieńczonym kwasem solnym dałaby
na przykład następujące fragmenty, których sekwencję można
by oznaczyć za pomocą degradacji Edmana:
Arg-Val-Tyr
Val-Tyr-Ile
Ile-His-Pro
Asp-Arg-Val
Pro-Phe
68
4. Dopasowanie nakładających się regionów różnych
fragmentów prowadzi do pełnej sekwencji angiotensyny II
Arg-Val-Tyr Asp-Arg-Val Ile-His-Pro Pro-Phe
Asp N-końcowa
Val-Tyr-Ile
Asp-Arg-Val
Arg-Val-Tyr
Val-Tyr-Ile
Ile-His-Pro
Pro-Phe
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
69
Pewien nonapeptyd w wyniku całkowitej hydrolizy dał:
Arp,Asp,Glu,Gly,Lys,Phe2,Val2
rozszczepiany najpierw chymotrypsyną i daje następujące
peptydy:
Asp-Lys-Gly-Phe
Val-Phe
Val-Glu-Arg
Ten sam nonapeptyd rozszczepiany trypsyną daje:
Gly-Phe-Val-Glu-Arg
oraz
Val-Phe-Asp-Lys
Następnie nakładamy na siebie otrzymane peptydy.
70
Asp-Lys-Gly-Phe
Gly-Phe-Val-Glu-Arg
Val-Phe
Val-Glu-Arg
Val-Phe-Asp-Lys
Asp-Lys-Gly-Phe
Gly-Phe-Val-Glu-Arg
Val-Glu-Arg
?
71
Asp-Lys-Gly-Phe
Gly-Phe-Val-Glu-Arg
Val-Phe
Val-Glu-Arg
Val-Phe-Asp-Lys
Val-Phe
Val-Phe-Asp-Lys
Asp-Lys-Gly-Phe
Gly-Phe-Val-Glu-Arg
Val-Glu-Arg
Val-Phe-Asp-Lys-Gly-Phe-Val-Glu-Arg
peptydy trypsynowe
Val-Phe-Asp-Lys-Gly-Phe-Val-Glu-Ar
peptydy chymotrypsynowe
72
Budowa przestrzenna peptydów
N
H
Cα
C
O
H
N
Cα
O
C
N
H
Cα
C
O
N
H
Cα
C
O
H
N
Cα
O
C
N
H
Cα
C
O
Struktura drugorzędowa białka –
regularne pofałdowanie regionów łańcucha
Struktury łańcucha peptydowego zaproponowane w 1951
przez Paulinga i Coreya:
helisa α i harmonijka β -najczęściej występujące.
73
Struktura białek
Struktura pierwszorzędowa – sekwencja aminokwasów
Struktura drugorzędowa – jak segmenty łańcucha
polipeptydowego przyjmują pewien regularny sposób
ułożenia: helisa α , harmonijka β, zwrot β, beczułka β
Struktura trzeciorzędowa – odnosi się do sposobu, w jaki
cała cząsteczka zwija się, przyjmując ostateczny kształt.
Łańcuch polipeptydowy fałduje się spontanicznie w ten
sposób, że większość jego hydrofobowych łańcuchów
bocznych zostaje skierowana do wnętrza powstającej
struktury, a większość jego polarnych, obdarzonych
ładunkiem łańcuchów bocznych znajduje się na jej
powierzchni.
74
Struktura czwartorzędowa – opisuje sposób, w jaki kilka
cząsteczek białka łączy się, tworząc większe agregaty
Denaturacja białek – zniszczenie drugo- i trzeciorzędowej
struktury białka, pod wpływem np.:
temperatury, zmiany pH, detergentów,
rozpuszczalników organicznych, promieniowania jonizującego.
75
Białka
Klasyfikacja białek
Białka proste – te które w wyniku hydrolizy dają jedynie
aminokwasy
np.: miozyna, albumina, kolagen, keratyna
Białka złożone –proteidy- dają po hydrolizie także inne związki
( np.: węglowodany, tłuszcze, kwasy nukleinowe)
ten fragment niepeptydowy nosi nazwę
grupy prostetycznej
Grupa prostetyczna jest powiązana ze specyficzną biologiczną
funkcją białka.
76
Zależnie od ich trójwymiarowej postaci:
Białka fibrylarne (włókienkowe) – składają się z
łańcuchów polipeptydowych ułożonych obok siebie w
długie włókna ( kolagen, keratyna)
Ponieważ te białka są odporne i nierozpuszczalne w
wodzie, są one w naturze używane do budowy tkanek
konstrukcyjnych (ścięgna, kopyta, rogi, mięśnie)
Białka globularne (kłębuszkowe) – zwykle są
zwinięte w zwarty, w przybliżeniu kulisty kształt.
Białka te są zasadniczo rozpuszczalne w wodzie i
swobodnie przemieszczają się w obrębie komórki.
Większość ( z ~2000) znanych enzymów jest globularna.
77
Narysuj tetrapeptyd Ala-Ser-Gly-Ala
Ala - kwas 2- aminopropanowy
Gly – kwas aminooctowy
Ser – kwas 2-amino-3-hydroksypropanowy
Ala – aminokwas N-końcowy
O
O
H2NCHCOH
O
H2NCHCOH
H2NCH2COH
CH2OH
CH3
O
O
CH2OH
H2NCHCOH
CH3
O
H2NCHCNHCHCNHCH2CNHCHCOOH
CH3
O
CH3
wiązanie
peptydowe
78
Napisz wzór tego tetrapeptydu przy pH=2; pH=pI i pH=13.
O
pH = 2
O
CH2OH
O
CH 3
O
CH3CHCNHCHCNHCH 2CNHCHCOO
NH3
pH = 13
O
CH3CHCNHCHCNHCH 2CNHCHCOOH
NH3
pH = pI
O
O
CH2OH
O
CH3
O
CH3CHCNHCHCNHCH 2CNHCHCOO
NH2
CH2OH
CH3
79