ZERANOL ELISA [ZR 2421]

Transkrypt

ZERANOL ELISA
PRZEZNACZENIE
Służy do ilościowego określenia poziomu Zeranolu w warunkach in vitro w próbkach moczu, mięśni, wątroby i nerek.
Nr Kat.
ZR 2421 Płytka Mikrotitracyjna
12 x 8 wgłębień
Bufor Rozcieńczająco-Myjący (Stęż.)
1 x 32 ml
Konjugat (Stęż.)
1 fiolka
Rozcieńczalnik Konjugatu
1 x 10 ml
Standardy
6 x 2 ml
Substrat Jednoodczynnikowy
1 x 15 ml
Roztwór Zatrzymujący Reakcję
1 fiolka
ZESTAW AKCESORIÓW
Kolumienki do Rozdzielania na Podstawie Powinowactwa
Immunologicznego dla Zeranolu, Nr Kat. ZR2420
ZASADA
Płytka mikrotitracyjna jest dostarczana z wgłębieniami, które
zostały uprzednio opłaszczone przeciwciałami prze-ciwko
zeranolowi. Zeranol (antygen), jeżeli występuje
w standardzie lub próbce, współzawodniczy o ograniczoną
liczbę miejsc wiązania przeciwciał na płytce mikrotitracyjnej ze znakowanym peroksydazą (z chrzanu) zeranolem
(antygenem znakowanym enzymem). Po okresie inkubacyjnym, który zachodzi w temperaturze pokojowej i umożliwia zajście reakcji współzawodniczenia, płytka mikrotitracyjna jest myta w celu usunięcia nadmiaru odczynników.
Dodawane są substrat enzymatyczny oraz chromogen
i po okresie inkubacyjnym, którego celem jest umożliwienie
maksymalnego rozwoju reakcji barwnej, reakcja ta jest
zatrzymywana przez dodanie roztworu zatrzymującego
reakcję, co powoduje uzyskanie zmiany koloru z niebieskiego na żółty. Następnie mierzone są absorbancje przy
długości fali 450 nm.
Na podstawie wyników pomiaru wyznaczana jest krzywa
wzorcowa służąca do określenia stężenia zeranolu w próbce.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Mocz
1. Odwirowywać próbkę moczu przy prędkości 4000
obr./min przez 10 minut.
2. Odwirowany mocz rozcieńczyć 10-krotnie w rozcieńczonym buforze rozcieńczająco-myjącym ELISA (MIX)
np. 50 μl moczu + 450 μl buforu
Próbka jest teraz gotowa do zastosowania w płytce
mikrotitracyjnej.
Mięsień
1. Przeprowadzać homogenizację 5g próbki przy użyciu
10 ml 50 mM buforu octanu sodu pH4.8 przez około 30
sekund.
2. Mieszać przy użyciu Vortexu przez 3 minuty.
3. Wziąć 3 g produktu homogenizacji i dodać 16 ml tertbutylometyloeteru (TBME).
4. Mieszać przy użyciu Vortexu przez 3 minuty i odwirowywać przez 10 minut przy 2000 obr./min.
5. Usunąć warstwę TBME i odparowywać do uzyskania
stanu suchego w szklanej probówce pod strumieniem
powietrza przy 40°C.
6. Ponownie uzyskać zawiesinę ekstraktu w 1 ml dichlorometanu.
8. Dodać 3 ml 1M NaOH i mieszać przy użyciu Vortexu
przez 3 minuty.
9. Odwirowywać przez 10 minut przy 2000 obr./min.
10. Zdjąć i zachować warstwę wodną.
11. Zneutralizować warstwę wodną przez dodanie 300 μl
6M kwasu fosforowego.
12. Mieszać przy użyciu Vortexu przez 3 minuty. Próbka
jest teraz gotowa do dodania do kolumienki C18 albo
do kolumienki do rozdzielania na podstawie powinowactwa immunologicznego (ZR2420).
7.
Odparowywać do uzyskania stanu suchego pod strumieniem powietrza przy 40°C.
8. Ponownie uzyskać zawiesinę ekstraktu przy użyciu 0.5
ml rozcieńczonego buforu rozcieńczająco-myjącego,
wcześniej ogrzanego do 40°C.
10. Próbka jest teraz gotowa do dodania do płytki
ELISA.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI I OSTRZEŻENIA
Tylko do prowadzenia badań diagnostycznych w warunkach in vitro. Nie pipetować przy użyciu ust. Zachować typowe środki ostrożności obowiązujące przy kontakcie z odczynnikami stosowanymi w warunkach laboratoryjnych.
Bufor rozcieńczająco-myjący zawiera środek konserwu-jący.
Unikać połknięcia lub kontaktu ze skórą albo błonami
śluzowymi.
Na żądanie dostępne są arkusze danych dotyczących
zdrowia i bezpieczeństwa Health and Safety Data Sheets.
Odczynniki mogą być używane tylko zgodnie z ich przeznaczeniem, przez odpowiednio wykwalifikowany
personel laboratoryjny, w odpowiednich warunkach
laboratoryjnych.
Wątroba/Nerka
1. Przeprowadzać homogenizację 5 g próbki przy użyciu
10 ml 50mM buforu octanu sodu pH4.8 i 5000
jednostek ϑ-glucuronidazy przez 30 sekund.
3. Inkubować przez 2 godziny przy 37°C.
4. Postępować zgodnie z procedurą ekstrakcji próbki
mięśnia zaczynając od kroku 3.
Procedura dla kolumienki C18
1. Kolumienkę przepłukać przy użyciu 2 ml 100%
metanolu.
2. Kolumienkę zrównoważyć przy użyciu 2 ml 50mM
octanu sodu jako buforu pH4.8.
3. Dodać próbkę.
4. Przepłukać kolumnę przy użyciu 2 ml 50mM octanu
sodu jako buforu pH4.8.
5. Przepłukać kolumnę przy użyciu 2 ml 40% metanolu
/60% wody.
6. Przeprowadzić elucję do szklanej probówki przy użyciu 1 ml 80% metanolu/20% wody.
ΑΒΧ
INSTRUKCJA - ZERANOL ELISA - ZR 2421
STABILNOŚĆ I PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW
REAKCJI
Płytka Mikrotitracyjna
Dostarczana w postaci gotowej do użycia. Zachowuje
stabilność do upływu daty ważności, pod warunkiem, że jest
przechowywana w temperaturze w zakresie od +2
do +8°C. Jeżeli używana jest tylko część płytki, pozostałe
paski należy odłożyć do foliowej torebki zaciskowej
ze środkiem osuszającym i szczelnie zamknąć, zwracając
uwagę na usunięcie nadmiaru powietrza.
STRONA 2 Z 4
przechowywany w temperaturze w zakresie od +2 do +8°C.
Bufor Rozcieńczająco-Myjący (Stężony)
Rozcieńczyć zawartość jednej fiolki buforu rozcieńczającomyjącego przy użyciu 970 ml podwójnie destylowanej H2O.
Zachowuje stabilność przez 30 dni w zakresie temperatur
od +2 do +8°C.
Konjugat (Stężony)
Prosimy zapoznać się z arkuszem rozcieńczania konjugatu,
gdzie podano dokładne zalecenia dotyczące rozcieńczania.
Konjugat należy rozcieńczać zgodnie z potrzebami.
Konjugat należy chronić przed działaniem światła.
Zachowuje stabilność do upływu daty ważności, pod warunkiem, że jest przechowywany w temperaturze w zakresie od +2 do +8°C.
Standardy
Odtworzyć zawartość każdej fiolki standardu przy użyciu
2 ml rozcieńczonego buforu oznaczenia. Odstawić
i odczekać 20 minut. Zamieszać przez odwrócenie każdej
fiolki, aby upewnić się, że wszelkie ślady zamrożonego,
suchego materiału zostały rozpuszczone. Odtworzone
standardy zachowują stabilność przez co najmniej 24 dni
pod warunkiem, że są przechowywane w temperaturze
w zakresie od +2 do +8°C.
Dostarczony w postaci gotowej do użycia. Zachowuje
stabilność do upływu daty ważności, pod warunkiem,
że jest przechowywany w temperaturze w zakresie
od +2 do +8°C. Nie zawiera żadnych szkodliwych rozpuszczalników organicznych.
Dostarczany w postaci gotowej do użycia. Zachowuje stabilność do upływu daty ważności, pod warunkiem, że jest
RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY
Tel:CRUMLIN (028)94422413 Fax.No.INT.44 (028)94452912 UK (028)94452912
Email: [email protected] Website: www.randox.com
DOSTARCZONE MATERIAŁY
Płytka Mikrotitracyjna
Bufor Rozcieńczająco-Myjący (Stężony)
Konjugat (Stęż.)
Standardy
POTRZEBNE MATERIAŁY, KTÓRE NIE SĄ
DOSTARCZONE
Czytnik płytek mikrotitracyjnych (450 nm)
Pipety : od 5 μl do 1000 μl
Uszczelniacze do płytek
Metoda mycia płytek
Możliwość mieszania przy użyciu Vortexu
Blok grzewczy ze strumieniem powietrza
Wyciąg laboratoryjny
Octan sodu (AnalaR)
Wodorotlenek sodu (AnalaR)
Dichlorometan (AnalaR)
tert-Butylometyloeter (99.8%, stopnia HPLC)
Kwas fosforowy (AnalaR)
ϑ-Glukuronidaza (Sigma GO 876)
Kolumienki typu Bakerbond C18 (Baker 7020-01)
Rura podciśnieniowa do ekstrakcji C18
UWAGI DOTYCZĄCE PROCEDURY
1. Zaleca się, aby wszystkie odczynniki przed użyciem
zostały przeniesione do temperatury pokojowej (od +19
do 25°C).
2. W celu zminimalizowania efektów brzegowych w wyniku
parowania zaleca się użycie przylepnych uszczelniaczy
płytek lub folii przylegającej.
3. Odczynniki należy dokładnie zmieszać przez użyciem
przez delikatne wstrząsanie lub zawirowanie. Nie spowodować spienienia.
4. Wszystkie próbki, materiał kontrolny I standardy powinny
zostać użyte współbieżnie w duplikacie, tak aby wszystkie warunki badania były takie same.
5. Zasadnicze znaczenie ma ścisłe stosowanie się do wymagań dotyczących czasu I temperatury oznaczenia.
6. Należy starannie myć płytki mikrotitracyjne, ponieważ
nieprawidłowe mycie może spowodować niską dokładność.
Α
ΑΒΧ
STRONA 3 Z 4
a. Pipetować do odpowiednich wgłębień płytki mikrotitracyjnej:
Standard
Próbka
Q.C.
Rozcieńcz. bufor
rozcieńcz.-myjący
50 μl
50 μl
50 μl
Standard
50 μl
-
-
Próbka
-
50 μl
-
Kontrola Jakości QC
-
-
50 μl
Konjugat (rozcieńcz.)
25 μl
25 μl
25 μl
b. Płytkę mikrotitracyjną delikatnie ostukiwać przez kilka
sekund z obu stron.
c) Płytkę mikrotitracyjną przykryć folią przylepną przed
przeprowadzeniem inkubacji trwającej przez 1 godz.
w temperaturze pokojowej (od +19 do +25°C) w ciemności.
d) Odwrócić płytkę i wystukać płyn.
e) Myć płytkę mikrotitracyjną 6 razy przez okres 10-15
minut przy użyciu rozcieńczonego buforu rozcieńczająco-myjącego (po upewnieniu się, że każde wgłębienie
jest napełnione). Po końcowym myciu wystukać na bibułkę do całkowitego wysuszenia.
f) Natychmiast po myciu przeprowadzić pipetowanie
po 125 μl roztworu substratu jednoodczynnikowego
do każdego wgłębienia przy użyciu wielokanałowej
pipety. Delikatnie wypukać płytkę mikrotitracyjną
ze wszystkich stron oraz przeprowadzać inkubację przez
20 ± 2 minut w temperaturze pokojowej (od +19 do
+25°C) w ciemności.
g) Zatrzymać rozwój reakcji barwnej przez dodanie po 100
μl roztworu zatrzymującego reakcję na wgłębienie.
Powinna być wyraźnie widoczna zmiana koloru z niebieskiego na żółty.
h) Zmierzyć gęstość optyczną przy 450 nm.
Α
ΑΒΧ
STRONA 4 Z 4
KRZYWA WZORCOWA I INTERPRETACJA WYNIKÓW
a. Obliczyć średnie absorbancje standardów, materiału
kontrolnego i próbek.
b. Wykreślić absorbancje standardów względem log10
wartości stężeń tych standardów w ng/ml.
c. Dla zmierzonych absorbancji prób badanych i kontrolnych z krzywej wzorcowej odczytać odpowiadające im
stężenia tych prób w ng/ml.
d. Aby uwzględnić rozcieńczenie próbek moczu, wyniki
wyznaczone z krzywej wzorcowej należy pomnożyć
przez 10.
e. W celu przeprowadzenia konwersji z ng/ml na ng/g
dla próbek tkankowych, wyniki z krzywej wzorcowej
należy pomnożyć przez 0.8.
WYNIKI DODATNIE NALEŻY POTWIERDZIĆ INNĄ
METODĄ.
SPECYFICZNOŚĆ
Reakcyjności krzyżowe przeciwciała przeciwko zeranolowi
podano w tabeli zamieszczonej poniżej:
ZWIĄZEK
% REAKCYJNOŚCI
KRZYŻOWEJ
Zeranol
100
Zeralanon
80
Ι-Zeralenol
65
Zeralenon
20
ϑ-Zeralanol
4
ϑ-Zeralenol
1
WARTOŚCI PROGOWE CZUŁOŚCI
Mocz:
2.5 ppb (części na miliard)
Tkanka:
0.5 ppb
Wydanie poprawione 22/05/03 wpt
Α
ΑΒΧ

ZERANOL ELISA [ZR 2421]

Transkrypt

Podobne dokumenty

Sprawozdanie z potencjometrii Ćw. 1. Pomiar pH elektrodą szklaną.

TESTOSTERONE (SERUM) - For veterinary applications only

Elektorforeza białek surowicy krwi

Nr katal

Syngen Milk DNA Mini Kit

Oxal VP IT - MC Bauchemie

Analityka Medyczna - zagadnienia na egzamin 2016

Silniejsza koordynacja wsparcia rozwoju