ekspresja β1 integryny i witronektyny w

Nowiny Lekarskie 2006, 75, 2, 146–151
KATARZYNA SMYKAŁ, ALEKSANDRA ROCHOWIAK, ANNA KUBIAK, ZOFIA I. NIEMIR
EKSPRESJA Β1 INTEGRYNY I WITRONEKTYNY
W KŁĘBUSZKACH NERKOWYCH CHORYCH NA KŁĘBUSZKOWE ZAPALENIE NEREK
THE EXPRESSION OF Β1 INTEGRIN AND VITRONECTIN IN HUMAN GLOMERULONEPHRITIS
Pracownia Nefrologii Molekularnej przy Katedrze i Klinice Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych
Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik Pracowni: dr hab. n. med. Zofia I. Niemir
Kierownik Katedry i Kliniki: prof. dr hab. med. Stanisław Czekalski
Streszczenie
Wstęp. Dotychczasowe badania wykazały, iż integryna β1 reguluje proliferację, migrację i apoptozę różnych typów komórek, jak również
obrót macierzy pozakomórkowej. W połączeniu różnymi typami podjednostek α integryn (α1-11, αV), β1 integryna stanowi receptor dla
białek macierzy pozakomórkowej, takich jak: kolagen, fibronektyna, laminina oraz witronektyna (VT).
Cel. Celem naszych badań była analiza ekspresji β1 integryny oraz VT w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenia nerek
(KZN).
Metodyka. Badaniami objęto 38 chorych z różnymi formami kłębuszkowego zapalenia nerek. Materiał kontrolny stanowiło 5 fragmentów
prawidłowych morfologicznie nerek pozyskanych z okolic wyciętego guza nerki. Oceny ekspresji badanych antygenów dokonano za pomocą immunohistochemii z użyciem trójstopniowej metody APPAP. CD31 użyto jako markera komórek śródbłonka.
Wyniki i wnioski. W zdrowych kłębuszkach, ekspresja β1 integryny miała charakter rozlany i dotyczyła wszystkich komórek kłębuszka
nerkowego. Ekspresję VT obserwowano na komórkach śródbłonka i na komórkach mezangialnych kłębuszka nerkowego. Porównywalną do
nerki zdrowej ekspresję β1 integryny i VT stwierdzono w kłębuszkach z łagodną lub umiarkowaną proliferacją komórek mezangialnych.
Natomiast zaobserwowano wyraźny spadek ekspresji obu molekuł w kłębuszkach z dużym rozplemem komórek mezangium, jak również
z zaawansowanym procesem sklerotyzacji. Stwierdzono linijną zależność pomiędzy ekspresją VT i CD31, jak również β1 integryny i CD31
w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN (r = 0,72, p < 0,01 oraz r = 0,72, p < 0,0005). Ekspresja β1 integryny korelowała również z
ekspresją VT w kłębuszkach nerkowych (r = 0,42, p < 0,05) i była zróżnicowana w zależności od aktywności procesu zapalnego w kłębuszku. Nasze wyniki sugerują udział β1 integryny jako istotnego receptora dla VT w kłębuszku nerkowym. Spadek ekspresji β1 integryny i VT
wraz z postępującym procesem zapalnym dotyczy głównie komórek mezangialnych. Wskazuje to na zaangażowanie tych białek w utrzymanie integralności struktury kłębuszka nerkowego.
SŁOWA KLUCZOWE: kłębuszkowe zapalenie nerek, β1 integryna, witronektyna, CD31.
Summary
Introduction. Recent results have shown that β1 integrin regulates proliferation, migration and apoptosis of different types of cells, as well as
turnover of the extracellular matrix. Coupled with various types of α integrin subunits (α1-11, αv), β1 integrin can serve as a receptor for extracellular matrix proteins, such as: collagen, fibronectin, laminin and vitronectin (VT).
Aim. In this study, we analyzed the glomerular expression of β1 integrin and VT in the renal tissue with glomerulonephritis (GN).
Methods. Thirty-eight patients with different forms of GN were enrolled into the study. Five normal kidneys (NK) served as controls. Immunohistochemistry with the use of APPAP (Alkaline Phosphatase – anti-Alkaline Phosphatase) method was employed to evaluate the expression of
the examined peptides. CD31 was used as a marker of endothelial cells.
Results and conclusions. In the normal glomerulus, a wide-spread expression of β1 integrin was observed. The expression of VT could be
confined to endothelial and mesangial cells. In GN, compared to NK, the immunoreactivity for β1 integrin and VT was preserved in glomeruli with minor-to-mild proliferation of mesangial cells. But the expression of both peptides was markedly reduced in mesangial areas
of glomeruli with marked proliferative response of glomerular cells, as well as in those with advanced sclerotic alterations. In general, a
linear relationship between the expression of VT and CD31, as well as β1 integrin and CD31 could be stated in GN (r = 0.72, p < 0.01 and r
= 0.72; p < 0.0005, respectively). Although also the immunoreactivity for β1 integrin and VT was positively related with that for VT in GN
(r = 0.42, p < 0.05), the expression of these peptides varied and seemed to be related with the activity of the glomerular inflammation. Our
results seem to indicate that β1 integrin is an important receptor for VT in the glomerulus. Since the reduction in the reactivity for β1 integrin
and VT during the progression of GN concerns mainly the glomerular mesangium, the engagement of these proteins in fulfilling the supportive function for mesangial cells may be suggested.
KEY WORDS: glomerulonephritis, β1 integrin, vitronectin, CD31.
Wstęp
Kłębuszek nerkowy stanowi unikalną strukturę, która
pozwala mu na pełnienie ważnej funkcji, jaką jest oczysz-
czanie krwi w mechanizmie filtracji. W skład kłębuszka
nerkowego wchodzą elementy komórkowe, takie jak:
komórki mezangialne, komórki śródbłonka i podocyty
oraz macierz pozakomórkowa. Wzajemne interakcje
Ekspresja β1 integryny i witronektyny w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenie nerek
między komórkami i składnikami macierzy pozakomórkowej: kolagenem, fibronektyną czy witronektyną (VT)
są możliwe dzięki integrynom [1].
Integryny to niekowalnecyjnie połączone heterodimeryczne cząsteczki adhezyjne, które składają się z hydrofobowej części przezbłonowej oraz części zewnątrz- i wewnątrzkomórkowej. Część cytoplazmatyczna wykazuje
aktywność enzymatyczną, łączy się za pomocą białek pośredniczących z cytoskeletonem oraz szeregiem kinaz, co
warunkuje przekazanie sygnału z otoczenia do wnętrza
komórki [1]. Szczególną rolę w regulacji proliferacji, migracji, apoptozie komórek, jak i obrocie macierzy pozakomórkowej przypisuje się β1 integrynie. W połączeniu
z różnymi podjednostkami α integryn stanowi ona receptor
dla białek macierzy pozakomórkowej (np.: α1β1 – dla
kolagenu typu IV i lamininy; α5β1 – dla fibronektyny czy
wspomniany poprzednio α8β1 – dla VT) [1, 2].
Z przeprowadzonych dotychczas badań wynika, że ekspresja β1 integryny w zdrowej nerce jest zależna od towarzyszącego jej typu podjednostki α. Kagami i wsp. wykazali
ekspresję β1 integryny na komórkach mezangialnych
(głównie α1-3β1, α8β1), komórkach śródbłonka (α1β1,
α3β1), podocytach (α3β1) oraz w mniejszym stopniu na
komórkach nabłonka cewek nerkowych [1]. Główną rolę w
regulacji syntezy β1 integryny przypisuje się transformują-
147
VT stanowi ligand dla kompleksu αVβ3 integryn
(CD51/CD61), którego ekspresję wykazano na podocytach
[7]. Ostatnie badania wskazują jednak, iż sekwencja ArgGly-Asp umożliwia interakcje VT z innym receptorem,
jakim jest kompleks integryn α8 z β1 [9]. Kagami i wsp.
potwierdzili obecność tego kompleksu na powierzchni
komórek mezangialnych [10]. Podobną lokalizację VT
wykazały nasze poprzednie badania [7].
Ze względu na istniejące rozbieżności, co do roli β1 integryn oraz VT w procesie zapalnym toczącym się w kłębuszku nerkowym celem naszej pracy była analiza ekspresji
obu molekuł w materiale biopsyjnym pochodzącym od
chorych na KZN.
Materiały i metody
Badaniem objęto 38 chorych z potwierdzonym morfologicznie rozpoznaniem KZN. Wśród badanych u 28 zdiagnozowano mezangialne rozplemowe KZN (MesPGN), u 5
błoniasto-rozplemowe KZN (MPGN), u 3 ogniskowe –
segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS)
oraz u 2 błoniaste KZN (IMGN). Dane kliniczne i biochemiczne chorych zostały przedstawione w tabeli 1. Podstawą
rozpoznania KZN stanowiło badanie morfologiczne skrawka nerki w mikroskopie świetlnym wraz z wynikami badania immunopatologicznego. Do badań własnych użyto
Tab. 1. Dane kliniczne i biochemiczne chorych na KZN
Morfologia
Liczba chorych
MesPGN
MPGN
FSGS
IMGN
28
5
3
2
Wiek
lata
(średnia ± SD)
40,63 ± 8,55
48,00 ± 9,25
32,28 ± 3,15
54,80 ± 6,20
Stężenie kreatyniny
w surowicy (µmol/l)
(średnia ± SD)
146,25 ± 40,23
164,65 ± 70,25
105,10 ± 38,65
180,40 ± 60,05
Białkomocz g/24h
(średnia ± SD)
3,2 ± 2,15
3,5 ± 1,80
1,2 ± 0,32
6,00 ± 2,40
MesPGN: mezangialne rozplemowe kłębuszkowe zapalenie nerek; MPGN: błoniasto-rozplemowe kłębuszkowe zapalenie nerek;
FSGS: ogniskowe – segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych; IMGN: błoniaste kłębuszkowe zapalenie nerek.
cemu czynnikowi wzrostu β (TGF-β) [3]. Baraldi i wsp.
wskazali także na czynnik martwicy nowotworów α (TNFα) oraz interferon γ (INF-γ), jako inne czynniki modulujące
ekspresję tej integryny na różnych typach komórek [4].
Przeprowadzone dotychczas badania nie pozwalają jednoznacznie określić wpływu β1 integryny na przebieg
zmian zapalnych w kłębuszku nerkowym. Cook i wsp.
sugerują, że kompleks α1β1 integryn jest czynnikiem promującym proces włóknienia i pogorszenia funkcji kłębuszka nerkowego [5]. Natomiast, według Chena i wsp., kompleks α1β1 integryn zapobiegał uszkodzeniu komórek
kłębuszka nerkowego po podaniu adriamycyny [6].
Jedną z molekuł macierzy pozakomórkowej, której
przypisuje się rolę w regulacji funkcji i procesów życiowych dotyczących komórek własnych kłębuszka nerkowego jest VT [7]. Jest to glikoproteina, której obecność wykazano nie tylko w obrębie kłębuszka nerkowego, ale i w wielu płynach ustrojowych między innymi w surowicy, moczu
i płynie owodniowym [8].
materiał biopsyjny, pozostały po zakończeniu diagnostyki
immunopatologicznej KZN. Skrawki zdrowej nerki (n = 5)
uzyskano z okolicy wyciętego guza nerki.
Ekspresję VT, β1 integryny oraz CD31 badano za pomocą immunohistochemii z wykorzystaniem skrawków
nerek utrwalonych uprzednio w acetonie. Zastosowano
trójstopniową metodę APPAP (Alkaline Phosphatase-antiAlkaline Phosphatase) [7]. Badania przeprowadzono z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciw VT, β1 integrynie (Chemicon International, Temeccula, Stany Zjednoczone) i CD31 (Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle,
Wielka Brytania).
Ekspresje VT, β1 integryny oraz CD31 u chorych na
KZN porównywano do ekspresji w prawidłowym kłębuszku nerkowym, gdzie poziom ekspresji tych molekuł
oceniono na 3,0. Następnie badano zależności między
nasileniem ich ekspresji wykorzystując test Spearmanna.
Katarzyna Smykał i inni
148
Wyniki
W prawidłowym kłębuszku nerkowym, ekspresja β1
integryny miała charakter rozlany i dotyczyła wszystkich
komórek kłębuszka (Ryc. 1.A). Ekspresję VT stwierdzano zarówno na komórkach śródbłonka, jak i komórkach
mezangialnych kłębuszka nerkowego (Ryc. 1.B). Ekspresja CD31 lokalizowała się na komórkach śródbłonka
na całym obszarze kłębuszka nerkowego (Ryc. 1.C).
Zmiany ekspresji β1 integryny oraz VT u chorych na
KZN związane były z aktywnością procesu zapalnego
w kłębuszku nerkowym. U chorych z umiarkowanym
rozplemem komórek mezangium ekspresja obu molekuł
A
w kłębuszkach była zbliżona do obserwowanej w nerce
zdrowej. Natomiast w przypadku nasilonego rozplemu
mezangium oraz zaawansowanych zmian sklerotycznych
w kłębuszkach obserwowano wyraźny spadek ekspresji
β1 integryny oraz VT na komórkach mezangialnych i, w
mniejszym stopniu, na komórkach śródbłonka (Ryc. 2.).
Stwierdzono wyraźną korelację między ekspresją VT
i CD31 (Ryc. 3.), jak również między ekspresją β1 integryny i CD31 (Ryc. 4.). Wykazano także istotnie statystyczną zależność między ekspresją β1 integryny i VT
(Ryc. 5.).
B
C
Ryc. 1. Ekspresja β1 integryny (A), VT (B) i CD31 (C) w prawidłowym kłębuszku nerkowym.
A
B
C
D
E
F
Ryc. 2. Porównanie ekspresji β1 integryny (A, D), VT (B, E) i CD31 (C, F) w kłębuszkach nerkowych z nasilonym (A, B, C)
rozplemem mezangium oraz sklerotyzacją (D, E i F).
Ekspresja β1 integryny i witronektyny w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenie nerek
149
3,0
r = 0,72
p < 0,01
2,5
Ekspresja VT
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Ekspresja CD31
Ryc. 3. Zależność między ekspresją VT i CD31 w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN.
3,0
r = 0,72
p < 0,0005
Ekspresja β1 integryny
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Ekspresja CD31
Ryc. 4. Zależność między ekspresją β1 i CD31 w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN.
3,5
r = 0,42
p < 0,05
Ekspresja β1 integryny
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Ekspresja VT
Ryc. 5. Zależność między ekspresją β1 i VT w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN.
Dyskusja
Wyniki naszych badań wskazują na ekspresję VT i β1
integryny na komórkach śródbłonka, co wydaje się potwier-
dzać wykazana przez nas linijna zależność między ekspresją
VT i CD31 (markera komórek śródbłonka) oraz β1 integryny i CD31. Jednak zmiany w ekspresji VT i β1 integryny
w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN obserwowano
przede wszystkim na komórkach mezangium.
150
Katarzyna Smykał i inni
W odniesieniu do ekspresji VT, wyniki te są zgodne
z otrzymanymi przez Shikata i wsp., którzy wykrywali
VT na komórkach mezangialnych za pomocą przeciwciał poliklonalnych metodą immunofluorescencji [11].
Wyraźna korelacja między ekspresją obydwóch cząsteczek sugeruje, że β1 integryna jest ważnym receptorem
VT w kłębuszku nerkowym.
Jak już wspomniano, dotychczasowe wyniki badań dotyczące roli β1 integryny w procesie zapalnym w kłębuszku
nerkowym są rozbieżne. Kagami i wsp. obserwowali wyraźny wzrost ekspresji α1β1 integryn w kłębuszkach nerkowych szczurów z wywołanym za pomocą przeciwciał
anty-Thy 1 mezangialnym rozplemowym KZN. Wzrost
ekspresji α1β1 integryn skojarzony był z nasileniem produkcji TGF-β, znanego czynnika stymulującego proces
włóknienia. Według powyższych autorów, TGF-β wpływa
na akumulację składników macierzy pozakomórkowej
poprzez indukcję syntezy β1 integryn [10]. Podobne wyniki
uzyskał Uchio-Hamada i wsp. u myszy z wrodzonym zespołem nerczycowym [12]. W kłębuszkach ludzkich nerek,
wzrost ekspresji β1 integryn w przebiegu nefropatii IgA
oraz toczniowego KZN wykazał Kuhara i wsp. [13].
Odmienną lokalizację ekspresji β1 integryn u chorych na nefropatię IgA stwierdził Hillis i wsp. Autorzy ci
nie obserwowali zmian w ekspresji β1 integryn na komórkach własnych kłębuszka w stosunku do nerki zdrowej. Ekspresję α1β1 integryn wykrywali oni w półksiężycach, ale wzrost ekspresji tego receptora dotyczył
przede wszystkim ognisk włóknienia w śródmiąższu
oraz uszkodzonych cewek nerkowych. Podobnie do
wyników naszych badań, stwierdzali oni brak ekspresji
α1β1 integryn w kłębuszkach zmienionych sklerotycznie
[2]. Tymczasem Baraldi i wsp. obserwowali wyraźny
wzrost ekspresji α1β1 oraz α2β1 integryn na komórkach
mezangialnych w kłębuszkach nerkowych chorych na
gwałtownie postępujące KZN [4].
Cook i wsp. badali efekt zastosowania przeciwciał
przeciwko α1β1 integrynom szczurom z gwałtownie
postępującym KZN. Podczas gdy u szczurów, którym
nie podano przeciwciał obserwowano wzrost ekspresji
α1β1 integryn na komórkach mezangialnych oraz na
komórkach nabłonka cewek nerkowych (w porównaniu
do nerki zdrowej), brak α1β1 integryn prowadził do
zahamowania proliferacji fibroblastów, zwiększenia
produkcji metaloproteinaz i w rezultacie zmniejszenia
akumulacji kolagenu [5].
Za szkodliwym wpływem α1β1 integryn na przebieg
procesu zapalnego w kłębuszkach nerkowych przemawiają również wyniki badań genetycznych na myszach,
przeprowadzonych przez Cosgrove i wsp. Stwierdzili
oni, iż pozbawienie zwierząt genu kodującego łańcuch
α3 kolagenu typu IV oraz genu kodującego α1 integrynę
wyraźnie zahamowało progresję KZN, zmniejszyło
akumulację białek macierzy pozakomórkowej i zapobiegało zanikowi wyrostków stopowatych podocytów [3].
Jednak całkowicie odmienne wnioski, co do roli α1β1
integryn w kłębuszku nerkowym wysnuł Chen i wsp., którzy badali wpływ α1β1 integryn na utrzymanie struktury
kłębuszków nerkowych myszy po ich uszkodzeniu za pomocą adriamycyny. Porównali oni skutki podania adriamycyny myszom pozbawionym genu kodującego α1 integrynę
z myszami posiadającymi kompleks α1β1 integryn. U myszy pozbawionych α1β1 integryn obserwowano wyraźny
wzrost produkcji wolnych rodników, zmniejszenie liczby
komórek mezangialnych oraz wzrost syntezy i odkładania
się kolagenu typu IV. Przyczyniło się to do szybko postępującej sklerotyzacji kłębuszków nerkowych i pogorszenia
funkcji nerek [6]. Autorzy sugerują, iż kompleks α1β1
integryn pełni funkcję ochronną w stosunku do komórek
kłębuszka nerkowego.
Wykazany przez nas wyraźny spadek VT i β1 integryny
w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN z nasilonym
rozplemem komórek mezangialnych oraz w przebiegu
zmian sklerotycznych wydaje się potwierdzać ochronną
rolę β1 integryny oraz VT w stosunku do komórek własnych kłębuszka nerkowego. Wyniki naszych badań wskazują zatem na te molekuły, jako ważne czynniki zaangażowane w utrzymanie integralności struktury kłębuszka nerkowego.
Piśmiennictwo
1. Kagami S., Kondo S.: β1-integrins and glomerular injury.
J. Med. Invest., 2004, 51, 1–13.
2. Hillis G.S., Roy-Chaudhury P., Duthie L.A., Stewart K.N.,
Brown P.A.J., Simpson J.G., MacLeod A.M.: Expression of
β1 integrins in IgA nephropathy. Nephrol. Dial. Transplant.,
1997, 12, 1137–1142.
3. Cosgrove D., Rodgers K., Meehan D., Miller C., Bovard K.,
Gilroy A., Gardner H., Kotelianski V., Gotwals P., Amatucci
A., Kalluri R.: Integrin α1β1 and transforming growth factorβ1 play distinct roles in Aport glomerular pathogenesis and
serve as dual targets for metabolic therapy. Am. J. Pathol.,
2000, 157, 1649–1659.
4. Baraldi A., Zambruno G., Furci L., Ballestri M., Tombesi A.,
Ottami D., Lucchi L., Lusvarghi E.: β1 and β3 integrin upregulation in rapidly progressive glomerulonephritis. Nephrol.
Dial. Transplant., 1995, 10, 1155–1161.
5. Cook H.T., Khan S.B., Allen A., Bhangal G., Smith J., Loob
R.R., Pusey C.D.: Treatment with an antibody to VLA-1 integrin reduces glomerular and tubulointerstitial scarring in a
rat model of crescentic glomerulonephritis. Am. J. Pathol.,
2002, 4, 1265–1272.
6. Chen X., Moeckel G., Morrow J.D., Cosgrove D., Harris
C.R., Fogo A.B., Zent R., Pozzi A.: Lack of integrin α1β1
leads to severe glomerulosclerosis after glomerular injury.
Am. J. Pathol., 2004, 165, 617–630.
7. Jadczyszyn J., Rochowiak A., Smykał K., Kubiak A., Niemir
Z.: Czy αvβ3 integryny biorą udział w procesie zapalnym w
kłębuszku nerkowym? Now. Lek., 2005, 5, 628–631.
8. Conlan M.G., Tomasini B.R., Schulz R.L., Mosher D.F.:
Plasma vitronectin polymorphism in normal subjects and patients with disseminated intravascular coagulation. Blood,
1988, 72, 1885–190.
9. Schnapp L.M., Hatch N., Ramos D.M., Klimanskaya I.V.,
Scheppard D., Pytela R.: The human integrin α8β1 functions
as a receptor for tenascin, fibronectin and vitronectin. J. Biol.
Chem., 1995, 270, 23196–23202.
10. Kagami S., Border W.A., Ruoslahti E., Noble N.A.: Coordinated expression of β1 integrins and transforming growth fac-
Ekspresja β1 integryny i witronektyny w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenie nerek
tor-β-induced matrix proteins in glomerulonephritis. Lab. Invest., 1993, 69, 68–76.
11. Shikata K., Makino H., Marioka S., Kashitani T., Hirata K.,
Ota Z., Wada J., Kanwar Y.S.: Distribution of extracellular
matrix receptors in various form of glomerulonephritis. Am.
J. Kidney Dis., 1995, 25, 680–688.
12. Uchio-Yamada K. Manabe N., Yamaguchi M., Akashi N.,
Goto Y., Yamamoto Y., Ogura A., Miyamoto H.: Localiza-
151
tion of extracellular matrix receptors in ICGN mice, a strain
of mice with hereditary nephrotic syndrome. J. Vet. Med.
Sci., 2001, 63, 1171–1178.
13. Kuhara T., Kagami S., Kuroda Y.: Expression of β1 integrins
on activaced mesangial cells in human glomerulonephritis.
J. Am. Soc. Nephrol., 1997, 8, 1679–1687.