Pobierz plik - Wydział Chemiczny Politechniki Warszawskiej

Prof. dr hab. Irena Staneczko-Baranowska
Gliwice, 03.09.2015
Wydział Chemiczny
Politechnika Śląska
Ocena
rozprawy doktorskiej mgr inż. Magdaleny MATCZUK pt. „Development of the
Analytical Methodology for Investigations of the Anticancer Metallocomplexes
Transportation under Simulated Physiological Conditions”
przygotowanej w formie serii tematycznie spójnych publikacji
Choroby nowotworowe stanowią jeden z największych problemów współczesnej
medycyny, a wg danych WHO z 2014 roku liczba zachorowań na nowotwory gwałtownie
wzrośnie, co głównie wiąże się ze starzeniem społeczeństwa. Istotnym jest więc poszukiwanie
nowych leków o potencjalnych właściwościach przeciwnowotworowych, z możliwością ich
skutecznego zastosowania w chemioterapii. Jednakże w chemioterapii, która ciągle pozostaje
podstawową metodą leczenia nowotworów, często niepożądane działania uboczne
stosowanych leków przewyższają efekt terapeutyczny. Intensywne badania nad nowymi
związkami o lepszej selektywności działania niż cis-platyna i jej analogi, doprowadziły do
otrzymania szeregu potencjalnych leków, lecz tylko nieliczne z nich uzyskują pozytywną
ocenę w testach klinicznych.
W badaniach nad nowymi związkami szczególną uwagę zwraca się na połączenia
o niskiej toksyczności, dużej specyficzności działania i wyższej skuteczności terapeutycznej.
O skuteczności tych badań w dużym stopniu decyduje poznanie mechanizmu działania leku
na poziomie lek–biocząsteczka i na poziomie komórkowym.
W rozprawie będącej przedmiotem recenzji prowadzono prace nad ciekawymi
połączeniami, jakimi są kompleksy rutenu (III) i galu (III), a badania wykonywano
w symulowanych warunkach fizjologicznych. Zainteresowanie związkami rutenu wynika
z niektórych ich właściwości, w tym z dostępnych różnych stopni utlenienia, czy ze zdolności
jonu rutenu do wiązania się z molekułami, np. z ludzką transferyną. Potencjał redoks
związków rutenu wpływa na skuteczność działania terapeutycznego leków. Wyższą
aktywność przypisuje się związkom Ru (II), które tworzą się w środowisku redukującym
1
chorych tkanek (nowotworowych) w stosunku do kompleksów Ru (III), znanych jako związki
stosunkowo inertne. Ważną rolę w terapii przeciwnowotworowej przypisuje się koniugatom
transferyny. Transferyny należą do grupy glikoprotein, które biorą udział w metabolizmie
żelaza
w
organizmach
zwierzęcych.
Komórki
nowotworowe
charakteryzują
się
nadekspozycją receptorów transferyn w porównaniu z komórkami prawidłowymi, co pozwala
na gromadzenie się leków typu kompleks rutenu w addukcie z transferyną w komórkach
nowotworowych. Zmniejsza to w znacznym stopniu efekty uboczne, które zawsze towarzyszą
chemioterapii.
Aby możliwe były badania związków w formach specjacyjnych (na różnych stopniach
utleniania) należy opracować odpowiednie procedury i metody analityczne. Analiza
specjacyjna należy do wyjątkowo trudnych z uwagi na możliwość zakłócenia stabilności
poszczególnych indywiduów nawet w prostych układach ciekłych, a szczególnie
w roztworach fizjologicznych. Wymaga niezwykłej staranności w prowadzeniu doświadczeń
i dobrego przygotowania teoretycznego i eksperymentalnego.
W związku z ogromną nadzieją zastosowania w walce z nowotworami kompleksów
rutenu (III) i galu (III) – [trans-tetrachlorobis(1H-indazolo)rutenian (III)] indazolu oraz tris(8hydroksychinolino) gal (III) – celem rozprawy doktorskiej mgr inż. Magdaleny Matczuk było
opracowanie metod i metodologii do badania specjacji tych kompleksów w symulowanych
warunkach fizjologicznych.
Z uwagi na fakt, że słabo poznane są mechanizmy przemian badanych leków
w organizmie ludzkim, pomimo zaawansowanych testów medycznych, podjęte badania
uważam za niezwykle istotne i aktualne. Wyniki badań z pewnością przydatne będą
w weryfikacji hipotez związanych z działaniem badanych leków, jak i w przyszłości pomocne
w ich terapeutycznym zastosowaniu. Praca wykonana została pod kierunkiem Panów:
Profesora Macieja Jarosza, autorytetu z zakresu badań specjacyjnych z zastosowaniem
wysokozaawansowanych technik analitycznych oraz Pan Profesora Zbigniewa Czarnockiego,
specjalisty z zakresu chemii związków naturalnych, w tym badań czynności biologicznej ich
metabolitów.
Przesłana do oceny praca składa się z rozdziałów:
1. Spisu publikacji na których oparta jest rozprawa
2. Wstępu
3. Celu pracy
4. Przewodniku po publikacjach (krótkie omówienie osiągnięć)
5. Streszczenia
2
6. Kopii 6 publikacji
7. Oświadczenia współautorów publikacji.
We wstępie scharakteryzowano krótko problem schorzeń nowotworowych w skali
światowej i stosowane metody leczenia. Następnie omówiono leki przeciwnowotworowe
bazujące na związkach Pt (II) i ich reaktywność, a kolejno badane przez Doktorantkę
kompleksy Ru i Ga. Scharakteryzowano również techniki analityczne stosowane w badaniach
bioanalitycznych metalokompleksów antynowotworowych.
W „Celu pracy” jasno określono zakres badań, który obejmował opracowanie czułych,
skutecznych
metod
separacyjnych
do
śledzenia
zmian
specjacyjnych
badanych
metalokompleksów – w przypadku związku rutenu od momentu jego dożylnego podania do
przemian w komórkach nowotworowych, a dla związku galu zaplanowano badania jego
wydalania z moczem.
Szczegółowe opisy opracowanych procedur i metod analitycznych wraz z dyskusją
wyników znajdują się w kopiach 6 publikacji, wydrukowanych w renomowanych
czasopismach specjalistycznych o łącznym IF=23,788. Każda z publikacji przed akceptacją
do druku była oceniana przez co najmniej 2 – 3 zagranicznych recenzentów, specjalistów
z danych dziedzin.
W ramach przeprowadzonych badań:
 Zidentyfikowano
5
produktów
hydrolizy kompleksu
rutenu
w
warunkach
zewnątrzkomórkowych. W badaniach zastosowano tandemową spektrometrię mas
z jonizacją przez rozpraszanie.
 Zbadano kinetykę powstawania adduktu kompleksu Ru (III) i holotransferyny
(tj. transferyny z dwoma jonami Fe) w symulowanych warunkach surowicy krwi
ludzkiej, technikami CE-ICP-MS i ESI-TOF-MS.
Stwierdzono, że kompleks rutenu i żelazo w holotransferynie są transportowane do
komórek nowotworowych równocześnie. Proces ten ułatwia duża liczba receptorów
transferyny zlokalizowana na powierzchni komórek nowotworowych.
Nie zaobserwowano wyparcia żelaza z transferyny, co wg mojej opinii wynika
z faktu, że w warunkach fizjologicznych (pH=7,4) wiązanie jonów żelaza przez
transferynę jest bardzo trwałe.
 Dalsze badania adduktu prowadzono z zastosowaniem technik CE-ICP-MS i ESIQqQ-MS, w symulowanych warunkach cytozolu komórek nowotworowych.
W warunkach środowiska pH=6 i w obecności glutationu, kwasu askorbowego lub
kwasu cytrynowego, stwierdzono małocząsteczkowe formy kompleksu rutenu,
3
zawierające głównie Ru (II). Należy to tłumaczyć tym, że obecne w układach
biologicznych organizmów żywych glutation i kwas askorbowy uczestniczą w
procesach przeniesienia elektronów i tym samym w zmianach stopnia utlenienia.
Zmiana metabolizmu komórek nowotworowych w stosunku do komórek zdrowych
jest przyczyną zmniejszenia zawartości tlenu w środowisku, co sprzyja powstawaniu
warunków redukcyjnych. Równocześnie następuje zwiększenie stężenia glutationu
i obniżenie pH. Redukcja w tych warunkach Ru (III) do Ru (II) jest istotą dla
mechanizmu działania leku rutenowego.
 Kolejno badania nad formami specjacyjnymi adduktu kompleks rutenu –
holotransferyna prowadzono w cytozolu komórek z linii komórkowych gruczolaka
jelita grubego. W badaniach stosowano techniki SEC (chromatografia wykluczania)
z ICP-MS oraz µHPLC w połączeniu z ESI-QqQ-MS. Stwierdzono rozpad adduktu
z utworzeniem nowych form specjacyjnych Ru na +III i +II stopniu utlenienia.
Stosowano również postępowanie proteomiczne typu „shotgun”. Prowadzono
jednoczesną identyfikację różnych form kompleksu Ru–białka za pomocą metody
selektywnego cięcia enzymatycznego połączeń. Stwierdzono, że większość form to
kompleks Ru (II). Są to obserwacje niezwykle istotne, gdyż potwierdzają założenia
dużej efektywności leku, przy zminimalizowaniu ubocznych efektów terapii.
Na
wszystkich
etapach
badań,
jak
wspomniałam
wcześniej
stosowano
wysokozaawansowane sprzężone techniki analityczne, jednak w każdym eksperymencie
opracowano dla danego układu warunki rozdzielania, detekcji i oznaczania.
Z wszystkich tych zadań Doktorantka wywiązała się, co zaowocowało określeniem
specjacji rutenu w krwi i cytozolu komórek nowotworowych, tworzeniu charakterystycznej
mapy oddziaływań kompleksu Ru (III) z białkami cytozolu, zaproponowaniem mechanizmu
ich transportu do komórek, zmienionych chorobowo.
 Oprócz badań nad kompleksami rutenu opracowano metodę izotachoforezy kapilarnej
połączonej z micelarną elektrokinetyczną chromatografią (CITP-MECK) do
oznaczania kompleksu galu (III) w moczu ludzkim. Przeprowadzono optymalizację
metody, ze szczególnym uwzględnieniem efektu ogniskowania micelarnego
i krótkiego przygotowania próbek do oznaczeń analitów nieobdarzonych ładunkiem.
Stwierdzono, że ogniskowanie micelarne może być istotnym krokiem w kierunku
bezpośredniego oznaczania metaloleków za pomocą MECK.
4
Szerokie badania podstawowe i aplikacyjne w symulowanych układach fizjologicznych
z pewnością znajdą zastosowanie w badaniach próbek rzeczywistych. Poznanie mechanizmu
transportu i metabolizmu badanych leków będą przydatne w terapii nowymi, potencjalnymi
lekami na bazie kompleksów rutenu i galu, jak również w poszukiwaniu innych metaloleków.
Szczególnie
chciałabym
podkreślić
przydatność
opracowanych
metodologii,
które
z pewnością wykorzystają również inne zespoły badawcze w świecie, w celu poznania
przemian i transportu dokomórkowego nowych leków dedykowanych do terapii
antynowotworowej.
Zrealizowane cele pracy i osiągnięte wyniki badań wnoszą bezsprzecznie istotne
elementy nowości naukowej w zakresie bioanalityki, co potwierdzają
publikacje tych
wyników w tak znaczących czasopismach jak: Metallomics (2), Analytical and Bioanalytical
Chemistry (1), Analytica Chimica Acta (1), Analyst (1) i Journal of Chromatography A (1).
Doktorantka wykazała się bardzo dobrym przygotowaniem teoretycznym, znacznie
wykraczającym poza dziedzinę chemii. Wykazała się również dużą sprawnością
w wykorzystaniu nowoczesnych technik analitycznych, a przede wszystkim w interpretacji
wyników badań, bardzo trudnych analitycznie układów.
Jakkolwiek publikowane prace są wieloautorskie, z oświadczeń współautorów wynika,
że badania przedstawione w formie rozprawy należy uznać za osiągnięcia Pani mgr inż.
Magdaleny Matczuk i uważam je za jej pracę doktorską .
Oprócz prac załączonych w formie rozprawy posiada jeszcze w dorobku dodatkowo
5 innych publikacji, a także 17 ustnych komunikatów z tego 12 wygłoszonych przez
Doktorantkę (w tym 7 za granicą) oraz 20 wystąpień konferencyjnych w formie plakatów.
Łączny IF=31,435, co z pewnością świadczy o jej miejscu w czołówce młodych badaczy
z obszaru analityki chemicznej. Jej działalność została dostrzeżona również poza Politechniką
Warszawską – uzyskała finansowanie projektu Preludium 6 z NCN, szereg nagród za
prezentacje ustną i plakatowe oraz indywidualne stypendium za osiągnięcia naukowe.
Na podkreślenie zasługuje również fakt, że odbyła 3 staże zagraniczne – 2 w Moskwie
i 1 w Wiedniu.
5
W podsumowaniu pragnę podkreślić, że przedstawiona do oceny rozprawa doktorska
mgr inż. Magdaleny Matczuk z naddatkiem spełnia wymagania ustawowe stawiane pracom
doktorskim (Ustawa z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach i tytule naukowym z późniejszymi
zmianami). Moja opinia jest wysoce pozytywna i wnoszę do Rady Wydziału Chemicznego
Politechniki Warszawskiej o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu
doktorskiego.
Równocześnie wnioskuję o wyróżnienie rozprawy – uzasadnienie w załączeniu.
6