ILOgCIOWA OCENA mRNA TGF β IZOFORM I ICH RECEPTOR

),/g#)/7! /#%.! M2.! 4'&β ):/&/2- ) )#( 2%#%04/2¬7
7:$2/7%*4+!.#%2/'¬7+)
15!.4)4!4)6% !.!,93)3 /& 4'&β )3/&/2-3 M2.! !.$ )43 2%#%04/23 ). 4(%
./2-!,#/2.%!,4)335%
$RNFARM"ARBARA3TRZAŒKA$OCDRHABNMED5RSZULA-AZUREK$RNMED-ARIOLA$ORECKA
,EKMED!GNIESZKA3TANIK†7ALENTEK0ROFDRHABNMED7ANDA2OMANIUK
+ATEDRAI:AKŒAD"IOLOGII-OLEKULARNEJ7YDZIAŒU&ARMACEUTYCZNEGOI/DDZIAŒU-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
+ATEDRAI/DDZIAŒ+LINICZNY#HORÌB/CZUgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
+IEROWNIK+ATEDRAI:AKŒAD"IOLOGII-OLEKULARNEJ$OCDRHABNMED5RSZULA-AZUREK
+IEROWNIK+ATEDRAI/DDZIAŒ+LINICZNY#HORÌB/CZU0ROFDRHABNMED7ANDA2OMANIUK
Streszczenie
Rodzina transformujących czynników wzrostu ß - TGFß
to plejotropowe cytokiny odgrywające istotną rolę
w różnych procesach biologicznych takich jak wzrost,
różnicowanie oraz apoptoza komórek. Celem pracy
było wyznaczenie profilu ekspresji genów TGFß1, -ß2,
-ß3 i ich receptorów TßRI, TßRII, TßRIII oraz ocena relacji ilościowych pomiędzy analizowanymi transkryptami w zdrowej rogówce. Rąbek rogówki pozyskano od
18 dawców, w wieku 19 - 53 lat. Liczbę kopii mRNA
badanych genów wyznaczono techniką QRT- PCR przy
użyciu detektora sekwencji Opticon™ DNA Engine Sequence Detector.
Izoformy TGFβ1, -2, -3 i ich receptory TßRI, TßRII,
TßRIII wykazują różną ekspresję w rąbku rogówki,
co sugeruje, że mogą one pełnić specyficzne funkcje
w zdrowej rogówce.
Słowa kluczowe: rogówka, izoformy TGFβ, receptory
TGFβ, RT-PCR
'˜ ւ
Rogówka jest tkanką beznaczyniową, gładką, przezroczystą, lśniącą, która razem z filmem łzowym stanowi pierwszy
ośrodek skupiający promienie świetlne [1, 2]. Szereg procesów biologicznych takich jak wzrost, różnicowanie, proliferacja czy apoptoza przebiegających w komórkach rogówki
ściśle wiąże się z różnorodnymi cytokinami, do których
należą m. in. czynniki wzrostu [3, 4]. Rodzina transformujących czynników wzrostu β - TGFβ obejmuje 5 izoform
kodowanych przez różne geny, z których TGFβ1, TGFβ2,
TGFβ3 występują u ssaków [5, 6]. Cytokiny te stymulują
neowascularyzację, biorą udział w powstawaniu składników macierzy pozakomórkowej, uczestniczą w procesach
bliznowacenia i gojeniu ran [3, 4, 7, 8].
W warunkach in vitro izoformy TGFβ wywierają zbliżo-
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
Summmary:
Transforming growth factor ß - TGFß a family of multifunctional cytokines, has wide biological actions including growth, differentiation, and cell apoptosis. The
aim of the study was to determine the gene expression
profile of TGFß1, -2, -3, and their receptors TßRI,
TßRII, TßRIII in order to evaluate quantitative relations
between examined transcripts in a healthy cornea. The
study was carried out in 18 donors aged 19 - 63. To
evaluate studied gene expression mRNA was extracted
from corneal limbus and the number of mRNA copies
were assessed by QRT-PCR using Opticon™ DNA Engine Sequence Detector. We found different expression
of the TGFβ1, -2, -3 isoforms and TßRI, TßRII, TßRIII
receptors in the human corneal limbus what suggests
that each of them may play a specific role in healthy
cornea.
Keywords: cornea, TGFß isoforms, TGFß receptors,
RT-PCR
ny efekt biologiczny na tkanki, jednak in vivo charakteryzują się one zasadniczo różnym stopniem ekspresji i pełnią
odmienne funkcje. Ich aktywność biologiczna jest uzależniona od relacji ilościowych pomiędzy poszczególnymi izoformami i ich receptorami [3, 5, 8].
Celem pracy było wyznaczenie profilu ekspresji genów
kodujących izoformy TGFβ1, -β2, -β3 i ich receptory TβRI,
TβRII, TβRIII oraz ocena relacji ilościowych pomiędzy analizowanymi transkryptami w zdrowej ludzkiej rogówce.
- R–l-tŸlŸuR |J¬
Materiałem do badań był rąbek rogówki pozyskany od
18 dawców (9 kobiet i 9 mężczyzn), w wieku 19 - 53 lat.
Dawcy rogówki celem ketatoplastyki drążącej byli włączani
do badania wg kryteriów określonych przez Amerykańskie
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
Stowarzyszenie Banków Tkanek Oka (EBAA).
Rogówkę zmarłego dawcy pobierano do celów transplantacyjnych do 2 godzin od zgonu.
Uzyskany po wytrepanowaniu części tkanki
rąbek rogówki był natychmiast umieszczany
w odczynniku EUSOL C (Alchimia, Padova,
Włochy) i przechowywany do czasu dalszej
analizy w -70°C. Na przeprowadzenie badań
uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy
Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
(NN-6501-146/06).
p˜ –-pAo-Ÿpª-˜¥Ÿ–¬7|y¥pqRly|k
ªRa|
Ekstrakcję RNA z rąbka rogówki przeprowadzono przy użyciu zestawu odczynników
do izolacji całkowitego RNA (Total RNA Prep
Plus Kit, A&A Biotechnology, Gdańsk, Polska)
zgodnie z zaleceniami producenta. Stężenie
wyizolowanego RNA oraz stopień jego czystości był oceniany na podstawie pomiarów spektrofotometrycznych dokonanych na kalkulatorze DNA/RNA Gene-Quant Pro (Amersham
Pharmacia Biotech AB).
¬˜¥yRpŸ‡Ÿ–®¬pt-J|ª¬ŸRqRp –|\|–Ra–-uŸ‚–®RJ˜ -ªl-oÔA¬Ÿ–|®J®l-tŸ‚–|k
J¥p }ªŸ–R-pAolŸ"ŸŸªŸ†Ÿ¸Rq¥Ÿ‚|ql-p–¬q-ulJ|ª¬uŸ7-–ªl|y¬uŸ˜|k
q-ulŸ ˜–R7–-‡Ÿ ÛAlR¸p-Ÿ Ÿ XŸ u-–pR–Ÿ ªlRqp|²AlŸ XŸ ‚q-®ulJŸ ‚Ÿ ¡¤¤ž-RŸ GŸ
²AlR¸p-Ÿ ¤Ÿ XŸ -u‚qluR–Ÿ "bŸ „^¤Ÿ ‚®…GŸ ²AlR¸plŸ ¡Ÿ lŸ`Ÿ XŸ -u‚qluR–Ÿ "bŸ
„¤°Ÿ‚®…GŸ²AlR¸plŸ^ŸlŸŸXŸ-u‚qluR–Ÿ"bŸ„¡zŸ‚®…GŸ²AlR¸plŸœŸlŸUŸXŸ-u‚qluR–Ÿ
"bŸ„œ¡‚®…‡
R-pAo-Ÿ"kŸJq-ŸuŸ
l®|\|–uŸ"βŸlŸlAiŸ–RAR‚ |–}ª
Aktywność transkrypcyjną badanych genów oceniano
na podstawie analizy kinetyki reakcji RT-PCR z zastosowaniem zestawu odczynników SYBR Green Quantitect
RT-PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) oraz detektora
sekwencji Opticon™ DNA Engine Sequence Detector (MJ
Research Inc., Watertown, MA, USA). Odwrotną transkrypcję (RT) prowadzono w temperaturze 50°C przez 30 minut,
natomiast amplifikację prowadzono w warunkach temperaturowych: 95°C przez 15 minut; 50 dwustopniowych cykli:
95°C przez 30 sekund i 60°C przez 60 sekund oraz końcowe wydłużanie 72°C przez 10 minut. Każda reakcja przeprowadzona była w trzech powtórzeniach. Zastosowano
następujące sekwencje starterów, zaprojektowane z wykorzystaniem programu Primer Express™ v.2.0 software (PE
Applied Biosystems, Inc., Foster, CA, USA):
TGFβ1 (Gen Bank accession no. X02812) 5’TGAACCGGCCTTTCCTGCTTCTCATG3’ (starter sensowny),
5’GCGGAAGTCAATGTACAGCTGCCGC3’ (starter antysensowny);
TGFβ2 (Gen Bank accession no. NM_003238), 5’TACTACGCCAAGGAGGTTTACAAA3’ (starter sensowny), 5’TTGTTCAGGCACTCTGGCTTT3’ (starter antysensowny);
TGFβ3 (Gen Bank accession no. NM_003239) 5’CTGGATTGTGGTTCCATGCA3’ (starter sensowny), 5’TCCCCGAATGCCTCACAT3’ (starter antysensowny);
TβRI (Gen Bank accession no. AF054592) 5’ACTGGCAGCTGTCATTGCTGGACCAG3’ (starter sensowny),
5’CTGAGCCAGAACCTGACGTTGTCATATCA3’ (starter antysensowny);
TβRII (Gen Bank accession no. M85079) 5’GGCTCAACCACCAGGGCATCCAGAT3’ (starter sensowny),
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
5’CTCCCCGAGAGCCTGTCCAGATGCT3’(starter
antysensowny);
TβRIII (Gen Bank accession no. L07594) 5’ACCGTGATGGGCATTGCGTTTGCA3’ (starter sensowny),
5’GTGCTCTGCGTGCTGCCGATGCTGT3’(starter antysensowny).
Dla wszystkich prób badanych była wykonywana również reakcja QRT-PCR dla mRNA genu β-aktyny, mająca
potwierdzić natywność ekstraktu RNA w przypadku ewentualnego braku/inhibicji ekspresji badanych genów. Specyficzność reakcji RT-PCR potwierdzono techniką elektroforezy w 6% żelu poliakrylamidowym barwionym solami srebra
(Rysunek 1.) oraz wyznaczeniem temperatury topnienia
produktów PCR (Rysunek 2A, Rysunek 2B).
y-ql®-Ÿ˜ - ¬˜ ¬A®yWyniki badań poddano analizie statystycznej z wykorzystaniem licencjonowanej wersji programu Statistica v.7.1 PL
dla poziomu istotności p<0,05. Istnienie różnic weryfikowano za pomocą testu ANOVA Kruskala – Wallisa, a charakter
poszczególnych zależności ustalano stosując test post-hoc
oparty o średnie rangi.
'¬ylpl
Miarą aktywności transkrypcyjnej genów kodujących izoformy TGFβ i ich receptory była liczba cząsteczek mRNA
przeliczona na 1 μg całkowitego RNA. W ludzkiej rogówce wykazano ekspresję wszystkich izoform TGFβ(TGFβ1-
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
¬˜¥yRpŸ¤‡Ÿ–®¬ª-Ÿ Ru‚R–- ¥–¬Ÿ |‚ylRyl-Ÿ‚–|J¥p }ªŸ"kŸJq-Ÿl®|\|–uŸ"bŸ„FŸ"bGŸ"b¤GŸ"b¡…ŸlŸlAiŸ
–RAR‚ |–}ªŸ„FŸ"bGŸ"bGŸ"b…
4184,1; TGFβ2- 659,7; TGFβ3- 4185,4 przeciętna liczba
kopii mRNA/μgRNA) oraz ich receptorów (TβRI- 1433,5;
TßRII- 2182,5; TßRIII- 2942,3 przeciętna liczba kopii
mRNA/μg RNA). Porównując liczbę cząsteczek mRNA
TGFß/1μg całkowitego RNA dla poszczególnych izoform
wykazano większą ekspresję izoformy TGFß1 i TGFß3
w porównaniu z izoformą TGFß2 (test Kruskala - Wallisa
p<0,001; test post hoc: TGFß1 i TGFß2- p=0,0291; TGFß3
i TGFß2- p=0,0004; TGFß1 i TGFß3 NS). Nie stwierdzono
statystycznie istotnych różnic w aktywności transkrypcyjnej
TGFß1 i TGFß3, jednak mniejszy rozrzut wyników obserwowano dla izoformy TGF-ß3 (współczynnik rozrzutuCv=26,44 dla TGFß1; Cv=10.53 dla TGFß3). Porównując
liczbę kopii mRNA TßR/1μg całkowitego RNA dla receptorów wykazano, że dominującym receptorem jest TßRIII.
Analiza porównawcza dla wszystkich receptorów TGFß pokazała jednak brak różnic znamiennych statystycznie (test
Kruskala-Wallisa: p=0,732) pomiędzy ilością mRNA TßRI,
TßRII i TßRIII w zdrowej rogówce.
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
¬˜p¥˜oRola TGFβ w rogówce jest stosunkowo dobrze poznana
[4, 7], jednakże relacje ilościowe pomiędzy jego izoformami
i receptorami nadal pozostają nie jasne. W większości publikacji pooddawana jest ocenie ekspresja mRNA TGFβ lub/
i ich receptorów w przebiegu zmian patologicznych rogówki
[9,10], jedynie w nielicznych pracach autorzy analizują profil ekspresji omawianych cytokin w zdrowej tkance [4, 11].
W przedstawionej pracy, wykorzystując technikę QRT-PCR
w czasie rzeczywistym, oceniono aktywność transkrypcyjną
genów kodujących izoformy TGFβ i ich receptory w ludzkiej rogówce. W badaniach własnych wykazano obecność
wszystkich izoform TGFβ w rąbku rogówki, co jest są zgodne z wyniki wcześniej opublikowanymi, lecz materiałem
badanym był wówczas nabłonek rogówki szczurów [7, 10]
lub hodowle komórkowe [1, 4]. Przeprowadzona przez nas
analiza porównawcza pokazała, że TGFβ1 i TGFβ3 są dominującymi izoformami w ludzkiej rogówce. Jest to zgodne
z badaniami opublikowanymi przez Carrington i wsp. [12],
który wykazał, iż TGFβ1 jest dominującą izoformą jednakże
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
w bydlęcej rogówce podczas gojenia się ran. Podobne obserwacje poczynił także Li i wsp. [11], który stwierdził, że
w zdrowej rogówce i spojówce ludzkiej dominuje izoforma
TGFβ1. Biorąc pod uwagę, że cytokiny działają miejscowo
-autokrynnie, pobudzając swoiste receptory na komórkach
macierzystych [8] cennych informacji może dostarczyć analiza profilu ekspresji genów kodujących TGFb i jego receptory zwłaszcza, że w dostępnym piśmiennictwie napotkano
tylko nieliczne prace dotyczące tego zagadnienia. W badaniach własnych stwierdzono największą ilość mRNA receptora TβRIII, jednakże różnice pomiędzy ilością TβRI, TβRII
i TβRIII w zdrowej rogówce nie były istotne statystycznie.
Zieske i wsp. [10] w swej pracy wykazał obecność receptora TβRI i TβRII w rąbku ludzkiej rogówki, co jest zgodne
z naszymi obserwacjami, nie przedstawiając jednak relacji
ilościowych między badanymi transkryptami. Z kolei wyniki uzyskane przez Li i wsp. [11] pozwalają wnioskować, iż
w zdrowej rogówce dominuje receptor TβRI, co pozostaje
w sprzeczności z naszymi obserwacjami.
Podsumowując przegląd piśmiennictwa oraz wyniki badań
własnych należy zauważyć, że w ludzkiej rogówce izoformy
TGFβ1, 2 i 3 oraz ich receptory TßRI, TßRII, TßRIII wykazują różną aktywność transkrypcyjną. Różna ekspresja trzech
izoform TGFβ oraz ich receptorów sugeruje, że mogą one
pełnić specyficzne funkcje w zdrowej tkance rogówkowej.
l²ulRyylA ª|
1. Chakravarti S, Wu F, Vij N, Roberts L, Joyce S.: Microarray studies reveal macrophage-like function of stromal
keratocytes in the cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci.
2004; 45: 3475-84.
2. Chakravarti S.: The cornea through the eyes of knockout
mice. Exp Eye Res. 2001; 73: 411–19.
3. Nakamura H, Siddigui SS, Shen X, Malik AB, Pulido JS,
Kumar NM, Yue BY.: RNA interference targeting transforming growth factor-ß type II receptor suppresses ocular
inflammation and fibrosis. Mol Vis. 2004; 10: 703-11.
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
4. Hayashida - Hibino S, Watanabe H.: The effect of
TGF-ß1 on differential gene expression profiles in
human corneal epithelium studied by cDNA expression array. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42:
1691-7.
5. Cho HR, Hong SB, Kim YI, Lee JW, KimNI.: Differential expression of TGF-beta isoforms during differentiation of HaCaT human keratinocyte cells: implication for
the separate role in epidermal differentiation. J Korean
Med Sci. 2004;19: 853-8.
6. Elliott RL, Blobe GC.: Role of transforming growth
factor beta in human cancer. J. Clin. Oncol. 2005; 23:
2078-93.
7. Chen C, Michelini-Norris B, Stevens S, Rowsey J.: Measurement of mRNA for TGFß and Extracellular Matrix
Proteins in Corneas of Rats after PRK. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000; 41: 4108-16.
8. Flisiak R, Wiercińska-Drapało A, Tynecka E.: Transformujący czynnik wzrostu β w patogenezie chorób wątroby. Wiad. Lek. 2000; LIII: 9-10.
9. Song QH, Klepeis VE, Nugent MA, Trinkaus-Randall
V. TGF-beta1 regulates TGF-beta1 and FGF-2 mRNA
expression during fibroblast wound healing. Mol Pathol.
2002; 55: 164-76.
10. Zieske JD, Hutcheon AE, Guo X, Chung EH, Joyce
NC. TGF-beta receptor types I and II are differentially
expressed during corneal epithelial wound repair. Invest
Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42: 1465-71.
11. Li DQ, Lee SB, Tseng SC. Differential expression and
regulation of TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-betaRI, TGF-betaRII and TGF-betaRIII in cultured human corneal, limbal, and conjunctival fibroblasts. Curr
Eye Res.1999; 19: 154-61.
12. Carrington LM, Albon J, Anderson I, Kamma C, Boulton M. Differential regulation of key stages in early corneal wound healing by TGF-beta isoforms and
their inhibitors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;
47:1886-94.
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY