oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od st

oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od st

ĆWICZENIE
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI LIPAZY TRZUSTKOWEJ I JEJ ZALEŻNOŚCI
OD STĘŻENIA ENZYMU ORAZ ŻÓŁCI JAKO MODULATORA REAKCJI
ENZYMATYCZNEJ. INHIBICJA KOMPETYCYJNA DEHYDROGENAZY
BURSZTYNIANOWEJ.
1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu
oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej.
Zasada metody:
Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z
tłuszczów roślinnych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach. Ilość uwolnionych kwasów
tłuszczowych oznacza się poprzez miareczkowanie mianowanym roztworem NaOH wobec
fenoloftaleiny jako wskaźnika.
Część analityczna
Przygotowanie substratu
Odmierzyć 25 ml oleju do kolbki stożkowej. Dodać 1 ml 0,01M NaOH i sporządzić emulsję
przez wytrząsanie.
Wolne kwasy tłuszczowe zawarte w oleju tworzą w obecności NaOH mydła, które obniżają
napięcie powierzchniowe, a nieznaczny nadmiar NaOH zapewnia słabo alkaliczny odczyn, optymalny
dla aktywności lipazy.
Oznaczenie aktywności enzymu
Przygotować dwa szeregi próbówek i oznaczyć je odpowiednio cyframi: trzy pierwsze próbówki
w rzędzie jako 0 (próby kontrolne) a kolejne cyframi od 1 do 5. Następnie do próbówek odmierzyć
roztwory odczynników w ilościach podanych w tabelach poniżej.
Szereg I. Inkubacja bez aktywatorów
Próbówka nr
0
0
0
1
2
3
4
5
Substrat (ml)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
NaCl (ml)
2,0
2,0
2,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Szereg II. Inkubacja z aktywatorami
Próbówka nr
0
0
0
1
2
3
4
5
Substrat (ml)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
NaCl (ml)
1,5
1,5
1,5
2,0
1,5
1,0
0,5
-
Żółć (ml)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
W doświadczeniu wykorzystujemy lipazę trzustkową ekstrahowaną ze zliofilizowanego proszku
tkankowego trzustki. Lipazę zinaktywowaną otrzymujemy poprzez denaturację cieplną enzymu
aktywnego. Do obydwu szeregów próbówek dodawać lipazę w 30 sekundowych odstępach w ilościach
przedstawionych w tabeli poniżej.
Szereg
II
Szereg
I
Próbówka nr
Enzym aktywny
[ml]
Enzym zinaktywowany
[ml]
Enzym aktywny
[ml]
Enzym zinaktywowany
[ml]
0
0
0
1
2
3
4
5
-
-
-
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
1,0
1,0
1,0
-
-
-
-
-
-
-
-
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
1,0
1,0
1,0
-
-
-
-
-
Wymieszać zawartość próbówek i wstawić do łaźni wodnej o temp. 37°C. Zanotować czas
rozpoczęcia inkubacji, Próby należy inkubować przez 30 min. w łaźni wodnej, po czym do każdej z nich
należy dodać w odstępach 30 sekund po 2 ml 96% etanolu w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej.
Kolejność dodawania etanolu do próbówek musi być identyczna jak w przypadku dodawania enzymów.
Etanol denaturuje białko oraz ułatwia przejście hydrofobowych produktów reakcji enzymatycznej do
fazy wodnej, a tym samym umożliwia ich odmiareczkowanie za pomocą wodnego roztworu NaOH.
Przenieść próbówki z łaźni wodnej na stół laboratoryjny i dodać do każdej z nich po 4 krople
fenoloftaleiny. Przenieść zawartość próbówek do kolbek stożkowych, a następnie miareczkować 0,01M
NaOH do wystąpienia i utrzymania się przez 30 sek. purpurowego zabarwienia. Zanotować objętość
wodorotlenku zużytą do zobojętniania poszczególnych próbówek.
Uwaga: W czasie miareczkowania wstrząsać intensywnie zawartość kolby, gdyż miareczkowany
jest układ dwufazowy!!!
Obliczenia i wnioski
Od każdej objętości NaOH zużytej do odmiareczkowania próby z aktywnym enzymem odejmij
objętość NaOH zużytą do odmiareczkowania odpowiednich prób kontrolnych (średnią z trzech prób),
jest ona wykładnikiem kwasowości mieszaniny reakcyjnej niezależnej od aktywności enzymu.
Sporządzić wykres zależności aktywności lipazy wyrażonej w ml NaOH zużytego na zobojętnienie
wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w wyniku hydrolizy od jej stężenia wyrażonego w ml
dodanego roztworu enzymu. Opisać wnioski wyciągnięte z doświadczenia.
2. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej za pomocą K 3[Fe(CN)6]
oraz hamowanie jej aktywności w obecności inhibitorów.
Zasada metody:
Dehydrogenaza bursztynianowa jest flawoproteiną ściśle związaną z wewnętrzną błoną
mitochondrialną. Uczestniczy w transporcie protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym.
W warunkach fizjologicznych utlenia bursztynian do fumaranu, a akceptorem protonów jest ubichinon.
W oznaczeniach aktywności enzymatycznej dehydrogenazy bursztynianowej in vitro stosowane są
sztuczne akceptory elektronów takie jak heksacyjanożelazian (III) potasu K3[Fe(CN)6]. Reakcję redukcji
heksacyjanożelazianu (III) potasu przedstawia reakcja:
K3[Fe(CN)6] + e  K4[Fe(CN)6]
żółty
bezbarwny
Obserwując zmianę barwy w trakcie przebiegu reakcji, można wnioskować o kierunku przebiegu reakcji
oksydacyjno-redukcyjnej w badanym roztworze.
Reakcje redukcji heksacyjanożelazianu (III) potasu hamuje malonian, będący odwracalnym
inhibitorem kompetycyjnym dehydrogenazy bursztynianowej oraz HgCl2.
Część analityczna
Przygotowanie homogenatu
Odważyć 10 g wątroby i rozdrobnić. Wprowadzić do cylindra homogenizatora pokrojoną tkankę
oraz 50 ml buforu fosforanowego pH=6. Homogenizować przez 5 minut, a następnie przesączyć przez
podwójną warstwę gazy.
Przygotowanie próbówek z mieszaninami inkubacyjnymi, inkubacja wstępna
Przygotować mieszaniny inkubacyjne na podstawie zamieszczonej tabeli. Próbę kontrolną bez
substratu będzie stanowiła mieszanina inkubacyjna w próbówce nr 1. Natomiast w próbówce nr 2 będzie
się znajdować próba kontrolna bez aktywnego enzymu, w tym celu należy dodać do niej 2 ml
10% kwasu trichlorooctowego, który poprzez denaturację białka spowoduje zanik aktywności enzymu.
Wszystkie mieszaniny inkubacyjne należy ogrzewać na łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez
5 minut w celu preinkubacji.
Numer próbówki
0,1 M bufor fosforanowy
pH=6,0 (ml)
0,05 M bursztynian sodowy
(ml)
0,05 M malonian sodowy
(ml)
0,01 M HgCl2
(ml)
0,5%K3[Fe(CN)6]
(ml)
Woda destylowana
(ml)
Inkubacja właściwa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
2,0
2,0
2,0
2,0
0,1
0,1
2,0
2,0
0
0
0
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
3,0
2,9
2,9
2,9
2,8
2,8
0,9
0,9
1,0
1,0
2,8
2,8
0,9
0,9
Do każdej próbówki dodać 0,5 ml homogenatu wątroby, wymieszać i inkubować przez 30 minut
w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Reakcję przerwać poprzez dodanie do każdej próbówki (za
wyjątkiem próbówki nr 2) 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego, a następnie odwirowywać przez 10 minut. W
otrzymanym nadsączu oznaczyć absorbancję przy długości fali 420 nm względem wody.
Obliczenia i wnioski
Obliczyć i wpisać do tabeli stężenia substratu (bursztynianu) i inhibitorów (malonianu, HgCl 2 )
w poszczególnych próbówkach. Opisać w których próbówkach obserwowano zmiany zabarwienia
i wyjaśnić przyczynę zjawisk obserwowanych w każdej z próbówek.
Literatura
1. „Biochemia Harpera” - Robert Murray
2. „Ćwiczenia z biochemii” - Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz
3. „Biochemia. Ćwiczenia praktyczne dla studentów wydziału farmaceutycznego” - Lidia Włodek
Proszę przynieść na ćwiczenia papier milimetrowy
SPRAWOZDANIE
1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu
oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej.
A. OBSERWACJE DOTYCZĄCE WYZNACZENIA PUNKTU KOŃCOWEGO
MIARECZKOWANIA. TYP METODY.
B. OBJĘTOŚCI NaOH WYZNACZONE PODCZAS MIARECZKOWANIA
Szereg I
Nr próbki
V NaOH [ml]
Szereg II
Nr próbki
0
0
0
0
0
0
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
V NaOH [ml]
C. OBLICZENIE V NaOH RÓWNOWAŻNEJ ILOŚCI UWOLNIONYCH WOLNYCH KWASÓW
TŁUSZCZOWYCH
Szereg I
Nr próbki
V NaOH [ml]
Szereg II
Nr próbki
V NaOH [ml]
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
D. WYKONANIE WYKRESU
Sporządzenie na papierze milimetrowym wykresu zależności aktywności lipazy wyrażonej w ml
NaOH zużytego na zobojętnienie wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w wyniku
hydrolizy (y) od jej stężenia wyrażonego w ml dodanego roztworu enzymu (x).
● – szereg I
X – szereg II
E. WNIOSKI
2. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej za pomocą K 3[Fe(CN)6]
oraz hamowanie jej aktywności w obecności inhibitorów.
A. OBLICZENIE STĘŻEŃ MOLOWYCH BURSZTYNIANU, MALONIANU I HgCl2 W
POSZCZEGÓLNYCH PRÓBACH BADANYCH
B. WYNIKI POMIARU ABSORBANCJI I OBSERWACJE
Numer
próbówki
Cbursztynianu
[mol/dm3]
Cinhibitora
[mol/dm3]
A
Zajście reakcji
[-, +, ++, +++]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
C. WNIOSKI