streszczenie pl

Streszczenie rozprawy doktorskiej pt.
„The Role of Maf1 Protein in tRNA Processing and Stabilization” / „Rola białka Maf1 w
dojrzewaniu i kontroli stabilności tRNA”
mgr Tomasz Turowski, promotor prof. dr hab. Magdalena Rakowska-Boguta
U organizmów wyższych za ekspresję genomu odpowiadają trzy polimerazy RNA (Pol):
Pol I, która transkrybuje rybosomalny RNA (rRNA); Pol II transkrybująca mRNA, kodujące
funkcjonalne białka (tylko 5% RNA); oraz Pol III której produktami są liczne niekodujące RNA
w tym tRNA stanowiące aż 15% całej puli RNA w komórce. tRNA dostarcza aminokwasy do
aparatu biosyntezy białek, a zwiększenie jego ilości jest obserwowane w wielu typach
nowotworów. Podobnie jak inne rodzaje RNA, ilość funkcjonalnego tRNA jest kontrolowana na
poziomie transkrypcji, dojrzewania, transportu w komórce i degradacji.
Badania dotyczące transkrypcji u eukaryota skupiały się do tej pory na regulacji syntezy
mRNA prze polimerazę II RNA (Pol II). W ostatnich latach również mechanizm kontroli Pol I
i Pol III stał się przedmiotem badań wielu czołowych laboratoriów na świecie. Kluczowym
elementem kontroli Pol III jest białko Maf1, odkryte u drożdży w zespole prof. M. Boguty, znane
jako jedyny negatywny regulator Pol III pośredniczący w przekazywaniu zróżnicowanych
sygnałów stresowych. Maf1 jest konserwowany w organizmach eukariotycznych. Ludzki
homolog białka Maf1 także funkcjonuje jako represor Pol III, choć poza nim transkrypcję tRNA
u ludzi hamują też białka p53 i retinoblastoma, znane jako supresory nowotworzenia.
Po transkrypcji wszystkie rodzaje RNA ulegają wieloetapowemu dojrzewaniu, na które w
przypadku tRNA składa się procesowanie 5` i 3` końców, wycinanie intronów i liczne
modyfikacje nukleotydów. Ponieważ u drożdży kompleks odpowiedzialny za wycinanie
intronów znajduje się na zewnętrznej membranie mitochondriów, pre-tRNA z dojrzałymi
końcami musi zostać wyeksportowane z jądra. Za eksport pre-tRNA zawierających introny z
jądra odpowiedzialne jest białko Los1. Po wycięciu intronów, ostatnich modyfikacjach
zachodzących także w cytoplazmie i załadowaniu aminokwasami przez syntazy aminoacylotRNA, dojrzałe tRNA jest gotowe do translacji. Ilość i jakość tRNA używanego do translacji jest
monitorowana przez odpowiednie szlaki degradacji.
To właśnie kontrola stabilności RNA jest jedną z podstawowych dróg regulacji poziomu
ekspresji genów i tak np. wiele nowosyntetyzowanych transkryptów ulega natychmiastowej
degradacji i nigdy nie dociera do aparatu translacyjnego. Ograniczona ilość informacji
dostępnych na temat szlaków degradacji tRNA i ich regulacji kontrastuje ze szczegółową wiedzą
opisującą szlaki degradacji mRNA. Jak dotąd, powiązanie transkrypcji i degradacji było opisane
tylko w odniesieniu do mRNA. Wykazano, że represja transkrypcji Pol II powoduje stabilizację
mRNA. Powstało więc pytanie, czy analogicznie, represja transkrypcji Pol III przez Maf1 będzie
mieć wpływ na dojrzewanie i stabilizację tRNA.
W pierwszej części pracy opisano wpływ Maf1 na obróbkę potranskrypcyjną tRNA oraz
zidentyfikowano eksport pre-tRNA przez Los1 jako jeden z limitujących etapów w biosyntezie
tRNA. W szczepie pozbawionym białka Maf1 obserwuje się zmianę w proporcjach niedojrzałych
form pre-tRNA oraz nagromadzenie ogólnej puli tRNA, w szczególności pierwotnych
transkryptów. Seria eksperymentów genetycznych i hybrydyzacji RNA typu Northern, a także
eksperymenty z wykorzystaniem inhibitora transkrypcji, pozwoliły określić, że wpływ białka
Maf1 na dojrzewanie pre-tRNA jest oparty na wysyceniu czynników procesujących i jest zależne
od roli białka Maf1 jako negatywnego regulatora Pol III. Poszukiwanie limitujących etapów
biogenezy tRNA doprowadziły do zidentyfikowania eksportu tRNA z jądra do cytoplazmy przez
białko Los1 jako jeden z limitujących etapów dla biogenezy tRNA chociaż nie można wykluczyć
wysycenia innych etapów dojrzewania tRNA w sytuacji podwyższenia transkrypcji
spowodowanej brakiem białka Maf1. Wyniki te po raz pierwszy ukazują zależność między
transkrypcją i dojrzewaniem tRNA.
Najistotniejszym odkryciem opisanym w niniejszej pracy jest rola transkrypcji tRNA w
kontroli stabilności tRNA. Są to badania nowatorskie w skali światowej – nigdy wcześniej nie
pokazano wpływu transkrypcji na degradację tRNA. Badania były prowadzone w układzie
drożdżowym w którym komórki pozbawione są dwóch genów TRM4 i TRM8 kodujących
transmetylazy modyfikujące tRNA. Brak genów TRM4 i TRM8 skutkuje brakiem części
modyfikacji, co destabilizuje strukturę wybranych tRNA, w tym tRNAVal(AAC), i powoduje
wrażliwość komórki na podwyższoną temperaturę. Jest to związane z degradacją tRNAVal(AAC)
przez szlak szybkiej degradacji tRNA (RTD). Podsumowując, szczep trm4Δtrm8Δ nie rośnie w
37°C i obserwujemy w nim gwałtowne obniżenie poziomu tRNAVal(AAC) po przeniesieniu do
temperatury 37°C.
We współpracy z zespołem prof. Eric'a Phizicki'ego, odkrywcy szlaku degradacji RTD,
wskazano na rolę białka Maf1 w kontroli stabilności tRNA. Obserwowano, że nadekspresja genu
kodującego Maf1 przywraca wzrost termowrażliwego szczepu trm4Δ trm8Δ w podwyższonej
temperaturze i jest to związane ze stabilizacją hypomodyfikowanego tRNAVal(AAC). Ponieważ
Maf1 jest jedynym znanym represorem Pol III u drożdży Saccharomyces cerevisiae, wynik ten
wydawał się niespójny – dlaczego obniżenie transkrypcji miałoby powodować zahamowanie
degradacji? Nie powiodły się eksperymenty mające wykazać bezpośrednie oddziaływanie Maf1
w wiązanie tRNA i jego funkcję ochronną przed degradacją w stosunku do tRNA, dlatego
wykorzystano szereg mutantów ze zmienioną aktywnością Maf1 (wzmocnioną lub osłabioną) lub
zmienioną lokalizacją (tylko jądrową lub tylko cytoplazmatyczną). Analizy te wykazały, że
stabilizację tRNAVal(AAC) w trm4Δ trm8Δ zapewniają tylko mutanty Maf1 o aktywnej lub
hiperaktywnej funkcji represora Pol III. Wyniki te sugerowały, że wpływ Maf1 na RTD jest
bezpośrednio związany z jego aktywnością jako negatywnego regulatora Pol III.
By potwierdzić wpływ obniżenia transkrypcji na stabilizację tRNA, przygotowano szczep
trm4Δ trm8Δ rpc128-1007 z hypomodyfikowanym tRNAVal(AAC) i zmniejszoną aktywnością Pol
III. Mutacja, w drugiej co do wielkości podjednostce Pol III Rpc128, rpc128-1007 powoduje
silne efekty zmniejszając poziom transkrypcji o połowę i obniżającą totalną pulę tRNA do 75%.
W opisanym układzie doświadczalnym obserwowano przywrócenie wzrostu w podwyższonej
temperaturze oraz znacznie obniżony poziom degradacji po inkubacji w 37°C. Doświadczenie to
powtórzono w drugim układzie doświadczalnym, gdzie poziom innej podjednostki Pol III,
Rpc17, był obniżony w szczepie syntetyzującym hypomodyfikowane tRNAVal(AAC) poprzez
zastosowanie regulowanego promotora. Dodanie doksycykliny do pożywki pozwalało obniżyć
ekspresję genu RPC17 i obniżyć aktywność Pol III. W tym układzie także obserwowano
przywrócenie wzrostu w podwyższonej temperaturze oraz znacząco zmniejszony poziom
degradacji tRNAVal(AAC) w 37°C.
Wydawało się, że obniżenie aktywności Pol III i w konsekwencji zmniejszenie poziomu
całkowitego tRNA w komórce, może prowadzić do stabilizacji tRNA, poprzez bardziej wydajne
oddziaływanie z jakimś czynnikiem chroniącym hypomodyfikowane tRNA przed degradacją. By
zidentyfikować domniemany czynnik lub czynniki chroniące niestabilne tRNA przed RTD
wykonano klonowanie genów, które przywracały wzrost szczepu trm4Δ trm8Δ w podwyższonej
temperaturze. Wśród sklonowanych genów dwa kodowały białka wiążące tRNA – syntazę
walilo-tRNA oraz czynnik elongacji translacji eEF1A. Syntazy aminoacylo–tRNA katalizują
reakcję przyłączania aminokwasu do cząsteczki tRNA, natomiast eEF1A wiąże aminoacylowane-
tRNA i dostarcza je do rybosomu. W szczepach z nadekspresją każdego z tych genów
obserwowano stabilizację hypomodyfikowanego tRNAVal(AAC). Najprawdopodobniej jest to
związane z bezpośrednim oddziaływaniem tRNA-białko, które chroni niestabilne tRNAVal(AAC)
przed degradacją.
Najważniejsze wyniki powtórzono także dla układu tan1Δ trm44Δ, w którym niestabilne
jest tRNASer(CGA) i uzyskano spójne wyniki.
Na podstawie przedstawionych wyników zaproponowano powyższy model stabilizacji
hypomodyfikowanego tRNA, w którym stosunek tRNA do białek wiążących tRNA jest
kluczowy dla bezpośredniej ochrony przez rybonukleazami szlaku RTD. Stabilizację
hypomodyfikowanego tRNA można uzyskać poprzez zmniejszenie stosunku tRNA do białek
wiążących tRNA. Stabilizacja hypomodyfikowanego tRNA może zostać osiągnięta dwojako: (1)
przez zwiększenie poziomu białek bezpośrednio oddziałujących z niestabilnym tRNA, co
powoduje fizyczną ochronę przed degradacją lub (2) na drodze obniżenia globalnej puli tRNA
poprzez zmniejszenie aktywności Pol III. W konsekwencji w obu przypadkach dochodzi do
zmiany proporcji między tRNA, a białkami oddziałującymi z tRNA. Ochrona tRNA przed
degradacją przez białka wiążące tRNA, szczególne eEF1A, nie była wcześniej publikowana.