Monoclonal Mouse Anti-Human Prosteina Clone 10E3 Nr

Monoclonal Mouse
Anti-Human
Prosteina
Clone 10E3
Nr kat. M3615
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-Human Prostein, klon 10E3, jest przeznaczone do stosowania w
immunohistochemii. Przeciwciała te są przydatne w identyfikacji gruczolakoraków gruczołu krokowego (1).
Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z
wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa
z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
P501S (2)
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Monoklonalne mysie przeciwciała przeciwko prosteinie rozpoznają białko złoŜone z 553 aminokwasów
zidentyfikowane z zastosowaniem biblioteki cDNA metodą subtrakcyjną, w połączeniu z masowym badaniem w
kierunku raka gruczołowego gruczołu krokowego przy uŜyciu mikromacierzy (3). Białko prosteina, nazywane
równieŜ P501S, jest białkiem typu IIIa występującym w błonie komórkowej, ulegającym ekspresji wyłącznie w
komórkach prawidłowych gruczołu krokowego i komórkach nowotworów złośliwych gruczołu krokowego, co
potwierdzono przy uŜyciu metod Northern blot, mikromacierzy cDNA, real-time PCR oraz metod
immunohistochemicznych (1, 3). Ekspresja prosteiny nie została dotąd wykryta w innych prawidłowych bądź
nowotworowych tkankach gruczołowych poza 2/35 przypadkami raków z komórek nabłonka dróg moczowych, w
których odczyn immunologiczny był słaby i występował jedynie w mniej niŜ 25% komórek guza (1, 3, 4).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub instrukcje
do systemu detekcji IHC.
Odczynnik
dostarczony
Mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci nadsączu hodowli komórkowej o pH 7,2 w buforze
Tris/HCl o stęŜeniu 0,05 mol/l, zawierającego azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/l. Produkt zawiera białko
stabilizujące.
Klon: 10E3 (1). Izotyp: IgG2a, kappa.
StęŜenie mysich lgG [mg/l]: patrz informacja podana na etykiecie fiolki.
StęŜenie białek w róŜnych partiach moŜe się róŜnić bez wpływu na rozcieńczenie optymalne. W celu
zapewnienia jednolitości odczynów immunohistochemicznych wykonywanych przy uŜyciu róŜnych partii
produktu, miano kaŜdej partii jest porównywane i dostosowywane do partii referencyjnej.
Immunogen
Rekombinowana skrócona prosteina zawierająca aminokwasy 341-527 (1).
Swoistość
Wykazano, Ŝe monoklonalne mysie przeciwciała przeciwko prosteinie reagują z rekombinowanym fragmentem
prosteiny 21 kDa i z dubletem 50 kDa widocznym w badaniu Western blot lizatów komórek HEK293
transfekowanych w celu uzyskania ekspresji prosteiny. Przeciwciała przeciwko prosteinie wykrywały takŜe dublet
50 kD w testach blot lizatów komórek nowotworowych gruczołu krokowego LNCaP i PC3, przy czym przeciwciała
nie wykazywały reaktywności w testach Western blot wobec komórek Du145 ujemnych na obecność prosteiny i
nietransfekowanych komórek HEK293 (1). Przeprowadzono mapowanie epitopu rozpoznawanego przez
przeciwciała przeciwko prosteinie z zastosowaniem nakładających się peptydów, obejmujących sekwencję
aminokwasów immunogenu przeciwciała przeciwko prosteinie. W testach ELISA epitop rozpoznawany przez
przeciwciało przeciwko prosteinie zlokalizowano na aminokwasach 439-459 sekwencji prosteiny (1). Swoistość
przeciwciał przeciw prosteinie badano takŜe metodą cytometrii przepływowej na komórkach B utrwalonych EBV
(B-LCL) trwale transdukowanych retrowirusem wykazującym ekspresję prosteiny lub nieistotną cząsteczką HLAB8. Wykazano, Ŝe przeciwciała przeciwko prosteinie dają swoisty odczyn z permeabilizowanymi komórkami BLCL transdukowanymi w celu uzyskania ekspresji prosteiny. Przeciwciała nie reagowały z komórkami
wykazującymi ekspresję HLA-B8 (1). Przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej analiza linii komórkowych
LNCaP, PC3 i DU145 z przeciwciałami przeciwko prosteinie wykazała odczyn, którego występowanie było
skorelowane z danymi ilościowymi uzyskanymi metodą RT-PCR. W przypadku komórek przerzutowego
gruczolakoraka gruczołu krokowego z linii LNCaP silniejszy odczyn wykazywały komórki gruczolakoraka PC3, a
komórki raka DU145 nie wykazywały reaktywności (3).
(111654-003)
305824PL_ 003 p. 1/4
Środki ostroŜności
Przechowywanie
Skrócona instrukcja
uŜytkownika*
1.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
2.
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego
na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne.
W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
Krok
Utrwalanie
Obróbka wstępna
Komentarze
Formalina
EnVision FLEX™, High pH (nr kat. K8004)
ND
20 min HIER, 3 w 1 z uŜyciem PT Link
i PT Link Rinse Station
Rozcieńczenie
1:50
Inkubacja 20 min
Bufor do
rozcieńczania
Dako Antibody Diluent (nr kat. S0809).
Rozcieńczyć bezpośrednio przed
uŜyciem
Kontrola
negatywna
Wizualizacja
Negative Control, Mouse IgG2a (nr kat. X0943)
Inkubacja 20 min
EnVision™ FLEX, High pH (nr kat.
K8000/K8010)
Inkubacja 20 min, inkubacja w
odczynniku DAB+ 2x5 min
Barwnik
kontrastowy
Tkanka kontrolna
EnVision™ FLEX Hematoxylin (nr kat.
K8008/K8018)
Gruczoł krokowy
Inkubacja 5 min
Szkiełka
FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020)
Zaleca się stosowanie w celu
uzyskania lepszego przylegania
skrawków tkankowych do szkiełek.
Zatapianie
preparatu
Wymagane niewodne, trwałe zatapianie
preparatów
Po przeprowadzeniu barwienia,
skrawki muszą być odwodnione,
oczyszczone i zakryte za pomocą
środka do trwałego zatapiania.
Oprzyrządowanie
Autostainer Link 48 i Autostainer Plus
NaleŜy stosować fiolki dostosowane
do aparatu (nr kat. SK200-SK203 i
S3425)
Odczyn cytoplazmatyczny
*UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje
przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem.
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków
zatopionych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm.
Obróbka wstępna: Wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje po przeprowadzeniu na
tkankach HIER przy uŜyciu produktu EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8004).
Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie antygenu (HIER) moŜna przeprowadzić z uŜyciem Dako
PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link (PT
Link User Guide). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące parametry: Temperatura ogrzewania
wstępnego: 65°C; temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97° C przez 20 (±1) minut; ochłodzenie do 65°C.
Wyjąć stojak na szkiełka ze zbiornika PT i niezwłocznie zanurzyć szkiełka w słoju lub zbiorniku (np.
PTLinkRinseStation, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision™ FLEXWashBuffer (20x) (nr kat.
K8007) o temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1-5 minut.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia, skrawki muszą być
odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
(111654-003)
305824PL_ 003 p. 2/4
Procedura barwienia
Rozcieńczenie: Zaleca się rozcieńczenie przeciwciała Monoclonal Mouse Anti-Human Prostein, klon 10E3, nr
kat. M3615, w stosunku 1:50. NaleŜy rozcieńczyć przeciwciało w odczynniku Dako Antibody Diluent (nr kat.
S0809). Skrawki tkanek poddane obróbce wstępnej naleŜy inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Są to jednak wyłącznie wytyczne. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału lub
sposobu jego przygotowania i powinny być sprawdzone indywidualnie w danym laboratorium.
Kontrola ujemna: Zalecana kontrola ujemna to odczynnik Dako Negative Control, Mouse IgG2a (nr kat. X0943)
rozcieńczony do tego samego stęŜenia Ig, co przeciwciało pierwotne. O ile nie potwierdzono stabilności
rozcieńczonych przeciwciał i kontroli ujemnej w rzeczywistej procedurze wykonania odczynu, odczynniki te
naleŜy rozcieńczać bezpośrednio przed uŜyciem. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od
pacjentów naleŜy wykonywać pozytywne i negatywne próby kontrolne.
Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (nr kat. K8000/K8010) przy 20minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Postępować zgodnie z procedurą dostarczoną z wybranymi
systemami do wizualizacji.
Automatyzacja: Przeciwciała dobrze nadają się do wykonywania odczynów immunohistochemicznych w
systemach zautomatyzowanych, takich jak Dako Autostainer, Autostainer Plus oraz Autostainer Link, a takŜe do
obróbki wstępnej w aparacie PT Link.
Barwienie kontrastowe: Zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (nr
kat. K8008/K8018). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka
do zatapiania.
Kontrole: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać pozytywne i
negatywne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Tkanka uŜyta jako kontrola pozytywna powinna
pochodzić z gruczołu krokowego, a jej komórki/struktury powinny wykazywać wzór odczynu zgodny z opisem dla
tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Interpretacja
wybarwienia
Komórki wykazują wzór odczynu cytoplazmatycznego.
Charakterystyka
działania
Tkanki prawidłowe:
Wykazano reaktywność immunologiczną przeciwciał przeciwko prosteinie, wobec komórek nabłonkowych
prawidłowego gruczołu krokowego, nie stwierdzono jednak reaktywności w przypadku wszystkich pozostałych
badanych typów tkanek prawidłowych (1, 2, 5). W zdrowej tkance gruczołu krokowego komórki nabłonka
wykazują silny odczyn cytoplazmatyczny.
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Nadnercza (3)
Szpik kostny (3)
Gruczoły sutkowe (3)
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
MóŜdŜek (3)
0/3
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Trzustka (3)
Przytarczyce (3)
Przysadka mózgowa
(3)
Gruczoł krokowy (3)
Mózgowie (3)
0/3
Ślinianki (3)
Szyjka macicy (3)
0/3
Mięśnie szkieletowe
0/3
Jelito grube (3)
0/3
Skóra (3)
0/3
Przełyk (3)
0/3
Jelito cienkie (3)
0/3
Serce (3)
0/3
Śledziona (3)
0/3
Nerki (3)
0/3
śołądek (3)
0/3
Wątroba (3)
0/3
Jądra (3)
0/3
Płuca (3)
0/3
Grasica (3)
0/3
Komórki
międzybłonka (3)
Nerwy obwodowe (3)
0/3
Tarczyca (3)
0/3
0/3
Migdałki (3)
0/3
Jajniki (3)
0/3
Macica (3)
0/3
0/3
0/3
0/3
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
0/3
0/3
0/3
3/3 luminalne komórki
nabłonkowe (40–90%),
cytoplazmatyczny
0/3
Tkanki patologiczne: W ramach testów na wielu róŜnych tkankach nowotworowych wykazano brak reaktywności
immunologicznej przeciwciał przeciwko prosteinie wobec większości badanych tkanek nowotworów złośliwych
niepochodzących z gruczołu krokowego. Wykazano reaktywność immunologiczną prosteiny wobec większości
pierwotnych i przerzutowych typów raka gruczołu krokowego (193/203) (1,2,4–8). Nie stwierdzono związku
między ekspresją prosteiny a oceną w skali Gleasona ani statusem przerzutów (1).
(111654-003)
305824PL_ 003 p. 3/4
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Kalos M, Askaa J, Hylander BS, Repasky EA, Cai F, Vedvick T i inni Prostein expression is highly restricted
to normal and malignant prostate tissues. Prostate 2004;60:246.
Yin M, Dhir R, Parwani AV. Diagnostic utility of p501s (prostein) in comparison to prostate specific antigen
(PSA) for the detection of metastatic prostatic adenocarcinoma. Diagn Pathol 2007;2:41.
Xu J, Kalos M, Stolk JA, Zasloff EJ, Zhang X, Houghton RL, et al. Identification and characterization of
prostein, a novel prostate-specific protein. Cancer Res 2001;61:1563.
Chuang A-Y, DeMarzo AM, Veltri RW, Sharma RB, Bieberich CJ, Epstein JI. Immunohistochemical
differentiation of high-grade prostate carcinoma from urothelial carcinoma. Am J Surg Pathol 2007;31:124655.
Sheridan T, Herawi A, Epstein JI, Illei PB. The role of P501S and PSA in the diagnosis of metastatic
adenocarcinoma of the prostate. Am J Surg Pathol 2007;31:1351-5.
Owens CL, Epstein JI, Netto GJ. Distinguishing prostatic from colorectal adenocarcinoma on biopsy
samples: the role of morphology and immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med 2007;131:599-603.
Wang W, Epstein JI. Small cell carcinoma of the prostate: a morphological and immunohistochemical study
of 95 cases. Am J Surg Pathol 2008;32:65-71.
Osunkoya AO, Netto GJ, Epstein JI. Colorectal adenocarcinoma involving the prostate: report of 9 cases.
Human Pathol 2007;38:1836-41.
Wydanie 03/13
(111654-003)
305824PL_ 003 p. 4/4