Wyznaczanie struktury drugorzędowej białek metodą dichroizmu

Wyznaczanie struktury drugorzędowej białek metodą dichroizmu kołowego.
Zjawisko dichroizmu kołowego (CD - z ang. Circular Dichroism) znalazło szerokie
zastosowanie w badaniach konformacji biopolimerów w roztworze. W metodzie CD
wykorzystuje się występowanie aktywności optycznej w polipeptydach i białkach,
manifestującej się w skręceniu płaszczyzny polaryzacji światła oraz pojawieniu się
polaryzacji eliptycznej. Efekty te można wytłumaczyć następująco.
Przy wzbudzaniu próbki światłem spolaryzowanym liniowo można traktować wektor
elektryczny takiej fali świetlnej jako sumę wektorów elektrycznych dwóch, o tej samej
amplitudzie i fazie, lecz o przeciwnych kierunkach rotacji (polaryzacja prawo- i lewoskrętna),
spolaryzowanych kołowo fal świetlnych. W ośrodku aktywnym optycznie występują różnice
w prędkościach rozchodzenia się tych fal, (różnice we współczynnikach załamania światła),
jak i we współczynnikach absorpcji. Efekt pierwszej różnicy to przesunięcie w fazie
wektorów pola elektromagnetycznego obu składowych względem siebie, co prowadzi do
skręcenia wypadkowego wektora po przejściu przez ośrodek optycznie aktywny o pewien kąt.
Zaś różnica we współczynnikach absorpcji powoduje różnicę amplitud dla obu fal, co z kolei
prowadzi do pojawienia się polaryzacji eliptycznej.
Opisane efekty przedstawione są schematycznie na rysunku 1, gdzie: hL i hR - lewa i
prawa, kołowo spolaryzowana składowa światła, spolaryzowanego w płaszczyźnie α - kąt
skręcalności optycznej, φ - kąt eliptyczności.
Rysunek 1. Schemat polaryzacji eliptycznej (Siemion, 1985).
Występowanie różnic we współczynnikach absorpcji dla prawo- i lewoskrętnego,
spolaryzowanego kołowo promieniowania nosi nazwę dichroizmu kołowego. Jako miarę
wielkości tego zjawiska można użyć różnicę molowych współczynników absorpcji obu
rodzajów promieniowania:
lub kąt eliptyczności
– patrz rysunek powyżej.
W przypadku pomiarów CD w roztworze wygodnie jest wprowadzić wielkość
uwzględniającą długość drogi optycznej, oraz stężenie badanej substancji. Wielkość ta nosi
nazwę eliptyczności właściwej i wyraża się wzorem:
gdzie ψ – eliptyczność (mdeg), C' – stężenie [g/cm3]; l – długość drogi optycznej [cm].
Aby móc porównać wartości CD dla różnych substancji wprowadza się wielkość
zmianą eliptycznością molową:
gdzie ψ – eliptyczność (mdeg), C – stężenie molowe [M]; l – długość drogi optycznej
[cm].
Obecnie wykorzystywane spektropolarymetry mierzą bezpośrednio różnice
współczynników absorpcji. Natomiast początkowo CD określano poprzez pomiar
eliptyczności. Ze względów historycznych nadal powszechna jednostka dla CD jest
eliptyczność molowa, ponieważ zależność pomiędzy obiema wielkościami przyjmuje postać:
Pomiary widm CD (zależności sygnału CD od długości fali światła) znalazły szerokie
zastosowanie przy określaniu struktury drugorzędowej białek. Cząsteczki te, ze względu na
znaczącą aktywność optyczną, wykazują silny i zróżnicowany sygnał CD w paśmie absorpcji
wiązania peptydowego (160-240 nm) zależny od przyjmowanej struktury drugorzędowej.
Znaczne różnice w charakterze przebiegu widm CD dla poszczególnych rodzajów struktur
drugorzędowych (rys. 2) umożliwiają wyznaczenie ich procentowego udziału w całkowitej
strukturze białka. Analiza taka oparta jest głównie na metodach porównawczych,
wykorzystujących znajomość widm wzorcowych dla poszczególnych struktur
drugorzędowych. Można je poznać poprzez pomiar sygnału CD roztworu polipeptydu,
przyjmującego daną strukturę drugorzędowa. Lub poprzez analizę widma CD białek, których
struktura jest znana (np. z analizy rentgenograficznej).
Rysunek 2. Widma CD dla trzech struktur drugorzędowych: α-helisy (
helisa 31 (
), struktura nieregularna (
). (Kelly i in., 2005).
), β-kartka (
), β-skręt (
),
Analizę CD można wykonać również w zakresie absorpcji wiązań aromatycznych
(260-320 nm), uzyskując charakterystyczny dla białka kształt widma CD, zależny od
struktury trzeciorzędowej. Jest on często nazywany „odciskiem palca” dla danego białka.
Rysunek 3. Widmo bliskiego UV dla dehydrochinazy typu II (Kelly i in. 2005).
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest identyfikacja białek w trzech, badanych próbkach, oznaczonych
literami A, B, C.
Białka poddane badaniu to:
 lizozym z jaja kurzego,
 mioglobina z kaszalota,
 chymotrypsyna z trzustki wołowej.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotowanie aparatury pomiarowej.
Przeniesienie roztworu białka o stężeniu 0,1 mg/ml do kwarcowej kuwety
cylindrycznej o długości drogi optycznej 1mm.
Zmierzenie widm CD w zakresie długości fali 190-240 nm za pomocą
spektropolarymetru JASCO-710.
Opracowanie wyników za pomocą programu komputerowego dla dwóch baz widm
wzorcowych: Yang i Prot4, podanie przybliżonej procentowej zawartości α helisy, β kartki, β
skrętu i struktur nieuporządkowanych w poszczególnych próbkach.
Jak napisać sprawozdanie:
1. Opisać wykonanie ćwiczenia.
2. Wyszukać analizowane białka w bazie PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) i
określić zawartość struktur drugorzędowych w oparciu o algorytm DSSP.
3. Przyporządkować kody literowe białkom wraz z uzasadnieniem i przedstawić rezultaty w
formie zbiorczej tabeli.
4. Wykreślić zbiorczy wykres z widmami w jednostkach eliptyczności molowej oraz
rozkładem residuów.
5. Przedyskutować zdolność metody, ograniczenia i możliwości określania drugorzędowej
struktury. Porównać przydatność obu baz widm wzorcowych.
Wymagane wiadomości: Struktura białek, chromofory, absorpcja, dichroizm kołowy.
Literatura:
Siemion, Biostereochemia, PWN 1985.
van Holde, Principles of Physical Biochemistry, Pearson Education Ltd. 2006.
Kelly SM, Jess TJ, Price NC., How to study proteins by circular dichroism. Biochim Biophys
Acta. 2005 Aug 10;1751(2):119-39.