Laboratorium 02

Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
ĆWICZENIE 2
BUDOWA I FUNKCJE ENZYMÓW. ZASTOSOWANIE BADAŃ
ENZYMATYCZNYCH W INŻYNIERII ŚRODOWISKA.
/Opiekun merytoryczny: dr hab. Teodora M. Traczewska, prof. nadzw. PWr
modyfikacja: dr inż. Agnieszka Trusz-Zdybek i mgr inż. Maciej Bełcik/
1.
Zagadnienia szczegółowe:
budowa i mechanizm działania enzymów; kinetyka reakcji enzymatycznych; stała
Michaelisa; regulacja aktywności enzymatycznej; inhibitory enzymów; enzymy
allosteryczne – mechanizm działania; wpływ czynników zewnętrznych na aktywność
enzymatyczną (pH, temp.); jednostka aktywności enzymatycznej; podstawowe typy
enzymów i rodzaje katalizowanych przez nie reakcji; dehydrogenazy; test TTC – zasada i
sposób wykonania testu; metody wykrywania oraz mechanizmy działania aktywności
katalazowej, oksydazowej, ureazowej i proteolitycznej.
2.
Literatura zalecana
Pawlaczyk-Szpilowa M.: Biologia i ekologia, Oficyna Wyd. Polit. Wroc., s. 142-156.
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
Zad. 1: Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej osadu czynnego testem TTC.
Badanie wpływu czynników fizycznych i chemicznych na aktywność enzymatyczną
(temperatura, pH, związki toksyczne).
a) Badanie aktywności dehydrogenazowej w zależności od temperatury
Materiały:
- probówki
- Bufor Tris o pH 8,4
- Osad czynny
- Łaźnia wodna
- Roztwór TTC
Wykonanie:
Do sześciu probówek wlać pipetą Pasterowską po 1 cm3 buforu Tris o pH 8,4 i po 1
cm3 osadu czynnego (próbkę wcześniej uśrednić). Opisać następująco probówki:
10°C, 22°C, 37°C, 45°C, 60°C i 100°C. Probówkę opisaną jako „100°C” wstawić na
5 min. do łaźni wodnej o temp. 100°C, po czym schłodzić w strumieniu wody z
kranu do temp. pokojowej.
Następnie do wszystkich 6 probówek wprowadzić pipetą 0,5 cm3 roztworu TTC.
Probówki umieścić w odpowiednich temperaturach: probówkę „10°C ” w lodówce,
probówki „37°C” i „100°C” w termostacie o temp. 37°C, probówkę „45°C” w łaźni
wodnej o temp. 45°C, a probówkę „60°C” w łaźni wodnej o temp. 60°C. Probówkę
22°C pozostawić w temperaturze pokojowej. Próby pozostawić na min. 30 min
inkubacji.
b) Badanie aktywności dehydrogenazowej w zależności od odczynu.
Materiały:
- Probówki
- Bufory o różnych pH
- Osad czynny
- Roztwór TTC
Wykonanie:
Opisać 6 probówek: „pH 2”, „pH 4”, „pH 5”, pH 8,4”, „pH 10” i „pH 12”. Do
probówek wlać pipetą po 1 cm3 buforu o odpowiednim pH. Następnie do wszystkich
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
6 probówek wlać po 1 cm3 osadu czynnego (próbka uśredniona) i po 0,5 cm3
roztworu TTC. Próby umieścić na min. 30 min. w termostacie o temp. 37°C.
c) Badanie aktywności dehydrogenazowej w obecności substancji toksycznej (octan
ołowiu).
Materiały:
- Probówki
- Bufor Tris o pH 8,4
- Osad czynny
- Octan ołowiu
- Roztwór TTC
Wykonanie:
Opisać 2 probówki następująco: „Pb” i „K” (kontrola). Do obu probówek
wprowadzić pipetą po 1 cm3 osadu czynnego (próbka uśredniona) i po 1 cm3 buforu
Tris o pH 8,4. Następnie do probówki „Pb” wprowadzić 1 cm3 15% roztworu octanu
ołowiu (UWAGA: trucizna!), a do probówki „K” w celu uzyskania tych samych
proporcji 1 cm3 buforu Tris o pH 8,4. Do obu probówek dodać po 0,5 cm3 r-u TTC.
Próby inkubować w temp. 37°C przez min. 30 min.
Po 30 min. inkubacji prób wg a, b i c, należy ocenić wizualnie zmianę zabarwienia
próbki. Aktywność dehydrogenazowa w obecności TTC objawia się wystąpieniem
czerwonego zabarwiania wywołanego powstaniem produktu reakcji enzymatycznej TF. Intensywność zabarwiania zależy od aktywności enzymatycznej.
Określić wpływ badanych czynników na aktywność dehydrogenazową osadu
czynnego, wykonać wykresy aktywności enzymu w zależności od temperatury oraz
odczynu na podstawie otrzymanych danych.
Zad. 2: Wykrywanie aktywności oksydazowej osadu czynnego.
Materiały:
- Probówki
- Osad czynny
- Łaźnia wodna
- 1% roztwór pirokatechiny
Wykonanie:
Do 2 probówek wlać po 2 cm3 osadu czynnego (próbka uśredniona), probówki
opisać jako kontrola i próba badana. Próbę badaną wstawić do łaźni wodnej o temp.
100°C na 5 min., a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Do obu probówek wlać
po 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny. Próby inkubować w temp. 40°C przez min.
30 min.
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Zaobserwować zabarwienie w próbach i na podstawie zasady działania enzymów
oksydaz wyjaśnić jego pojawienie się.
Zad. 3: Wykrywanie aktywności katalazowej osadu czynnego.
a) Osad czynny
Materiały:
- Probówki
- Osad czynny
- Łaźnia wodna
- Nadtlenek wodoru - H2O2
Wykonanie:
Do 2 probówek wprowadzić po 1 cm3 osadu czynnego (próbka uśredniona),
probówki opisać jako kontrolę i próbę badaną. Próbę badaną włożyć na 5 min. do
łaźni wodnej o temp. 100°C, po czym schłodzić w strumieniu wody z kranu do temp.
pokojowej. Następnie do obu probówek wprowadzić po 0,5 cm3 roztworu H2O2 i
natychmiast obserwować pojawiające się zmiany.
*) Hodowle wybranych szczepów bakteryjnych na skosach agarowych
Materiały:
- Skosy agarowe z kulturami bakterii
- Nadtlenek wodoru
Wykonanie:
Na powierzchnię skosu agarowego z kulturą bakterii wlać sterylnie 0,5 cm3 roztworu
H2O2 i natychmiast obserwować pojawiające się zmiany.
Wyjaśnić zjawisko obserwowane w punkcie a /* bazując na zasadzie działania
enzymów katalazowych.
Zad. 4: Wykrywanie aktywności ureazowej osadu czynnego na podłożu mocznikowym.
Materiały:
- Podłoże zawierające mocznik
- Palnik
- Eza
- Osad czynny
Wykonanie:
Zaszczepić podłoże przy użyciu sterylnej ezy uśrednioną próbką osadu czynnego.
Inkubować w temp. 22°C przez min. 48h.
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Określić i zapisać barwę podłoża przed zaszczepem i po zaszczepieniu
Po czasie inkubacji opisać i wyjaśnić zaobserwowane zmiany.
Zad. 5: Wykrywanie aktywności proteolitycznej
Materiały:
- Słupek żelatynowy
- Palnik
- Igła preparacyjna
- Osad czynny
Wykonanie:
Dokonać posiewu metodą kłutą na słupek żelatynowy. Inkubować w temp. 20°C
przez min. 48h.
Opisać konsystencję żelatyny przed i po wykonaniu doświadczenia.
Po czasie inkubacji opisać i wyjaśnić zaobserwowane zmiany.