ćwiczenie 7 - Agnieszka Trusz

ĆWICZENIE 7
Metabolizm drobnoustrojów
Zad. 1. Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej drobnoustrojów testem TTC.
W procesie utleniania związków organicznych zużycie każdego atomu tlenu wiąże się
z pobraniem od substratu dwóch atomów wodoru. Pomiar ilości wodoru może być miarą
pobranego tlenu, w związku z czym skorzystano z możliwości oznaczania aktywności
dehydrogenaz za pomocą sztucznego akceptora atomów wodoru, który zmienia swoje
zabarwienie na skutek redukcji. Substancją taką jest chlorek trójfenylotetrazolowy - TTC,
który jest akceptorem atomów wodoru bezpośrednio ze zredukowanych układów
flawinowych. Bezbarwny TTC ulega redukcji do czerwonego formazanu (trójfenylofurazonu
– TF).
Badanie aktywności dehydrogenazowej
Do czterech probówek wlać pipetą po 1 cm3 buforu Tris o pH 8,4 i po 1 cm3 zawiesiny
drobnoustrojów. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml 1% roztworu glukozy, do drugiej
0,5 ml 2% sacharozy, do trzeciej 0,5 ml 0,1% roztworu skrobi, a do czwartej 0,5 ml 0,9%
roztworu NaCl (czwartą probówkę „K” włożyć do 1000C na 5 minut po czym schłodzić w
strumieniu wody z kranu do temp. pokojowej). Następnie do wszystkich 4 probówek
wprowadzić pipetą 0,4 cm3 roztworu TTC i umieścić probówki w termostacie o temp. 37°C.
Próby pozostawić na 30 min. Po 30 min. inkubacji określić aktywność dehydrogenazową
drobnoustrojów.
Zad. 2. Wykrywanie aktywności katalazowej drobnoustrojów
Katalaza, podobnie jak dehydrogenaza, należy do oksydoreduktaz. Jest to enzym
powszechnie występujący w komórkach organizmów tlenowych i jest jednym z najszybciej
działających enzymów (rozkłada truciznę – H2O2.). Mechanizm działania katalazy polega na
oderwaniu tlenu od jednej cząsteczki H2O2 i przeniesieniu go na drugą cząsteczkę H2O2.
W efekcie dochodzi do rozpadu obu cząsteczek nadtlenku wodoru i wytworzenia dwóch
cząsteczek H2O oraz wydzielenia tlenu. Reakcja przebiega więc następująco:
H2O2
+
H2O2
KATALAZA
2 H2O
+
O2
Badanie aktywności katalazowej
Do 2 probówek wprowadzić po 1 cm3 badanych drobnoustrojów. Jedną probówkę, opisaną
„K”, włożyć na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100°C, po czym schłodzić w strumieniu wody
z kranu do temp. pokojowej. Następnie do obu probówek wprowadzić po 0,5 cm3 roztworu
H2O2 i obserwować pojawiające się zmiany.
Zad. 3. Wykrywanie aktywności oksydazowej drobnoustrojów
Oksydazy są również enzymami z grupy oksydoreduktaz. Enzymy te przenoszą elektrony
z
utlenianego
substratu
bezpośrednio
na
tlen
cząsteczkowy.
Oksydazay
(wraz
z dehydrogenazami) tworzą w mitochondriach tzw. łańcuch oddechowy i katalizują procesy
oddychania komórkowego. W omawianym ćwiczeniu będzie wykrywana pewna specyficzna
grupa oksydaz nie biorących udziału w łańcuchu oddechowym. Przenoszą one elektrony
i protony ze związków fenolowych na tlen, dlatego są określane jako oksydazy fenolowe.
Związki fenolowe (np.pirokatechina) w wyniku utlenienia przechodzą w chinony, które
ulegają spontanicznej polimeryzacji z wytworzeniem ciemno zabarwionych barwników
melaninowych.
Badanie aktywności katalazowej
Do 2 probówek wlać po 2 cm3 osadu czynnego. Jedną probówkę wstawić do łaźni
z wrzącą wodą na 5 min., a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Do obu probówek wlać
po 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny. Próby inkubować w temp. 40°C przez 30 min.
Pojawienie się brunatnej barwy świadczy o aktywności oksydazowej próby.