recenzja 1 - Wydział Biotechnologii, UWr

Kraków, 24 września 2014
WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII
Zakład Biochemii Analitycznej
Kierownik
Prof. dr hab. Adam Dubin
RECENZJA
rozprawy doktorskiej Pana mgr Michała Kostasia
Tytuł rozprawy: Udział fibroblastycznych czynników wzrostu 1 i 2 (FGF-1 i FGF-2) w procesie
apoptozy
Zainteresowanie fibroblastycznymi czynnikami wzrostu ze zrozumiałych powodów nie słabnie
od czasu ich wyizolowania przez Gospodarowicza w 1975 roku. Według Web of Science ilość prac
zawierających w tytule te trzy słowa sięga ponad 14 000 a w ostatnich 5 latach publikowalność w tym
zakresie ustabilizowała się na poziomie ok. 1 000 prac rocznie. W skład rodziny fibroblastycznych
czynników wzrostu wchodzą 22 białka kręgowców z których czynniki 1-10 wiążą się do specyficznych,
komórkowych, transbłonowych receptorów czynników wzrostowych FGFR (1-4), posiadających
zewnątrzkomórkowe domeny podobne do immunoglobulin i wewnątrzkomórkowe o aktywności
kinazy tyrozynowej. Wiązanie FGF-1 czy FGF-2 do receptorów powoduje ich autofosforylację która
prowadzi do aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozliczne
procesy komórkowe takie jak proliferacja, migracja, angiogeneza czy rozwój zarodkowy.
Grupa badawcza prof. Jacka Otlewskiego i dr hab. Daniela Krowarscha zajmuje się od kilku lat między
innymi funkcją i stabilnością fibroblastycznych czynników wzrostu 1 i 2
w aspekcie badania
mechanizmu wiązania do receptorów i interakcji z białkami partnerskimi zaangażowanymi w proces
apoptozy oraz możliwościami ich zastosowania w terapii nowotworowej. Tak więc temat rozprawy
doktorskiej jest dobrze umocowany w dotychczasowej działalności badawczej promotora i
doświadczeniu Zakładów Inżynierii Białek i Biotechnologii Białek Wydziału Biotechnologii
Uniwersytetu Wrocławskiego.
Ogólna charakterystyka pracy
Ocenianą rozprawę przygotowano w języku polskim w tradycyjnym układzie tekstu i
zilustrowano 22 rysunkami oraz udokumentowano 333 pozycjami cytowanej literatury, z których
niemal połowę opublikowano po roku 2000.
ul. Gronostajowa 7
30-387 Kraków
tel. +48 (12) 664 6511; fax: +48(12) 664 6915
email: [email protected]
Autor w 25 stronicowym wprowadzeniu omawia krótko fibroblastyczne czynniki wzrostu i ich
specyficzne receptory ze szczególnym naciskiem na ich rolę w aktywacji wewnątrzkomórkowych
szlaków sygnałowych, ich translokacji do cytozolu i jądra komórkowego oraz charakteryzuje możliwe
białka partnerskie zaangażowane w procesie apoptozy.
W moim odczuciu ta część pracy, pomimo swojej niezbyt rozbudowanej formy, wystarczająco
wprowadza czytelnika w omawiany temat, jest nie tylko szczegółowo przemyślana ale i przystępnie
napisana poprawnym językiem.
Metody opisano na 19 stronach. Wynika z nich, że autor posłużył się standardowymi procedurami
biologii molekularnej w celu uzyskania białek rekombinowanych w heterologicznym systemie
bakteryjnym i oczyścił do homogenności w SDS-PAGE hormony wzrostu 1 i 2, nukleofosminę oraz
białkowy inhibitor apoptozy 5 metodami chromatografii powinowactwa i chromatografii
jonowymiennej. Z innych używanych przez autora metod należy wymienić biotynylację białek,
pomiary widm fluorescencji i dichroizmu kołowego, badanie oddziaływań białko-białko techniką
pulldown czy też z użyciem powierzchniowego rezonansu plazmowego.
Uzyskane wyniki opisane na 32 stronach są bardzo dobrze opracowane i udokumentowane 22
przejrzystymi rysunkami. Cała robiąca dobre wrażenie rozprawa doktorska jest zakończona 10
stronicową dyskusją z wnikliwym podsumowaniem.
Cel pracy, stan wiedzy oraz kompetencje autora
Wiedza zawarta we wstępie wprowadza w jasno sformułowany cel pracy którym jest próba
wyjaśnienia roli translokacji czynników wzrostu FGF-1 i FGF-2 przez błonę endosomalną do cytozolu i
jądra komórkowego. Zaplanowane badania powinny dostarczyć ewentualnego potwierdzenia
hipotezy, że białka te mogą pełnić funkcję antyapoptotyczną w warunkach stresowych poprzez
oddziaływania
z
potencjalnymi,
wcześniej
wskazanymi
wewnątrzkomórkowymi
białkami
partnerskimi.
Egzogenne FGF-1 czy FGF-2 poza aktywacją wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych związaną z
wiązaniem do receptorów mogą być też importowane do cytozolu i jadra komórkowego i wraz z pulą
endogennych form mogą spełniać rozliczne funkcje patofizjologiczne takie jak proliferacja
fibroblastów, astrocytów czy kardiomiocytów oraz wywierać wpływ na oporność komórek rakowych
na promieniowanie jonizujące czy chemioterapię poprzez zahamowanie procesów apoptozy.
Wykazano, że tranzlokacja nie jest procesem konstytutywnym lecz zachodzi w warunkach stresowych
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ
Zakład Biochemii Analitycznej
2
ale pełna rola czynników wzrostowych w cytozolu oraz jądrze komórkowym jest nadal nieznana więc
realizacja postawionego w rozprawie celu jest nadwyraz wskazana.
Mgr Michał Kostaś ma w swoim dotychczasowym dorobku dwie oryginalne prace współautorskie
opublikowane w 2014 roku a dotyczące opracowania odpornych na proteolizę wariantów FGF-1
(Kobielak i wsp., Protein Pept. Lett.) oraz charakterystyki oddziaływania wraz z określeniem funkcji
jądrowego białka nukleoliny w regulacji fosforylacji i jądrowego eksportu FGF-1 (Sletten i wsp., PLOS
One). Doktorant uczestniczył też wcześniej w badaniach, które doprowadziły do zidentyfikowaniu
szeregu wewnątrzkomórkowych białek partnerskich mogących oddziaływać z FGF-1 i FGF-2 a
zaangażowanych w procesie apoptozy takich jak: komórkowy antygen nowotworowy - p53, ligaza E3
ubikwityny - MDM2, deacylaza białkowa - situina 1, autoantygen błony naczyniowej - UACA
podjednostka katalityczna acetylotransferazy histonów - PCAF, czy kinaza 4 zależna od cyklin – CDK4.
Z krótkiej informacji zawartej w podziękowaniach oraz przestudiowaniu opisu użytych materiałów
można wywnioskować o wykonaniu części eksperymentów we współpracy z prof. Antonim
Więdłocha z Zakładu Biochemii Uniwersytetu Oslo od którego otrzymano miedzy innymi: wektory z
wstawkami zawierającymi sekwencje kodujące FGF-1 (Met-Ala-FGF121-154), FGF-2 (FGF21-154) oraz
wariant mutacyjny białka FGF-1 (S130A). Wektor z wstawką FGF-1 (Q40P/S47I/H93G udostępniła
Pani dr Małgorzata Zakrzewska.
Wyniki
Białka FGF-1 (fragment 21-151), SBP-FGF-1 białko fuzyjne ze metką wiążącą streptowidyną, FGF-2 (1154) oraz ich warianty mutacyjne nadprodukowano w E. coli i oczyszczano do formy homogennej
testowanej w SDS-PAGE. Podjęto próbę pojedynczego podstawiania biotyną na resztach aminowych
białek FGF-1 i FGF-2 ale udało się w jedynie w przypadku FGF-2. W związku z tym do dalszych badań
użyto białka fuzyjnego FGF-1 zawierającego metkę peptydową wiążącą streptowidynę (SBP-FGF-1).
Sprawdzono poprawność zwinięcia obu znakowanych białek poprzez pomiary widm dichroizmu
kołowego oraz wygaszania fluorescencji reszty tryptofanu w warunkach natywnych i po denaturacji.
Zastosowanie metody wygaszania fluorescencji do poprawności zwinięcia białka fuzyjnego SBP-FGF1 nie było możliwe z uwagi na fakt, że we fragmencie peptydowym wiążącym resztę streptowidyny
wprowadzono dodatkową resztę tryptofanu.
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ
Zakład Biochemii Analitycznej
3
Wykazano bezpośrednie oddziaływanie białek SBP-FGF-1 i biot-FGF-2 ze zidentyfikowanymi wcześniej
wewnątrzkomórkowymi białkami wiążącymi biorącymi udział w procesie apoptozy takimi jak: p53
(komórkowy antygen nowotworowy), MDM2 (ligaza E3 ubikwityny), Sirt1 (situina 1, deacetylaza
białkowa),
UACA
(autoantygen
błony
naczyniowej)
PCAF
(podjednostka
katalityczna
acetylotransferazy histonów) oraz CDK4 (kinaza 4 zależna od cyklin). Nie potwierdzono wiązania do
SBO-FGF-1 MDM2 oraz wykazano jedynie słabe wiązanie p53. Przeprowadzono wstępne pomiary
kinetyczne oddziaływań badanych białek przy pomocy techniki powierzchniowego rezonansu
plazmowego. Uzyskane równowagowe stałe dysocjacji rzędu 20-84 nM wskazują na dość silne
oddziaływania FGF-1 i FGHF-2 z badanymi białkami. Przeprowadzono szereg udanych
eksperymentów potwierdzających wpływ fibroblastycznych czynników wzrostowych (egzo- i
endogennych) na proces apoptozy wywołany czynnikiem stresowym. Przebadano efekt aktywatorów
białka p53 z zastosowaniem specyficznych inhibitorów aktywności kinazowej FGFR blokujących
wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe oraz wpływ mutacji w białku FGF-1 na zablokowanie
translokacji tego białka do cytozolu i jądra komórkowego. Wykazano efekt Inhibitorów HSP90 oraz
inhibitora kinazy p38 na antyapoptotyczną aktywność fibroblastycznych czynników wzrostu.
Wszystkie przeprowadzone eksperymenty są dobrze opisane i przedstawione w logicznej kolejności,
a zaprezentowane wyniki są dobrze umotywowane i zinterpretowane dając możliwość
przeprowadzenia klarownej i rzeczowej dyskusji i wyciągnięcia nie budzących zastrzeżeń rzetelnych
wniosków końcowych.
Ogólne odczucie i ewentualne pytania
Rozprawa doktorska mgr Michała Kostasia to opracowanie będące przykładem wzorowej krytycznej
oceny wyników uzyskanych przy pomocy wysokiej klasy warsztatu badawczego i dlatego zasługuje na
wyróżnienie. Praca jest napisana przejrzyście, bardzo dobrym językiem i właściwie, nie mam
zasadniczych uwag krytycznych co do strony merytorycznej jak i redakcyjnej. Nie znalazłem w
rozprawie niezgrabności językowych czy też niepoprawnych sformułowań też jest godne zaznaczenia.
Widać, że praca została nie tylko wzorowo zaplanowana, ale przede wszystkim dobrze przemyślana i
wielokrotnie sprawdzona redakcyjnie co zasługuje na szczególne wyróżnienie.
Lektura rozprawy doktorskiej nasuwa też następujące pytania do dyskusji.
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ
Zakład Biochemii Analitycznej
4
1. Wiadomo, że ludzki FGF-1 w porównaniu do FGF-2 jest słabiej rozpuszczalny, ma niższą
temperaturę denaturacji i relatywnie krótszy czas życia in vivo w związku z podatnością na proteolizę
i dlatego dla jego „ulepszenia” zastosowano z powodzeniem metody inżynierii białka w zespole prof.
Jacka Otlewskiego (Zakrzewska i wsp., J.Biol.Chem., 2009;
Slettern i wsp. , PLOS One, 2014).
Większość eksperymentów przeprowadzonych w pracy wymagała jednak użycia hormonu
niemodyfikowanego i napotkano na pewne trudności eksperymentalnych takich jak np. niemożność
wydajnego uzyskania, pojedynczo znakowanych biotyną cząsteczek FGF-1. W konsekwencji
zastosowano białko fuzyjne z metka wiążącą streptowidyną, co uniemożliwiło ze względu na
obecność reszty tryptofanu w zastosowanej metce, oznaczenia poprawności zwinięcia tego białka
fuzyjnego poprzez pomiary fluorescencji i dodatkowo utrudniło porównanie oddziaływań z
zastosowaniem obu różnie wyznakowanych hormonów. Nasuwa się pytanie czy te kłopoty
znakowania w przypadku FGF-1 związane są z niestabilnością białka czy raczej spowodowane są jego
charakterem. Oba hormony różnią się bowiem składem aminokwasowym, głównie w zakresie
aminokwasowych reszt naładowanych. FGF-1 jest nazywany kwasowym ponieważ zawiera w
sekwencji 28-151 o 9 ładunków dodatnich mniej od FGF-2 (4 reszty lizyny mniej i 5 reszt kwasu
glutaminowego i asparaginowego więcej) .
2. czy określano jaki był poziom endogennych FGF-1 i FGF-2 w trakcie eksperymentów (też w
transferowanych komórkach) w porównaniu do poziomu egzogennych hormonów i jaki procent
egzogennych hormopnów był translokowany do cytozolu i jądra?
Drobne uwagi krytyczne i niedociągnięcia:
- w całej pracy zastosowany mylne oznakowanie mutacji punktowych we wstawce FGF-1Q40P/S471/H93G
zamiast poprawnego FGF-1Q40P/S47I/H93G
- czy rzeczywiście próbki do SDS-PAGE inkubowano w 99oC przez 15 min a jeżeli tak to jaki był cel tak
długiej preinkubacji
- nie widzę uzasadnienia użycie na str. 46 nazwy bufor lizujący (str. 43)
- jakie inhibitory proteaz zastosowano w tzw. buforze lizującym?
Wskazane wydawałoby się wprowadzenie w rozprawach doktorskich zwyczaju zamieszczania
dotychczasowego dorobku publikacyjnego doktoranta z zaznaczeniem prac z zakresu tematu
rozprawy. Taka informacja klarowałaby obraz dokonań doktoranta oraz ustrzegłaby przed
ewentualnymi niesprawiedliwymi zarzutami recenzentów i czytelników.
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ
Zakład Biochemii Analitycznej
5
Podsumowanie oceny
Rozprawę doktorską Pana mgr Michała Kostasia oceniam bardzo wysoko tak pod względem
merytorycznym jak i redakcyjnym. Podziwiam klarowność wywodów, wielość stosowanych technik,
dokładność opisów wykonanych eksperymentów, skrupulatność oraz konsekwentność w realizacji
postawionych zadań i wreszcie formę oraz rzetelność przedstawienia wyników jak i ostrożność w
wyciąganiu wniosków i rzeczową krytyczną dyskusję.
Stwierdzam, że przedłożona rozprawa doktorska spełnia wszystkie warunki przewidziane Ustawą z
dnia 18 marca 2011 r. o stopniach naukowych i tytułach naukowych oraz tradycją dla prac
doktorskich a dorobek kandydata uzasadnia nadaniu stopnia naukowego doktora nauk biologicznych
w dyscyplinie biochemia.
Wnioskuję do Rady Naukowej Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego o dopuszczenie
Pana mgr Michała Kostasia do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
W moim odczuciu przedstawiona rozprawa doktorska, jej innowacyjność oraz fakt, że można ją
uznać jako zdecydowanie ponad przeciętną zasługuję na wyróżnienie. Dlatego z pełnym
przekonaniem zwracam się do Rady Naukowej Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego
z takim wnioskiem.
Prof. dr hab. Adam Dubin
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ
Zakład Biochemii Analitycznej
6