pobierz

Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 2, str. 225–234
PRACA ORYGINALNA – Original Article
WŁODZIMIERZ ŁUCZYŃSKI1, ANNA STASIAK-BARMUTA2, JAROSŁAW
PISZCZ3, ELśBIETA IŁENDO4,
OKSANA KOWALCZUK5, MARYNA
1
KRAWCZUK-RYBAK , JANUSZ KŁOCZKO3, LECH CHYCZEWSKI4, ADAM
PARFIEŃCZYK6, DOROTA HARASIUK5, BERNADETTA BLECHARCZYK7,
MARZENNA GALAR3, ELIZA BLUSIEWICZ3
Reakcja allogenicznych limfocytów T na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej
Reaction of allogeneic T-cells in response to chronic lymphocytic
leukemia-derived dendritic cells
1
Klinika Onkologii Dziecięcej
Kierownik: Prof. dr hab. med. Maryna Krawczuk-Rybak
2
Pracownia Cytometrii Przepływowej
Kierownik: Dr hab. med. Anna Stasiak-Barmuta
3
Klinika Hematologii
Kierownik: Prof. dr hab. med. Janusz Kłoczko
4
Pracownia Cytogenetyki Zakładu Pediatrycznej Diagnostyki Laboratoryjnej
Kierownik: Prof. dr hab. med. Jolanta Wysocka
5
Zakład Klinicznej Biologii Molekularnej
Kierownik: Prof. dr hab. med. Lecz Chyczewski
6
Zakład Medycyny Nuklearnej
Kierownik: Prof. dr hab. med. Franciszek Rogowski
7
Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Onkologii Dziecięcej, A.M. w Białymstoku
STRESZCZENIE
Przewlekła białaczka limfocytowa (B-CLL) jest najczęstszą białaczką w populacji dorosłych.
Z powodu przewlekłego przebiegu, braku efektywności konwencjonalnego leczenia oraz dostępności komórek nowotworowych we krwi obwodowej pacjentów, B-CLL stanowi idealny cel
immunoterapii. Ostatnio czynione są próby przekształcenia komórek CLL w komórki dendrytyczne prezentujące antygeny białaczkowe limfocytom T gospodarza. Uzyskana w ten sposób
szczepionka przeciwnowotworowa miałaby prowadzić do eliminacji nieprawidłowego klonu
komórek i wyleczenia pacjenta. Celem niniejszej pracy była ocena odpowiedzi limfocytów T na
komórki dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej za pomocą stymulacji CD40L. Materiał stanowiło 25 pacjentów z B-CLL, komórki białaczkowe hodowano
z obecnością lub bez CD40L i IL-4. Następnie z ten sposób uzyskane komórki wprowadzano do
mieszanej reakcji z allogenicznymi limfocytami T zdrowego dawcy. Ekspresję cząsteczek kostymulujących i adhezyjnych na powierzchni komórek nowotworowych oraz elementów świadczących o aktywacji limfocytów T przed i po hodowli oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Wyniki: 1) potwierdzono moŜliwość nabywania fenotypu komórek dendrytycznych
przez komórki CLL po stymulacji CD40L/IL-4 2) limfocyty T hodowane z komórkami dendry-
226 W. ŁUCZYŃSKI i wsp.
tycznymi uzyskanymi z komórek białaczkowych wykazywały cechy aktywacji. Uzyskane wyniki
świadczą o celowości prowadzenia dalszych w tym klinicznych badań nad szczepionką przeciwbiałaczkową opartą o system stymulacji CD40L.
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa – Immunoterapia – Komórki dendrytyczne – Limfocyty T
SUMMARY
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent leukemia in adult population. Because
of chronic course, lack of effectiveness of conventional treatment and availability of neoplasmatic cells in the peripheral blood, CLL can be an ideal target for immunotherapy. Lately, turning CLL cells into dendritic cells presenting leukemic antigens to the host T-cells has been undengang tests. Anticancer vaccine prepared in this manner could lead to the elimination of neoplasmatic clone and complete cure of the patient. The aim of the present study was to assess the
response of T-cells against CLL-derived dendritic cells (received with the use of CD40L and
IL-4 stimulation). The material consisted of 25 patients with CLL, the leukemic cells were cultured with the presence or absence of CD40L and IL-4. Then leukemic cells were cultured with
allogeneic T-cells obtained from the healthy donor. The expression of costimulatory and adhesion molecules on the surface of leukemic cells and activation molecules on T-cells before and
after the culture was assessed with flow cytometry. Results: 1) we confirmed the ability of leukemic cells to differentiate into dendritic cells after CD40L/IL-4 stimulation 2) T-cells cultured
with leukemia derived dendritic-cells showed the markers of activation. Our results testify that
immunotherapeutic experiments and trials in cancer vaccines based on CD40L stimulation
should continue to be performed.
KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukaemia – Lmmunotherapy – Dendritic cells – T-cells
WSTĘP
Przewlekła białaczka limfocytowa (B-CLL) jest najczęstszą białaczką w populacji
dorosłych. Jej patogeneza polega na kumulacji limfocytów B o fenotypie CD5+CD19+
w szpiku i krwi obwodowej. Od kilku lat trwają badania dotyczące interakcji pomiędzy
białaczkowymi komórkami B a limfocytami T u pacjentów z B-CLL. Wydaje się, Ŝe
limfocyty T pacjentów z CLL, być moŜe w wyniku immunosupresyjnego działania
komórek białaczkowych nie mogą rozpocząć, utrzymać i zakończyć odpowiedzi przeciwnowotworowej, a ich dysfunkcja moŜe być jednym z czynników patogenetycznych
białaczki [1]. W większości limfocyty T pacjentów z B-CLL nie posiadają aktywności
przeciwbiałaczkowej, spotanicznie pojawiające się komórki T skierowane przeciwko
komórkom B-CLL są jedynie wykrywane we wczesnych stadiach choroby. Czynność
komórek T u pacjentów z CLL ulega pogorszeniu w miarę rozwoju i progresji choroby
[2].
W warunkach prawidłowych aktywacja limfocytów T wymaga obecności komórek
prezentujących antygeny. Komórkami najsilniej stymulującymi prezentację antygenów
są komórki dendrytyczne. Do aktywacji limfocytów T potrzebne są dwa sygnały: specyficzne rozpoznanie peptydów w kontekście HLA oraz – niezaleŜna od antygenu –
kostymulacja. Komórki białaczkowe posiadają na swojej powierzchni antygeny HLA,
ale wykazują słabą ekspresję cząsteczek biorących udział w kostymulacji [3]. Rekonstrukcja funkcji kostymulującej oraz aktywacja limfocytów T gospodarza przeciwko
Reakcja alogenicznych limfocytów T
227
komórkom białaczkowym mogłaby być efektywnym narzędziem terapeutycznym
w eliminacji klonu nowotworowego. Do najwaŜniejszych cząsteczek kostymulujących
naleŜy rodzina B-7 (CD80, CD86) ulegająca ekspresji na komórkach prezentujących
antygeny. Natomiast cząsteczki CD28 i CD152 (CTLA-4) na limfocytach T funkcjonują jako receptory dla cząsteczek rodziny B-7. Na limfocytach T pacjentów z B-CLL
obserwuje się zmniejszenie ekspresji cząsteczek aktywacyjnych CD28 oraz wzrost
ekspresji CD152 – odgrywającej rolę hamującą w odpowiedzi immunologicznej –
zmiany te mogą odpowiadać za brak odpowiedzi przeciwbiałaczkowej w tej jednostce
chorobowej [4]. Wg innych autorów limfocyty T krwi obwodowej pacjentów ze złośliwymi chorobami hematologicznymi (w tym CLL) wykazują wzrost wskaźników
aktywacji w tym: CD69, HLA-DR, CD71, CD57 oraz zmniejszenie ekspresji CD62L
i CD28 (co równieŜ moŜe być interpretowane jako aktywacja limfocytów T) [5]. Natomiast obserwuje się dominację limfocytów bez cech aktywacji o profilu immunosupresyjnym Th2 [6]. Z punktu widzenia klinicznego do waŜnych cząsteczek ulegających
ekspresji na limfocytach T naleŜą: CD25, CD69, CD71, CD95 (Fas), HLA-DR,
CD45RA, CD45RO [7].
Z powodu przewlekłego przebiegu, braku efektywności konwencjonalnego leczenia oraz dostępności komórek nowotworowych we krwi obwodowej pacjentów,
B-CLL stanowi idealny cel immunoterapii. Ostatnio próbuje się przekształcić komórki
CLL w komórki dendrytyczne prezentujące antygeny białaczkowe limfocytom T gospodarza. Uzyskana w ten sposób szczepionka przeciwnowotworowa miałaby prowadzić do eliminacji nieprawidłowego klonu komórek i wyleczenia pacjenta. Najbardziej
zaawansowane prace badawcze i kliniczne dotyczą uŜycia do tego celu substancji
CD40L – uznanego stymulatora dojrzewania, proliferacji i prezentacji antygenów
przez prawidłowe limfocyty B [8].
Celem niniejszej pracy była ocena odpowiedzi limfocytów T na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej za pomocą stymulacji
CD40L.
MATERIAŁ I METODY
Materiał badawczy stanowiła krew obwodowa 25 pacjentów z rozpoznaną przewlekłą białaczką limfocytową (B-CLL). Przed pobraniem krwi pacjenci nie otrzymywali Ŝadnego leczenia, średni wiek badanych wynosił 64.5 lat, większość stanowili
męŜczyźni (14=56%), średnia leukocytoza krwi obwodowej wynosiła 108 tys/mm3.
Limfocyty T wyizolowano od jednego zdrowego dawcy. Eksperyment został zaakceptowany przez Komisję Bioetyczną Akademii Medycznej w Białymstoku, w kaŜdym
przypadku uzyskano świadomą zgodę pacjenta na pobranie krwi do badań.
Z krwi obwodowej pacjentów separowano komórki jednojądrzaste, następnie zamraŜano je powoli do temperatury –800C. Po odmroŜeniu, komórki CLL były hodowane w stęŜeniu 1×105/ml przez 96 godzin w medium w temperaturze 370C, w atmosferze 5% CO2. Do hodowli dodawano (lub nie) mieszaniny CD40L (3µg/ml, Amgen,
USA) i IL-4 (80 ng/ml, Sigma-Aldrich, USA). Przed i po hodowli pobierano część
228 W. ŁUCZYŃSKI i wsp.
komórek na badania w cytometrze przepływowym. Po hodowli z lub bez CD40L/IL-4
komórki CLL naświetlano dawką 30 Gy i umieszczano w mieszanej reakcji z allogenicznymi limfocytami T zdrowego dawcy w stosunku 1:3. Limfocyty T hodowano z:
komórkami CLL zmienionymi za pomocą CD40L/IL-4 (komórki dendrytyczne uzyskane z komórek CLL), niezmienionymi komórkami CLL oraz konkawaliną A (jako
kontrolnym stymulatorem). Mieszaną hodowlę limfocytów T prowadzono przez 96
godzin, następnie pobierano komórki na badania w cytometrze przepływowym.
Ocenę ekspresji antygenów powierzchniowych na komórkach wykonywano za
pomocą cytometrii przepływowej. Komórki B-CLL były analizowane przed i po hodowli z uŜyciem następujących przeciwciał: CD1a, CD11c, CD23, CD40, CD42a,
CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD137, CD137L, CD209, HLA klasy I, HLA-DR.
CD5, CD19 i CD23 są uwaŜane za markery CLL, ich ekspresja potwierdza białaczkowe pochodzenie komórek dendrytycznych uzyskanych po stymulacji CD40L/IL-4.
Pozostałe antygeny to cząsteczki kostymulujące, adhezyjne, aktywacyjne oraz markery
komórek dendrytycznych. Limfocyty T były oceniane przed i po mieszanej hodowli
z uŜyciem następujących przeciwciał: CD25, CD28, CD62L, CD69, CD71, CD45RA,
CD45RO, CD95, CD134, CD137, CD152, CD154, HLA-DR. Wymienione cząsteczki
są wskaźnikami aktywacji komórek T.
ANALIZA STATYSTYCZNA: Uzyskane dane wprowadzano do programu Statistica 6.0 dla Windows. Rozkład wyników nie był normalny, w związku z czym stosowano nieparametryczne testy statystyczne do analizy danych. UŜyto testów Wilcoxona
dla prób zaleŜnych i Manna-Whitneya dla prób niezaleŜnych. P < 0.05 uznano za statystycznie istotne.
WYNIKI
1) komórki B-CLL nabierają cech fenotypowych komórek dendrytycznych
Przed i po hodowli komórki CD5+CD19+CD23+ stanowiły >90% co potwierdza ich
nowotworowe pochodzenie. Po hodowli z CD40L/IL-4 obserwowano wzrost odsetka
komórek B-CLL z ekspresją najwaŜniejszych cząsteczek kostymulujących i adhezyjnych. Po hodowli z medium równieŜ zanotowano wzrost odsetka niektórych populacji
komórek, jednak nie był on tak znaczny jak po stymulacji CD40L/IL-4 – odsetek komórek B-CLL z ekspresją CD11c, CD54, CD80, CD86, CD123 wynosił odpowiednio
(podano wartości średnie): przed hodowlą 0.25%, 6.63%, 0.18%, 9.37%, 0.22%, po
hodowli z CD40L/IL-4: 2.36%, 49.76%, 6.42%, 33.87%, 2.48%. RóŜnice te były istotne statystycznie zarówno w odniesieniu do danych sprzed hodowli, jak i po hodowli z
samym medium.
2) komórki dendrytyczne uzyskane z komórek B-CLL stymulują aktywację limfocytów T
Dane uzyskane z cytometrii przepływowej dotyczące limfocytów T przedstawione
są w tabeli 1. W rozdziale tym omówiono wyłącznie róŜnice istotne statystycznie pomiędzy ocenianymi subpopulacjami limfocytów T.
Reakcja alogenicznych limfocytów T
229
Tabela 1. Subpopulacje limfocytów T przed i po mieszanej hodowli z komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej
Table 1. T-cell subpopulations before and after mixed culture with chroniclymphocytic leukemia-derived
dendritic cells
Grupa badana
Subpopulacja
limfocytów T
przed
hodowlą
CD4+CD25+
CD4+CD69+
(1)
11.55
4.98
po hodowli
z komórkami
B-CLL-DC
(2)
11.14
18.92
po hodowli
z komórkami
B-CLL
(3)
8.83
18.14
po hodowli
z konkawaliną
A
(4)
20.11
19.82
CD4+CD45RA+
58.10
46.64
53.71
45.88
CD4+CD45RO+
29.20
24.11
12.21
19.12
CD4+CD28+
CD4+CD152+
CD4+CD134+
57.70
2.61
3.65
44.21
2.59
33.71
51.42
4.38
16.50
49.35
4.40
32.17
CD4+CD62L+
CD4+CD95+
28.25
5.22
33.08
21.35
34.15
13.37
40.82
25.58
CD4+CD154+
1.63
11.72
11.77
23.35
CD4+CD71+
CD4+HLA-DR+
4.13
5.43
7.72
19.85
6.25
10.57
12.09
23.76
CD8+CD69+
3.94
20.07
15.92
23.64
CD8+CD45RA+
CD8+CD45RO+
40.90
35.40
41.15
14.16
44.07
17.42
50.23
17.07
CD8+CD28+
22.05
37.15
40.14
43.35
Statystyka
1 vs 4 p=0.01
1 vs 2 p=0.007,
1 vs 3 p=0.01,
1 vs 4 p=0.001
1 vs 2 p=0.01,
1 vs 3 p=0.01,
1 v 4 p=0.01
1 vs 3 p=0.02,
1 vs 4 p=0.03,
2 vs 4 p=0.03
2 vs 3 p=0.04
(–)
(–)
1 vs 2 p=0.0005,
1 vs 3 p=0.01,
1 vs 4 p=0.0001,
2 vs 3 p=0.02,
3 vs 4 p=0.01
1 vs 4 p=0.01
1 vs 2 p=0.003,
1 vs 3 p=0.04,
1 vs 4 p=0.0001
1 vs 2 p=0.01,
1 vs 3 p=0.01,
1 vs 4 p=0.0006
1 vs 4 p=0.01
1 vs 2 p=0.0005,
1 vs 3 p=0.02,
1 vs 4 p=0.0001,
2 vs 3 p=0.02,
2vs 4 p=0.04,
3 vs 4 p=0.003
1 vs 2 p=0.001,
1 vs 3 p=0.0005,
1 vs 4 p=0.003
2 vs 4 p=0.03
1 vs 2 p=0.04,
1 vs 3 p=0.006
1 vs 2 p=0.02,
1 vs 3 p=0.005,
230 W. ŁUCZYŃSKI i wsp.
CD8+CD152+
1.49
4.56
6.62
2.47
CD8+CD134+
5.29
22.83
15.30
28.52
CD8+CD137+
0.16
3.28
2.51
7.62
CD8+CD62L+
CD8+CD95+
30.74
3.74
24.73
17.18
25.45
17.21
29.13
14.82
CD8+CD154+
1.18
5.96
9.12
15.11
CD8+CD71+
0.85
5.72
5.45
7.74
CD8+HLA-DR+
8.28
15.96
11.42
19.92
1 vs 4 p=0.0001,
2 vs 4 p0.02
1 vs 2 p=0.02,
1 vs 3 p=0.04,
1 vs 4 p=0.01,
3 vs 4 p=0.03
1 vs 2 p=0.001,
1 vs 3 p=0.0008,
1 vs 4 p=0.01,
2 vs 3 p=0.04,
3 vs 4 p=0.04,
1 vs 2 p=0.01,
1 vs 3 p=0.04,
1 vs 4 p=0.002
(–)
1 vs 2 p=0.01,
1 vs 3 p=0.002,
1 vs 4 p=0.0005
1 vs 2 p=0.02,
1 vs 3 p=0.02,
1 vs 4 p=0.0001
1 vs 2 p=0.02,
1 vs 3 p=0.01,
1 vs 4 p=0.002
1 vs 2 p=0.009,
1 vs 4 p=0.01
2 vs 3 p=0.04,
3 vs 4 p=0.02
Po hodowli limfocytów T z kontrolnym stymulatorem tj. konkawaliną A zanotowano wzrost następujących subpopulacji limfocytów T pomocniczych: CD4+CD25+,
CD4+CD69+, CD4+CD134+, CD4+CD62L+, CD4+CD95+, CD4+CD154+, CD4+CD71+,
CD4+HLA-DR+ oraz limfocytów T cytotoksyczno-supresorowych: CD8+CD69+,
CD8+CD28+, CD8+CD134+, CD8+CD137+, CD8+CD95+, CD8+CD154+, CD8+CD71+,
CD8+HLA-DR+. Wyniki te świadczą o silnej stymulacji limfocytów T konkawaliną A,
potwierdzają poprawność wykonanego eksperymentu oraz stanowią odniesienie do
hodowli ze zmienionymi lub niezmienionymi komórkami białaczkowymi.
Po hodowli limfocytów T z komórkami białaczkowymi (zarówno stymulowanymi
CD40L/IL-4 jak i bez stymulacji) tj. w porównaniu do oceny przed hodowlą obserwowano wzrost subpopulacji limfocytów: CD4+CD69+, CD4+CD45RA+, CD4+CD95+,
CD4+CD154+, CD8+CD69+, CD8+CD28+, CD8+CD152+, CD8+CD137+, CD8+CD95+,
CD8+CD154+, CD8+CD71+. Wyniki te wskazują na stymulację limfocytów T przez
komórki białaczkowe w mieszanej hodowli. Jednak w zakresie w/w subpoplacji nie
zanotowano róŜnic istotnych statystycznie pomiędzy limfocytami T stymulowanymi
komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z komórek białaczkowych i niezmienionymi
komórkami białaczkowymi. Obserwowano natomiast wyŜszy odsetek subpopulacji
CD4+CD134+, CD4+HLA-DR+, CD8+CD134+, CD8+HLA-DR+ w grupie limfocytów T
Reakcja alogenicznych limfocytów T
231
hodowanych z komórkami dendrytycznymi w porównaniu do limfocytów T hodowanych z niezmienionymi komórkami białaczkowymi. Wyniki te świadczą o silniejszej
stymulacji limfocytów T przez zmienione komórki białaczkowe.
OMÓWIENIE WYNIKÓW
W naszym doświadczeniu potwierdziliśmy moŜliwość nabycia przez komórki CLL
cech fenotypowych komórek dendrytycznych – wskazuje na to istotny wzrost ekspresji
cząsteczek kostymulujących i adhezyjnych na ich powierzchni po hodowli
z CD40L/IL-4. Jeśli limfocyty T mają być uŜyte jako broń przeciwko tak zmienionym
komórkom białaczkowym powinny mieć własności krąŜenia, migracji przez endotelium, dostawania się do szpiku kostnego, ale przede wszystkim do lizy komórek nowotworowych – stąd konieczna jest ocena ich funkcji. Mimo istnienia wielu badań, dotychczasowe dane dotyczące odpowiedzi limfocytów T na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek białaczkowych są rozbieŜne. Z jednej strony analizuje się profil cytokin produkowanych przez stymulowane limfocyty T (Th1/Th2), z drugiej – ekspresję
cząsteczek aktywacyjnych na ich powierzchni. Ocena profilu wydzielanych cytokin
przez komórki T będzie przedmiotem następnej naszej pracy, w tym miejscu naleŜy
jedynie przytoczyć kilka opinii innych autorów. Wg Mohty i wsp. limfocyty T te prezentują profil cytokinowy typu 1 (produkcja IFN-γ, a nie IL-4 i IL-10) [9]. MoŜe to
mieć pozytywny efekt w przyszłej immunoterapii, gdyŜ właśnie limfocyty Th1 uwaŜa
się za znaczące w odpowiedzi przeciwnowotworowej. W eksperymencie badano jednak tylko reakcję limfocytów T CD4+CD45RA+ tzw. naiwnych. Podobnie, stymulacja
komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z blastów ostrej białaczki szpikowej (za pomocą CD40L) powodowała aktywację profilu Th1 a nie Th2, natomiast proliferacja
dotyczyła zarówno subpopulacji limfocytów CD4+ jak i CD8+ [10]. Odpowiedź na
pytanie, która subpopulacja limfocytów T odgrywa główną rolę w reakcji przeciwbiałaczkowej do dziś nie jest poznana. Badania Buhmann i wsp. w podobnych do naszych
eksperymentach, do reakcji z komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z komórek białaczkowych uŜywali zarówno limfocytów T autologicznych jak i allogenicznych [11].
Stwierdzili, Ŝe w reakcji autologicznej, komórkami odpowiedzialnymi za odpowiedź
przeciwbiałaczkową były limfocyty CD4+, zaś w allogenicznej – CD8+. Wyniki te
potwierdzają tezę, Ŝe anergia limfocytów T u pacjentów z B-CLL moŜe zostać odwrócona, jednak charakter odpowiedzi zaleŜy od klasy antygenów HLA w kontekście których prezentowane są antygeny nowotworowe. Z kolei w innym badaniu, w celu eliminacji reakcji allogenicznej klonów CD4+ niezgodnych w układzie HLA II klasy, badano wyłącznie reakcję limfocytów cytotoksycznych CD8+, limfocyty te wykazywały
wzrost proliferacji po stymulacji komórkami B-CLL aktywowanymi CD40L [12].
Nasze wyniki wskazują na silną aktywację limfocytów hodowanych w mieszanej
reakcji z komórkami białaczkowymi zarówno zmienionymi jak i niezmienionymi
(patrz Tabela 1). Jednak istotne róŜnice pomiędzy tymi dwiema grupa komórek
w stymulacji limfocytów T zanotowano wyłącznie w zakresie subpopulacji HLA-DR+
232 W. ŁUCZYŃSKI i wsp.
i OX40+, zarówno w zakresie komórek CD4+ jak i CD8+. Cząsteczki HLA-DR i OX40
są istotnymi wskaźnikami aktywacji limfocytów T. OX40(CD134) i 4-1BB(CD137)
naleŜą do rodziny receptora TNF i reprezentują najwaŜniejsze receptory kostymulujące
ulegające ekspresji na aktywowanych limfocytach T [13]. Cząsteczka 4-1BB posiada
szybszą i trwalszą kinetykę ekspresji na limfocytach T CD8+ niŜ OX40 [14]. Stymulacja OX40-OX40L prowadzi do generacji limfocytów T pomocniczych pamięci (CD4+).
W jednym z doświadczeń do komórek B-CLL wprowadzono geny CD40L oraz
OX40L [15]. Limfocyty T reagujące na zmienione w ten sposób komórki białaczkowe
były mieszaniną komórek CD4+ i CD8+, z przewagą CD4+, więcej było komórek
CD45RO+, nie zmieniała się równieŜ ekspresja CD62L oraz CCR7 – podobnie jak w
naszych badaniach. Podobnie równieŜ jak w naszym eksperymencie wzrastała ekspresja OX40 na limfocytach T CD4+, nie wykryto jej jednak na limfocytach CD8+. Wg
autorów opracowania to właśnie komórki CD45RO mogą być efektorowymi komórkami przeciwbiałaczkowymi. Podobną aktywację limfocytów T z koekspresją CD134
i CD25 zarówno na limfocytach CD4+ jak i CD8+ obserwowano w przewlekłej chorobie przeszczep-przeciwko-gospodarzowi po allogenicznej transplantacji komórek hematopoetycznych [16, 17]. W ocenie immunohistochemicznej limfocyty T naciekające
guzy jajnika w większości charakteryzowały się ekspresją cząsteczek HLA-DR [18].
Być moŜe aktywacja limfocytów T poprzez wzrost ekspresji OX40 i HLA-DR będzie
prowadziła do przełamania tolerancji komórek białaczkowych i ich eliminacji przez
układ immunologiczny pacjenta.
Nie wszystkie dane dotyczące zastosowania szczepionki przeciwko B-CLL opartej
na CD40L są zachęcające, np. Biagi i wsp. obserwowali tylko przejściową odpowiedź
limfocytów T gospodarza na szczepionkę [19]. Okazało się, Ŝe dochodziło do wzrostu
odsetka limfocytów T regulatorowych o profilu CD4+/CD25+/Lag-3+/FoxP-3+, które
najprawdopodobniej hamowały odpowiedź przeciwciałaczkową. Autorzy tego opracowania sugerują usunięcie tej subpopulacji limfocytów in vivo, co miałoby poprawić
odpowiedź na szczepionkę. W naszym badaniu nie obserwowaliśmy wzrostu subpopulacji limfocytów CD4+CD25+, jednak były to warunki in vitro i czas hodowli był krótki
(4 dni). Zdaniem niektórych autorów immunosupresja w białaczkach jest zbyt głęboka
by szczepionka mogła zadziałać – tym niemniej badania prowadzące to takich wniosków były przeprowadzone po intensywnej chemioterapii, która w CLL praktycznie
nie jest stosowana [20]. Z punktu widzenia metodologicznego istotny jest równieŜ
sposób zwiększenia immunogenności komórek B-CLL: wg niektórych autorów
transdukcja CD40L za pomocą wektorów wirusowych jest skuteczniejsza niŜ stymulacja za pomocą CD40L zastosowana w naszym doświadczeniu [21].
Zakładając, Ŝe to komórki białaczkowe wywołują anergię limfocytów T pacjentów
z B-CLL moŜna podjąć próbę nieco innego rozwiązania problemu braku odpowiedzi
przeciwnowotworowej, jak to dokonał Romano i wsp., tj. wyseparować limfocyty T
z krwi obwodowej chorych, a następnie zaktywować je in vitro za pomocą standardowych stymulatorów PMA i ionomycyny [22]. Po takiej stymulacji komórki T wykazywały ekspresję cząsteczek aktywacyjnych CD69 i CD40L. W ten sposób uzyskane
limfocyty T hodowane z autologicznymi komórkami B-CLL powodowały wzrost eks-
Reakcja alogenicznych limfocytów T
233
presji cząsteczek kostymulujących na powierzchni komórek białaczkowych, pobudzenie prezentacji antygenów przez nie oraz wzbudzenie w nich procesów apoptozy.
W jednym z pierwszych badań klinicznych z uŜyciem szczepionki przeciwbiałaczkowej opartej na komórkach nowotworowych z ekspresją CD40L i IL-2 wykazano jej
wysokie bezpieczeństwo oraz skuteczność: wśród 10 pacjentów z ostrymi białaczkami
8 pozostaje w remisji z okresem obserwacji od 27 do 62 miesięcy [23]. W krwi pacjentów szczepionych odnotowano reakcję zarówno ze strony odpowiedzi komórkowej
(profil limfocytów Th1 i Th2) oraz humoralnej (przeciwciała przeciwbiałaczkowe).
Limfocyty T wykazywały aktywację w tym wzrost ekspresji HLA-DR, podobnie jak w
naszym badaniu. Autorzy (podobnie jak my) nie obserwowali wzrostu liczby komórek
immunoregulatorowych Treg o profilu CD4+CD25+. MoŜe to równieŜ wskazywać na
korzystny efekt szczepionek opartych na stymulacji CD40L. Wydaje się, Ŝe immunoterapia oparta na szczepionkach na razie nie zastąpi konwencjonalnych metod leczenia
nowotworów. Wg większości autorów, podobnie zresztą naszym zdaniem, ze szczepionek przeciwbiałaczkowych będą mogli skorzystać głównie pacjenci z chorobą mało
zaawansowaną lub z tzw. chorobą resztkową po transplantacji komórek hematopoetycznych. Być moŜe terapia komórkowa oparta na limfocytach T będzie stosowana
we wczesnych stadiach choroby, lub teŜ łączona z chemioterapią lub leczeniem przeciwciałami [24].
Podsumowując, wykazano aktywację limfocytów T w odpowiedzi na komórki
dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki szpikowej. Skuteczność uzyskanej w ten sposób szczepionki powinna być oceniona w próbach klinicznych.
Praca dotowana przez grant KBN nr 2P05A 166 29
PIŚMIENNICTWO
1.
Scrivener S, Goddard RV, Kaminski ER, Prentice AG: Abnormal T-cell function in B-cell
chronic lymphocytic leukaemia. Leuk Lymphoma, 2003, 44: 383-389.
2.
Scrivener S, Kaminski ER, Demaine A, Prentice AG: Analysis of the expression of critical activation/interaction markers on peripheral blood T cells in B-cell chronic lymphocytic leukaemia: evidence
of immune dysregulation. Br J Haematol, 2001, 112: 959-964.
3.
Luczynski W, Stasiak-Barmuta A, Ilendo E i wsp.: Low expression of costimulatory molecules
and mRNA for cytokines are important mechanisms of immunosuppression in acute lymphoblastic leukemia in children ? Neoplasma, 2006, 53: 301-304.
4.
Frydecka I, Kosmaczewska A, Bocko D i wsp.: Alterations of the expression of T-cell-related
costimulatory CD28 and downregulatory CD152 (CTLA-4) molecules in patients with B-cell chronic
lymphocytic leukaemia. Br J Cancer, 2004, 90: 2042-2048.
5.
Van den Hove LE, Vandenberghe P, Van Gool SW, i wsp.: Peripheral blood lymphocyte subset
shift in patientswith untreated hematological tumors: evidence for systemic activation of the T cell compartment. Leuk Res, 1998, 22: 175-184.
6.
Porakishvili N, Roschupkina T, Kalber T, i wsp.: Expansion of CD4+ T cells with a cytotoxic
phenotype in patients with B-chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL). Clin Exp Immunol, 2001, 126:
29-36.
7.
Contreras JAV: Leucocyte activation markers in clinical practice. Clin Chem Lab Med, 1999,
607-622.
8.
von Bergwelt-Baildon M, Maecker B, Schultze J, Gribben JG: CD40 activation: potential for
specific immunotherapy in B-CLL. Ann Oncol, 2004, 15: 853-857.
234 W. ŁUCZYŃSKI i wsp.
9.
Mohty M, Isnardon D, Charbonnier A, i wsp.: Generation of potent Th1 responses from patients
with lymphoid malignancies after differentiation of B lymphocytes into dendritic-like cells. Int Immunol,
2002, 14: 741-750.
10. Cignetti A, Vallario A, Roato I, i wsp.: Leukemia-derived immature dendritic cells differentiate
into functionally competent mature dendritic cells that efficiently stimulate T cell responses. J Immunol,
2004, 173: 2855-2865.
11. Buhmann R, Nolte A, Westhaus D, Emmerich B, Hallek M: CD40-activated B-cell chronic lymphocytic leukemia cells for tumor immunotherapy: stimulation of allogeneic versus autologous T cells
generates different types of effector cells. Blood, 1999, 93: 1992-2002.
12. Hoogendoorn M, Wolbers JO, Smit WM, i wsp.: Generation of B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL)-reactive T-cell lines and clones from HLA class I-matched donors using modified B-CLL
cells as stimulators: implications for adoptive immunotherapy. Leukemia, 2004, 18: 1278-1287.
13. Ma BY, Mikolajczak SA, Danesh A, i wsp.: The expression and the regulatory role of OX40 and
4-1BB heterodimer in activated human T cells. Blood, 2005, 106: 2002-2010.
14. Lee SW, Park Y, Song A, i wsp.: Functional dichotomy between OX40 and 4-1BB in modulating effector CD8 T cell responses. J Immunol, 2006, 177: 4464-4472.
15. Biagi E, Dotti G, Yvon E, i wsp.: Molecular transfer of CD40 and OX40 ligands to leukemic
human B-cells induces expansion of autologous tumor-reactive cytotoxic T-lymphocytes. Blood, 2005,
105: 2436-2442.
16. Paz-Morante M, Briones J, Canto E, i wsp.: Activation-associated phenotype of CD3 T cells in
acute graft-versus-host disease. Clin Ex Immunol, 2006, 145: 36-43.
17. Sanchez J, Casano J, Alvarez MA, i wsp.: Kinetic of regulatory CD25high and activated CD134+
(OX40) T lymphocytes during acute and chronic graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow
transplantation. Br J Haematol, 2004, 126: 697-703.
18. Melichar B, Nash MA, Lenzi R, Platsoucas CD, Freedman RS: Expression of costimulatory
molecules CD80 and CD86 and their receptors CD28, CTLA-4 on malignant ascites CD3+ tumourinfiltrating lymphocytes (TIL) from patients with ovarian and other types of peritoneal carcinomatosis.
Clin Exp Immunol, 2000, 119: 19-27.
19. Biagi E, Rousseau R, Yvon E, i wsp.: Responses to human CD40 ligand/human interleukin-2
autologouscell vaccine in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res, 2005, 11
(19 Pt 1): 6916-6923.
20. Haining WN, Cardoso AA, Keczkemethy HL, i wsp.: Failure to define window of time for
autologous tumor vaccination in patients with newly diagnosed or relapsed acute lymphoblastic leukemia.
Exp Hematol, 2005, 33: 286-294.
21. Mayr C, Kofler DM, Buning H, i wsp.: Transduction of CLL cells by CD40 ligand enhances an
antigen-specific immune recognition by autologous T cells. Blood, 2005, 106: 3223-3226.
22. Romano C, DeFanis U, Sellitto A, i wsp.: Effects of preactivated autologous T lymphocytes on
CD80, CD86 and CD95 expression by chronic lymphocytic leukemia B cells. Leuk Lymphoma, 2003, 44:
1963-1971.
23. Rousseau RF, Biagi E, Dutour A, i wsp.: Immunotherapy of high-risk acute leukemia with a recipient (autologous) vaccine expressing transgenic human CD40L and IL-2 after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. Blood, 2006, 107: 1332-1341.
24. Bruserud O, McCormack E, Gjertsen B: Immunotherapy in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother, 2006, 55: 185-187.
Praca wpłynęła do Redakcji 27.12.2006 r. i została zakwalifikowana do druku 2.04.2007 r.
Adres do korespondencji:
Klinika Onkologii Dziecięcej
ul. Waszyngtona 17, 15-274 Białystok