Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR

Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 7, zeszyt 2, 72-80, 2014
Znaczenie współwystępowania polimorfizmów
genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu
ANNA LORENC 1, GRAŻYNA KURZAWIŃSKA1, 2, WITOLD KRAŚNIK1, HUBERT WOLSKI 1, 3
AGNIESZKA SEREMAK-MROZIKIEWICZ1, 2, KRZYSZTOF DREWS1, 2
Streszczenie
Cel pracy: Foliany pełnią kluczową rolę w syntezie i naprawie kwasów nukleinowych, reakcjach metylacji
i metabolizmie homocysteiny (Hcy). Dlatego zmiany w związanym z folianami metabolizmie jednostek
jednowęglowych mogą prowadzić do nieprawidłowego rozwoju płodu. Kluczowe reakcje w metabolizmie
kwasu foliowego i Hcy katalizują reduktaza 5,10-metylenoterahydrofolianowa (MTHFR), syntaza metioninowa (MS), reduktaza syntazy metioniny (MTRR) i transkobalamina II (TCII). Badaliśmy związek genetycznych wariantów tych genów z wewnątrzmacicznym ograniczeniem wzrostu płodu. Materiał i metoda:
Analizę genetyczną przeprowadzono używając metody PCR/RFLP. Badaliśmy sześć SNP w czterech genach
związanych z metabolizmem folianów: MTHFR (rs1801133, rs1801131, rs2274976), MTR (rs1805087), MTRR
(rs1801394), TCII (rs1801198) u 120 matek dzieci z hipotrofią (średnia waga urodzeniowa 1963,3 ± 601,0 g,
3,14 ± 2,83 percentyl) i u 120 zdrowych kobiet, które urodziły noworodka o prawidłowej masie (średnia
waga urodzeniowa: 3490,3 ± 351,3 g, 52,2 ± 25,9 percentyl). Wyniki: Analizując warianty 1298A > C i 1793A > G
MTHFR oraz 66A > G MTRR i 776C > G TCII nie uzyskano różnic statystycznie istotnych w częstości występowania genotypów i alleli. Dla polimorfizmu 677C > T MTHFR zaobserwowano przewagę częstości
występowania genotypu 677TT w grupie z hipotrofią (677TT: 11,7 vs 6,7% w grupie kontrolnej, WR = 1,85,
p = 0,13). Genotyp zmutowany 2756GG MTR występował dwukrotnie częściej w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną (4,2 vs. 2,5%, WR = 1,70, p = 0,36). Ocena współwystępowania genotypów badanych
polimorfizmów ujawniła wyższą frekwencję w grupie pacjentek z hipotrofią płodu kombinacji genotypów:
677TT MTHFR/ 776CG TCII (10,0 vs.2,5%, p = 0,01). Wnioski: Uzyskane wyniki dotyczące częstości
występowania genotypów oraz alleli polimorfizmów 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR, 2756A
> G genu MTR, 66A > G genu MTRR oraz 776C > G genu TCII nie wskazują na ich bezpośredni związek
z ryzykiem występowania hipotrofii płodu. Analiza współwystępowania badanych w pracy genotypów
wskazała na możliwość ich interakcji wpływającej na wzrost ryzyka hipotrofii, a zwłaszcza łącznego
wpływu wariantów: 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR, 2756A > G genu MTR oraz 776C > G genu
TCII.
Słowa kluczowe: hipotrofia płodu, metabolizm folianów, polimorfizm, MTHFR, MTR, MTRR, TCII
Wstęp
Hipotrofia płodu, czyli ograniczenie wewnątrzmacicznego wzrastania płodu (IUGR, ang. – intrauterine
growth restriction), jest wieloczynnikowym powikłaniem ciąży, które w skrajnym przypadku prowadzi
do zagrożenia życia płodu. Hipotrofię można rozpoznać, gdy dwukrotnie wykonane pomiary wykazują zbyt wolne tempo wzrastania płodu i/lub jego
masa ciała jest mniejsza niż 2 odchylenia standardowe lub 10 percentyla w stosunku do wieku płodowego w danej populacji [1]. W około 40% przypadków hipotrofii nie udaje się znaleźć jednoznacznej
1
przyczyny. W krajach rozwiniętych do najważniejszych czynników ryzyka zalicza się przede wszystkim palenie papierosów, zbyt mały przyrost masy
ciała ciężarnej i małą masę ciała matki przed ciążą.
Inne częste wymieniane czynniki ryzyka to rasa
czarna, pierwsza ciąża, żeńska płeć noworodka, niski
wzrost matki, wcześniejsze porody dzieci z małą
masą urodzeniową, infekcje wewnątrzmaciczne oraz
zaburzenia metaboliczne i genetyczne [2].
Udowodniono, że do prawidłowego rozwoju wewnątrzmacicznego płodu niezbędne jest utrzymanie
Klinika Perinatologii i Chorób Kobiecych, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Pracownia Biologii Molekularnej Kliniki Perinatologii i Chorób Kobiecych, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
3
Oddział Ginekologii i Położnictwa, Podhalański Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II w Nowym Targu
2
Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu
właściwego stężenia folianów w organizmie matki.
Niedobór folianów u ciężarnej wywołuje negatywny
wpływ na przebieg ciąży [3, 4]. Stąd wiele uwagi
poświęca się zbilansowanej diecie ciężarnej z uwzględnieniem suplementacji folianami. Na świecie najwięcej dzieci z małą masą urodzeniową każdego roku
przychodzi na świat w Indiach (około 40%), co przypisuje się diecie ubogiej w mięso i witaminę B12 [5].
Z drugiej strony zgodnie z hipotezą Barkera rozwojowego pochodzenia chorób wieku dorosłego
(DOHaD, ang. – Developmental Origin of Adult Diseases Hypothesis) nieprawidłowe żywienie w okresach intensywnego rozwoju organizmu: prenatalnym
i wczesnym okresie postnatalnym, powoduje nieodwracalne adaptacyjne zmiany strukturalne, funkcjonalne i metaboliczne. Zwiększają one szansę płodu
na przeżycie, ale poprzez zmiany epigenetyczne powodują wystąpienie chorób w późniejszym życiu [6].
Ponieważ właściwy rozwój wewnątrzmaciczny płodu
zależny m.in. od dostępności folianów, dlatego szczególne zainteresowanie budzą badania związane z ich
przemianami. Zaburzenia metabolizmu folianów,
przez nadmiar homocysteiny mogą wpływać na implantację i embriogenezę oraz upośledzać tworzenie
naczyń krwionośnych łożyska. Z kolei zahamowanie
syntezy zasad potrzebnych do budowy DNA oraz
upośledzenie metylacji DNA, może skutkować ograniczeniem proliferacji i różnicowania się komórek.
Wszystkie te procesy mogą prowadzić do rozwoju powikłań w przebiegu ciąży, w tym do zaburzeń wzrastania płodu [7, 8].
Uwarunkowania hipotrofii wynikające z obecności polimorfizmów genetycznych enzymów uczestniczących w metabolizmie homocysteiny są częstym
przedmiotem badań. Najlepiej poznanymi pod tym
względem są warianty genetyczne enzymu reduktazy
metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR; EC1.5.1.20):
677C > T i 1298A > C [9, 10]. Natomiast wpływ polimorfizmu 1793G > A na występowanie hipotrofii opisuje tylko jedno doniesienie [11]. W metabolizmie
folianów i jednostek jednowęglowych uczestniczy
wiele enzymów wymagających licznych substratów
i kofaktorów, które pełnią rolę w regulacji stężenia
homocysteiny i folianów w osoczu oraz stężenia
folianów w erytrocytach [12]. Kluczowym enzymem
jest reduktaza MTHF katalizująca reakcję powstawania z 5,10-metylenotetrahydrofolianu metabolicznie czynnego 5-metylotetrahydroksyfolianu (5-metylo-THF), niezbędnego do regulowania stężenia metioniny i homocysteiny. Remetylacja homocysteiny
73
katalizowana jest przez enzym syntazę metioniny
(MTR; EC 2.1.1.13) i zależy od dostępności donora
grupy metylowej (5-metylo-THF) oraz kofaktora metylokobalaminy. Aktywność enzymu MTR wymaga
obecności drugiego białka, reduktazy syntazy metioniny (MTRR; EC 2.1.1.135), który utrzymuje grupę
prostetyczną B12 w aktywnym zredukowanym stanie. Za transport witaminy B12 do komórki odpowiedzialna jest transkobalamina II (TCII). Polimorfizmy MTHFR 677C > T (A222V), 1298A > C (E429A),
1793G > A (R594Q), MTR 2756A > G (D919G), MTRR
66A > G (I22M) i TCII 776C > G (P259R) powodują
zmianę sekwencji aminokwasowej i mogą wpływać
na funkcję białka. Omawiane w pracy przemiany metabolizmu folianów, uczestniczących w nich białek
z uwzględnieniem badanych w pracy polimorfizmów
przedstawiono na rycinie 1.
Ryc. 1. Schemat metabolizmu folianów z zaznaczeniem omawianych w pracy polimorfizmów
Cel pracy
Celem pracy była ocena częstości występowania
genotypów i alleli oraz współwystępowania genotypów polimorfizmów wybranych genów metabolizmu
folianów i zbadanie ich związku ze wzrostem ryzyka
wystąpienia hipotrofii płodu.
Materiał i metodyka
Do badania zakwalifikowanych zostało 240 kobiet
zamieszkujących region Wielkopolski, będących pacjentkami Ginekologiczno-Położniczego Szpitala Klinicznego nr 3 w Poznaniu. Grupę badaną stanowiło
120 matek dystroficznych noworodków, których masę urodzeniową oceniono poniżej lub na poziomie 10.
percentyla, odpowiedniego do czasu trwania ciąży
lub więcej niż dwa standardowe odchylenia poniżej
średniej w stosunku do wieku ciąży (średnia masa
74
A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews
noworodka 1963,3 ± 601,2 g, 3,1 ± 2,8 centyl). Grupa
kontrolna składała się ze 120 zdrowych ciężarnych,
które urodziły noworodki z prawidłową masą ciała
(średnia masa noworodka 3490,3 ± 351,3 g, 52,2 ± 25,9
centyl). Średnia wieku pacjentek w obydwu badanych grupach nie różniła się istotnie (29,3 ± 5,8 vs.
30,3 ± 4,6 lat, p = 0,14), natomiast średni czas zakończenia ciąży był istotnie statystycznie niższy w grupie
badanej i wynosił 35,0 ± 3,2 tc. w porównaniu z grupą
kontrolną: 39,2 ± 1,3 tc. (p < 0,0001).
Z krwi obwodowej każdej pacjentki izolowano
DNA (QIAamp DNA Blood Mini Kit, Niemcy), a następnie oznaczano polimorfizmy z zastosowaniem
reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, ang. – polimerase chain reaction) i polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, ang. – restriction fragments length polymorphism). Metodykę zastosowaną
w pracy przyjęto zgodnie z podawaną w następujących pozycjach literatury: rs1801133 [13], rs1801131
[14], rs2274976 [15], rs1805087 [16], rs1801394 [17] oraz
rs1801198 [18].
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną uzyskanych w pracy wyników przeprowadzono z wykorzystaniem programu
statystycznego SPSS 22.0 PL dla Windows. Do weryfikacji hipotezy o nieistotności różnicy badanego rozkładu zmiennej z rozkładem normalnym używano
testu Kołmogorova-Smirnova z poprawką Lillieforsa,
dla dwóch zmiennych niepowiązanych test t-Studenta dla grup niezależnych. Do analizy statystycznej
badań genetycznych wykorzystywano test chi kwadrat oraz test Fishera, obliczano współczynnik ryzyka
(WR) przy uwzględnieniu odpowiednich przedziałów
ufności (95%PU). Zgodność rozkładu genotypów z prawem Hardy’ego-Weinberga przeprowadzono za pomocą testu chi kwadrat. Za istotne statystycznie przyjęto te o wartościach p < 0,05.
Wyniki
Wyniki dotyczące częstości występowania poszczególnych genotypów oraz alleli wszystkich badanych w pracy polimorfizmów genu MTHFR przedstawiono w tabeli 1. Zaobserwowano niewielką różnicę w częstości występowania genotypu homozygotycznego 677TT pomiędzy badanymi grupami (677TT:
11,7 vs 6,7% w grupie kontrolnej, WR = 1,85, p = 0,13).
Nie uzyskano również różnic w częstości występowania alleli tego polimorfizmu (677C : 69,6 vs. 68,7%, p =
0,46; 677T: 30,4 vs. 31,3%, p = 0,46).
W zakresie polimorfizmu 1298A > C genu MTHFR
analiza statystyczna nie ujawniła istotnych statystycznie różnic w częstości występowania genotypów:
1298AA: 45,0 vs. 48,3%, p = 0,52 1298AC: 47,5 vs. 46,7%,
p = 0,50 1298CC: 7,5 vs. 5,0% p = 0,30, pomiędzy grupą
badaną a kontrolną.
Podczas analizy polimorfizmu 1793G > A zaobserwowano nieco większą częstość występowania heterozygot 1793GA (10,0 vs. 7,5%,WR = 1,37, p = 0,32)
w grupie badanej oraz nieznaczną przewagę występowania zmutowanego allela 1793A w grupie badanej
(5,0 vs. 3,8%, WR = 1,35, p = 0,33). W obu badanych
grupach nie odnotowano obecności genotypu homozygotycznego zmutowanego 1793AA MTHFR.
Uzyskane dane dotyczące częstości występowania poszczególnych genotypów oraz alleli polimorfizmów 2756A > G MTR, 66A > G MTRR oraz 776C > G
TCII przedstawiono w tabeli 2. W zakresie polimorfizmu 2756A > G genu MTR zaobserwowano dwukrotnie częstsze występowanie genotypu zmutowanego
2756GG w grupie badanej w porównaniu z grupą
kontrolną (4,2 vs. 2,5%), co jednak nie stanowiło
istotnej statystycznie różnicy (WR = 1,70, p = 0,36).
Częstość występowania alleli tego polimorfizmu nie
różniła się pomiędzy grupą badaną i grupą kontrolną
(2756A: 78,3 vs. 77,1%, p = 0,41; 2756G: 21,7 vs. 22,9%,
p = 0,41).
W badaniu nie stwierdzono również istotnych
statystycznie różnic między grupą badaną i kontrolną
pod względem częstości występowania genotypów
polimorfizmu 66A > G MTRR oraz w zakresie częstości występowania alleli tego polimorfizmu (66A:
44,6 vs. 45,4%, WR = 0,97, p = 0,46; 66G: 55,4 vs. 54,6%,
WR = 1,03, p = 0,46).
W zakresie polimorfizmu 776C > G genu TCII zaobserwowano podobną częstość występowania genotypu zmutowanego 776GG w grupie badanej i grupie
kontrolnej (776GG: 20,0 vs. 22,5%, WR = 0,86, p = 0,37).
Również częstość występowania alleli 776C i 776G
były zbliżone w grupie badanej i kontrolnej (766C:
53,8 vs. 54,2%, WR = 0,98, p = 0,50; 766G: 46,2% vs.
45,8%, WR = 1,02, p = 0,50).
Współwystępowanie genotypów analizowanych
polimorfizmów w badanych grupach
Podczas analizy współwystępowania genotypów
polimorfizmów 677C > T i 1298A > C oraz 1298A > C
i 1793G > A genu MTHFR nie zaobserwowano żadnych różnic statystycznie istotnych między badanymi
Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu
75
Tabela 1. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmów 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR w grupie
matek noworodków z hipotrofią płodu oraz w grupie kontrolnej
Grupa kontrolna
(n = 120)
Hipotrofia płodu
(n = 120)
MTHFR
MTHFR
677C > T
MTHFR
1298A > C
MTHFR
1793G > A
wartość
obserwowana
n (%)
wartość
wartość
oczekiwana obserwowana
(%)
n (%)
WR
95%PU
p
wartość
oczekiwana
(%)
CC
61 (50,8)
48,4
53 (44,1)
47,3
1,31
0,76-2,24
0,18
CT
45 (37,5)
42,3
59 (49,2)
42,9
0,62
0,36-1,07
0,045
TT
14 (11,7)
9,3
8 (6,7)
9,8
1,85
0,68-5,29
0,13
suma
120 (100,0)
100,0
120 (100,0)
100,0
C
167 (69,6)
–
165 (68,7)
–
1,04
0,69-1,56
0,46
T
73 (30,4)
–
75 (31,3)
–
0,96
0,64-1,44
0,46
suma
240 (100,0)
–
240 (100,0)
–
AA
54 (45,0)
47,3
58 (48,3)
51,4
1,02
0,59-1,72
0,52
AC
57 (47,5)
43,0
56 (46,7)
40,6
1,03
0,60-1,77
0,50
CC
9 (7,5)
9,8
6 (5,0)
8,0
1,54
0,47-5,43
0,30
suma
120 (100,0)
100,0
120 (100,0)
100,0
A
165 (68,8)
–
172 (71,7)
–
0,87
0,57-1,31
0,27
C
75 (31,2)
–
68 (28,3)
–
1,15
0,76-1,73
0,27
suma
240 (100,0)
–
240 (100,0)
–
GG
108 (90,0)
90,3
111 (92,5)
92,6
0,72
0,26-1,97
0,32
GA
12 (10,0)
9,5
9 (7,5)
7,2
1,37
0,51-3,84
0,32
AA
0 (0,0)
0,3
0 (0,0)
0,2
–
–
suma
120 (100,0)
100,0
120 (100,0)
100,0
G
228 (95,0)
–
231 (96,2)
–
0,74
0,27-1,95
0,33
A
12 (5,0)
–
9 (3,8)
–
1,35
0,51-3,70
0,33
suma
240 (100,0)
–
240 (100,0)
–
allele
allele
allele
grupami kobiet zdrowych ciężarnych oraz matek
dzieci z hipotrofią. Analiza współwystępowania genotypów polimorfizmów 677C > T i 1793G > A wykazała częstsze występowanie kombinacji genotypów
677TT/1793GG w grupie badanej z hipotrofią płodu
(11,7 vs. 6,7%, WR = 1,85 PU 0,69-5,29, p = 0,13) oraz
kombinacji genotypów 677CC/1793GA (6,6 vs. 3,3%,
WR = 2,07, PU 0,53-9,64, p = 0,18).
W przypadku polimorfizmów 677C > T genu
MTHFR oraz 776C > G genu TCII zaobserwowano statystycznie istotnie częste współwystępowanie w grupie z hipotrofią genotypów 677TT/776CG (z dwoma
zmutowanymi allelami polimorfizmu 677C > T MTHFR
oraz jednym zmutowanym allelem polimorfizmu
776C > G TCII) (10,0 vs. 2,5%, WR = 4,33, PU 1,12-24,43,
p = 0,01).
Statystycznie istotną różnicę zaobserwowano
także podczas analizy współwystępowania polimorfizmów 1298A > C genu MTHFR oraz 66A > G genu
MTRR. Odnotowano częstsze współwystępowanie
genotypów 1298CC/66AG w grupie z hipotrofią (z dwoma zmutowanymi allelami polimorfizmu 1298A > C
MTHFR oraz jednym zmutowanym allelem polimorfizmu 66A > G MTRR) (5,8 vs. 0,8 w grupie kontrolnej,
WR = 7,37, p = 0,03). Ze względu na małą liczbę
pacjentek w badanych podgrupach obserwację tę
należy jeszcze poddać kolejnej analizie.
Dyskusja
Foliany, witamina B6 oraz B12 są ważnymi czynnikami wpływającymi na metabolizm homocysteiny
(Hcy). Hiperhomocysteinemia uważana jest za jeden
76
A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews
Tabela 2. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmów 2756A > G genu MTR, 66A > G genu MTRR
oraz 766C > G genu TCII w grupie matek noworodków z hipotrofią płodu oraz w grupie kontrolnej
Grupa kontrolna
(n = 120)
Hipotrofia płodu
(n = 120)
MTR, MTRR, TCII
MTR
2756A > G
MTRR
66A > G
TCII
776C > G
wartość
obserwowana
n (%)
wartość
wartość
oczekiwana obserwowana
(%)
n (%)
WR
95%PU
p
wartość
oczekiwana
(%)
AA
73 (60,8)
61,4
68 (56,7)
59,4
1,19
0,71-1,99
0,30
AG
42 (35,0)
33,9
49 (40,8)
35,3
0,78
0,46-1,32
0,21
GG
5 (4,2)
4,7
3 (2,5)
5,3
1,70
0,40-7,26
0,36
suma
120 (100,0)
100,0
120 (100,0)
100,0
A
188 (78,3)
–
185 (77,1)
–
1,07
0,70-1,65
0,41
G
52 (21,7)
–
55 (22,9)
–
0,93
0,61-1,43
0,41
suma
240 (100,0)
–
240 (100,0)
–
AA
23 (19,2)
19,9
23 (19,2)
20,6
1,00
0,53-1,90
0,57
AG
61 (50,8)
49,4
63 (52,5)
49,6
0,94
0,56-1,55
0,45
GG
36 (30,0)
30,7
34 (28,3)
29,8
1,08
0,62-1,89
0,44
suma
120 (100,0)
100,0
120 (100,0)
100,0
A
107 (44,6)
–
109 (45,4)
–
0,97
0,67-1,39
0,46
G
133 (55,4)
–
131 (54,6)
–
1,03
0,72-1,48
0,46
suma
240 (100,0)
–
240 (100,0)
–
CC
33 (27,5)
28,9
37 (30,8)
29,3
0,85
0,49-1,49
0,33
CG
63 (52,5)
49,7
56 (46,7)
49,7
1,26
0,76-2,10
0,22
GG
24 (20,0)
21,4
27 (22,5)
21,0
0,86
0,46-1,60
0,37
suma
120 (100,0)
100,0
120 (100,0)
100,0
C
129 (53,8)
–
130 (54,2)
–
0,98
0,69-1,41
0,50
G
111 (46,2)
–
110 (45,8)
–
1,02
0,71-1,46
0,50
suma
240 (100,0)
–
240 (100,0)
–
allele
allele
allele
z istotnych czynników ryzyka chorób o podłożu naczyniowym [19, 20]. Liczne doniesienia wskazują
także na jej możliwy udział w powstawaniu powikłań
położniczych, m.in. nawracających poronień, wewnątrzmacicznego obumarcia płodu, przedwczesnego
oddzielenia łożyska, a także ograniczenia wewnątrzmacicznego wzrastania płodu [21, 22]. Istnieją doniesienia o indukowaniu przez nadmiernie wysoki poziom homocysteiny apoptozy w komórkach trofoblastu i zmniejszeniu syntezy hCG in vitro, jak też
o zależnym od stężenia Hcy wzroście kurczliwości
myometrium izolowanego od ciężarnych, co razem
może prowadzić do samoistnego poronienia [19, 23].
W metaanalizie Hogeveen i wsp. badano związek stężenia całkowitej homocysteiny (tHcy) w surowicy
matki z masą urodzeniową noworodka. Stwierdzono,
że wyższe stężenia tHcy nieznacznie są związane ze
wzrostem ryzyka małej masy urodzeniowej [24].
Steegers-Theunissen i wsp. oceniali związek pomiędzy
hiperhomocysteinemią a powikłaniami ciąży o możliwym pochodzeniu naczyniowym. Zaobserwowano
związek podwyższonego poziomu homocysteiny na
czczo (WR = 1,9) oraz po teście obciążenia metioniną
(WR = 2,1) z występowaniem wewnątrzmacicznego
ograniczenia wzrastania płodu. Podobną korelację
potwierdzono dla nadciśnienia ciążowego [9].
W ostatnim czasie dużo uwagi poświęca się ocenie możliwego wpływu zaburzeń genetycznych
w metabolizmie folianów oraz jego wpływu na rozwój
powikłań położniczych, w tym hipotrofii płodu, z czego najwięcej dotyczy polimorfizmu 677C > T genu
MTHFR. Kupferminc i wsp. zaobserwowali, że obec-
Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu
ność wariantu 677TT MTHFR była częstsza wśród 110
kobiet z powikłaniami położniczymi (22% vs. 8%
w grupie kontrolnej, p = 0,005) [25]. Przewagę homozygotycznego genotypu 677TT wśród pacjentek z hipotrofią płodu w porównaniu z grupą kontrolną (27,3
vs. 8,2%, WR = 5,0) uzyskano również w pracy Alfirevic i wsp. (2002) [26]. Natomiast Murphy i wsp. badając wpływ polimorfizmu 677C>T genu MTHFR na
rozwój powikłań położniczych, w tym IURG, nie zaobserwowali żadnego związku istotnego statystycznie
(p = 0,7947) [27]. Do podobnych wniosków prowadzi
badanie Vespryck i wsp., przeprowadzone na grupie
matek noworodków z IUGR urodzonych we Francji.
Częstość występowania homozygotycznego genotypu 677TT MTHFR nie różniła się istotnie statystycznie pomiędzy grupą badaną a kontrolną (11,3 vs.
15,5%, p = 0,52) [28].
Engel i wsp. zaobserwowali nieznaczne zwiększenie ryzyka urodzenia dziecka z hipotrofią u nosicielek allela 677T genu MTHFR rasy białej (WR = 1,2).
Stwierdzono także u kobiet z genotypem zmutowanym 1298AA MTHFR zmniejszone ryzyko rozwoju
hipotrofii w porównaniu z pacjentkami z genotypem
1298CC (WR = 0,6). Nie stwierdzono różnic we wpływie powyższych polimorfizmów w zależności od podaży folianów w diecie [10]. W badaniu kohortowym
5867 pacjentek przeprowadzonym w Norwegii (Hordalan Homocysteine Study), zaobserwowano nieznaczne zwiększanie ryzyka wystąpienia hipotrofii
płodu wraz z ilością alleli 677T genu MTHFR (WR
dla genotypu 677CC: 1,0, dla 677CT: 1,1, dla TT: 1,2,
p = 0,04). Obecność genotypu 1298CC MTHFR wiązała
się z nieco niższym ryzykiem rozwoju hipotrofii płodu (WR = 0,8, p = 0,06) [29].
Ueda i wsp. nie zaobserwowali współzależności
pomiędzy stężeniem homocysteiny, folianów witaminy B12 w osoczu ciężarnych a polimorfizmem
677C > T genu MTHFR oraz występowaniem powikłań położniczych [30].
Niewątpliwie na wyniki prac duży wpływ ma wybór badanej populacji. Praca Klai i wsp. z Tunezji
wskazuje na możliwą rolę polimorfizmu 1298A > C,
ale nie 677C > T genu MTHFR w rozwoju IUGR. Uzyskano istotną statystyczną przewagę w częstości występowania zmutowanego genotypu 1298CC polimorfizmu 1298A > C MTHFR w grupie z hipotrofią (WR =
4,7, p = 0,001) [22].
W badaniu norweskiej grupy Fredriksen i wsp.
(2007) analizowano u 13 823 pacjentów związek parametrów biochemicznych (całkowitej homocysteiny
77
(tHcy), kwasu foliowego, witaminy B12, kwasu metylomalonowego (MMA), witamin B2 i B6 (PLP),
choliny, betainy, dimetyloglicyny (DMG), cystationiny, cysteiny, metioniny i kreatyniny) z wariantami
genetycznymi białek związanych z metabolizmem
jednostek jednowęglowych. Analizowano 13 polimorfizmów m.in. badane również przez nas warianty
MTHFR (677C > T, 1298A > C ), 2756A > G MTR,
66A > G MTRR i 766C > G TCII. Najsilniejszy związek
zaobserwowano w przypadku polimorfizmu 677C > T
MTHFR (wzrost tHcy, natomiast stężenia kwasu foliowego, betainy, DMG i PLP malały wraz z ilością alleli
677T). Wpływ na stężenie tHcy miały także polimorfizmy 1298A > C MTHFR i 2756A > G MTR. Statystycznie istotnego związku z żadnym z badanych parametrów biochemicznych nie stwierdzono dla polimorfizmu MTRR 66A > G. Transwersja 776C > G genu
TCII miała niewielki wpływ na stężenie tHcy, natomiast była związana ze wzrostem MMA, wskazując na
ograniczenie dostępności wewnątrzkomórkowej kobalaminy [12].
Jedyną pracą badającą polimorfizm 1793G > A
genu MTHFR w hipotrofii płodu jest praca z Meksyku, w której nie wykazano wpływu polimorfizmu
1793G > A, 677C > T oraz 1298A > C genu MTHRF na
masę urodzeniową płodu, niezależnie od spożycia
folianów oraz ekspozycji na ołów [11].
Obecnie prezentowane badanie nie ujawniło różnic istotnych statystycznie w zakresie częstości występowania genotypów i alleli wszystkich trzech badanych polimorfizmów genu MTHFR, co może wskazywać na brak bezpośredniego związku tych polimorfizmów z rozwojem hipotrofii płodu. Badając
współwystępowania genotypów zaobserwowano natomiast mieszczącą się na granicy istotności statystycznej wyższą częstość występowania kombinacji
677CT/1793GG w grupie kontrolnej (45,0 vs. 34,1%,
WR = 0,63, p = 0,05).
Furness i wsp. zaobserwowali, że częstość występowania genotypów polimorfizmu 2756A > C nie różniła się istotnie w grupach z IUGR (n = 18) i w grupie
kontrolnej (n = 42). Wyniki badania wskazały na możliwą rolę matczynego zmutowanego allela 2756G
w rozwoju niewydolności maciczno-łożyskowej
(obejmującej razem przypadki hipotrofii płodu i stanu przedrzucawkowego, p = 0,049), ale tylko u matek,
które nie były suplementowane dużymi dawkami
witamin z grupy B. Nie stwierdzono różnic istotnych
statystycznie w częstości występowania genotypów
polimorfizmu 66A > G genu MTRR pomiędzy bada-
78
A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews
nymi grupami oraz w stężeniu osoczowym folianów,
witaminy B12, homocysteiny w zależności od genotypów 66A > G MTRR ciężarnej [31].
Cytowana już poprzednio praca Engel i wsp.
oceniała także wpływ polimorfizmów 2756A > G genu
MTR i 66A > G genu MTRR na występowanie mniejszej masy urodzeniowej płodu. Częstości występowania genotypów nie różniły się istotnie statystycznie dla obydwu wariantów pomiędzy grupą badaną
i kontrolną zarówno dla rasy białej, jak i czarnej [10].
W prezentowanej pracy w badanych grupach
uzyskano podobną częstość występowania alleli. Badanie współwystępowania polimorfizmów 677C > T
genu MTHFR oraz 2756A > G genu MTR wykazało
istotnie statystycznie większą częstość współwystępowania genotypów 677CT/2756AG w grupie kontrolnej (20,8 vs. 11,6% w grupie badanej, WR = 0,50,
p = 0,04).
W zakresie polimorfizmu 66A > G MTRR w naszym badaniu, podobnie jak w powyżej cytowanych
pracach, nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupą badaną i kontrolną pod względem częstości występowania poszczególnych genotypów i alleli, co może wskazywać na brak jego bezpośredniego związku z rozwojem hipotrofii płodu
i jest zgodne z wynikami badań Fredriksen i wsp.
(2007) [12]. Uzyskane przez nas wyniki wskazują jednak na możliwy wpływ tego wariantu na rozwój
hipotrofii w koincydencji z innymi polimorfizmami
metabolizmu folianów.
Wśród dostępnego piśmiennictwa nie odnaleziono prac badających związek pomiędzy hipotrofią
płodu a polimorfizmem 766C > G genu transkobalaminy II. Obecna praca jest pierwszą próbą poruszenia tego zagadnienia. Zaobserwowano podobną częstość występowania alleli 766C (53,8 vs. 54,2%) oraz
776G (46,2% vs. 45,8%) w obydwu grupach. Ciekawą
obserwacją była analiza współwystępowania genotypów: w przypadku polimorfizmów 776C > G genu
TCII oraz polimorfizmu 677C > T genu MTHFR zaobserwowano częstsze współwystępowanie genotypów 677TT/776CG w grupie z hipotrofią (10,0 vs 2,5%,
WR = 4,33, p = 0,01), co stanowiło istotną statystycznie różnicę. Współwystępowanie genotypów polimorfizmów 66A > G genu MTRR oraz 776C > G genu
TCII ujawniło istotnie statystycznie większą częstość
występowania kombinacji genotypów 66AA/776GG w
grupie kontrolnej zdrowych kobiet ciężarnych (8,4
vs. 1,7% w grupie badanej, p = 0,02).
Analiza badanych w pracy wariantów genetycznych nie wykazała bezpośredniego związku z występowaniem hipotrofii płodu, jednak współwystępowanie genotypów wskazuje na możliwy wpływ
niektórych z nich na wzrost ryzyka hipotrofii. Badania polimorfizmów w genach kodujących białka związane z metabolizmem folianów mogą pomóc w zrozumieniu patomechanizmu powstawania hipotrofii
płodu, a co się z tym wiąże również jego wczesne
rozpoznanie i właściwy nadzór położniczy nad pacjentką.
Wnioski
1) Uzyskane wyniki dotyczące częstości występowania genotypów oraz alleli polimorfizmów
677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu MTHFR,
2756A > G genu MTR, 66A > G genu MTRR oraz
776C > G genu TCII nie wskazują na ich bezpośredni związek z ryzykiem występowania hipotrofii płodu.
2) Analiza współwystępowania badanych w pracy
genotypów wskazała na możliwość interakcji badanych polimorfizmów wpływającej na wzrost
ryzyka hipotrofii, a zwłaszcza łącznego wpływu
wariantów: 677C > T, 1298A > C, 1793G > A genu
MTHFR, 2756A > G genu MTR oraz 776C > G genu TCII.
Piśmiennictwo
[1] Haram K., Svendsen E., Myking O. (2007) Growth
Restriction: Etiology, Maternal and Neonatal Outcome. A Review. Curr Women’s Health Reviews. 3:
145-160.
[2] Valero De Bernabé J., Soriano T., Albaladejo R. i wsp.
(2004) Risk factors for low birth weight: a review. Eur.
J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 116: 3-15.
[3] Forges T., Monnier-Barbarino P., Alberto J.M. i wsp.
(2007) Impact of folate and homocysteine metabolism
on human reproductive health. Hum. Reprod. Update
13: 225-238.
[4] Bergen N.E., Jaddoe V.W.V., Timmermans S. i wsp.
(2012) Homocysteine and folate concentrations in
early pregnancy and the risk of adverse pregnancy
outcomes: the Generation R Study. BJOG. 119: 739-
751.
[5] Yajnik C.S., Deshmukh U.S. (2012) Fetal programming:
maternal nutrition and role of one-carbon metabolism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 13: 121-127.
[6] Barker D.J. (2004) The developmental origins of adult
disease. J. Am. Coll. Nutr. 23 (Suppl. 6): 588S-595S.
[7] Di Simone N., Maggiano N., Caliandro D. i wsp. (2003)
Homocysteine induces trophoblast cell death with
apoptotic features. Biol. Reprod. 69: 1129-1134.
Znaczenie współwystępowania polimorfizmów genów MTHFR, MTR, MTRR, TCII w hipotrofii płodu
[8] van Mil N.H., Oosterbaan A.M., Steegers-Theunissen
R.P. (2010) Teratogenicity and underlying mechanisms
of homocysteine on animal models: a review. Reprod
Toxicol. 30: 520-531.
[9] Steegers-Theunissen R.P., Van Iersel C.A., Peer P.G.
i wsp. (2004) Hyperhomocysteinemia, pregnancy
complications, and the timing of investigation. Obstet.
Gynecol. 104: 336-343.
[10] Engel S.M., Olshan A.F., Siega-Riz A.M. i wsp. (2006)
Polymorphisms in folate metabolizing genes and risk
for spontaneous preterm and small-for-gestational
age birth. American Journal of Obstetrics and Gyne-
cology 195: 1231-1231.
[11] Kordas K., Ettinger A.S., Lamadrid-Figueroa H. i wsp.
(2009) Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)
C677T, A1298C and G1793A genotypes, and the relationship between maternal folate intake, tibia lead
and infant size at birth. Br. J. Nutr. 102: 907-914.
[12] Fredriksen A., Meyer K., Ueland P.M. i wsp. (2007)
Large-scale population-based metabolic phenotyping
of thirteen genetic polymorphisms related to onecarbon metabolism. Hum. Mutat. 28: 856-865.
[13] Frosst P., Blom H., Milos R. i wsp. (1995) A candidate
genetic risk factor for vascular disease: a common
mutation in methylenetetrahydrofolate reductase.
Nat. Genet. 10: 111-113.
[14] Hanson N.Q., Aras O., Yang F. i wsp. (2001) C677T
and A1298C polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene: incidence and effect of
combined genotypes on plasma fasting and post-methionine load homocysteine in vascular disease. Clin.
Chem. 47: 661-666.
[15] Rady P.L., Szucs S., Grady J. i wsp. (2002) Genetic po-
lymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase
(MTRR) in ethnic populations in Texas; a report of
a novel MTHFR polymorphic site, G1793A. Am. J.
Med. Genet. 107: 162-168.
[16] Harmon D.L., Shields D.C., Woodside J.V. i wsp.
(1999) Methionine synthase D919G polymorphism is
a significant but modest determinant of circulating
homocysteine concentrations. Genet. Epidemiol. 17:
298-309.
[17] Wilson A., Platt R., Wu Q. i wsp. (1999) A common va-
present understanding and therapeutic implications.
Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 93: 157-165.
[22] Klai S., Fekih-Mrissa N., El Housaini S. i wsp. (2011)
Association of MTHFR A1298C polymorphism (but
not of MTHFR C677T) with elevated homocysteine
levels and placental vasculopathies. Blood Coagula-
tion & Fibrinolysis. 22: 374-378.
[23] Dudding T.E., Attia J. (2004) The association between
adverse pregnancy outcomes and maternal factor V
Leiden genotype: a meta-analysis. Thromb. Haemost.
91: 700-711.
[24] Hogeveen M., Blom H.J., den Heijer M. (2012) Mater-
nal homocysteine and small-for-gestational-age offspring: systematic review and meta-analysis. Am. J.
Clin. Nutr. 95: 130-136.
[25] Kupferminc M.J., Eldor A., Steinman N. i wsp. (1999)
Increased frequency of genetic thrombophilia in women with complications of pregnancy. N. Engl. J.
Med. 340: 9-13.
[26] Alfirevic Z., Roberts D., Martlew V. (2002) How strong
is the association between maternal thrombophilia
and adverse pregnancy outcome? A systematic review. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 101: 6-14.
[27] Murphy R.P., Donoghue C., Nallen R.J. i wsp. (2000)
Prospective evaluation of the risk conferred by factor
V Leiden and thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms in pregnancy. Arterio-
scler. Thromb. Vasc. Biol. 20: 266-270.
[28] Vespyck E., Le Cam-Duchez V., Goffinet F. et al.
(2002) Thrombophilia and immunological disorders
in pregnancies as risk factors for small for gestational
age infants. Br. J. Obstet. Gynaecol. 109: 28-33.
[29] Nurk E., Tell G.S., Refsum H. i wsp. (2004) Associations between maternal methylenetetrahydrofolate
reductase polymorphisms and adverse outcomes of
pregnancy: the Hordaland Homocysteine Study. Am.
J. Med. 117: 26-31.
[30] Ueda N., Reyes L., González-Medina A. i wsp. (2011)
Physiologic changes in homocysteine metabolism in
pregnancy: a longitudinal study in Spain. Nutrition.
27: 925-930.
[31] Furness D.L., Fenech M.F., Khong Y.T. i wsp. (2008)
One-carbon metabolism enzyme polymorphisms and
uteroplacental insufficiency. Am. J. Obstet. Gynecol.
riant in methionine synthase reductase combined
with low cobalamin (vitamin B12) increases risk for
spina bifida. Mol. Genet. Metab. 67: 317-323.
199: 276-278.
[18] Miller J.W., Ramos M.I., Garrod M.G. i wsp. (2002)
Transcobalamin II 775G > C polymorphism and indices of vitamin B12 status in healthy older adults.
Blood. 100: 718-720.
[19] Ayar A., Celik H., Ozcelik O. i wsp. (2003) Homocys-
teine induced enhancement of spontaneous contractions of myometrium isolated from pregnant women.
Acta Obstet. Gynecol. Scand. 82: 789-793.
[20] Refsum H., Ueland P., Nygard O. i wsp. (1998) Homocysteine and cardiovascular disease. Ann. Rev. Med.
49: 31-62.
[21] Aubard Y., Darodes N., Cantaloube M. (2000) Hyper-
homocysteinemia and pregnancy – review of our
79
J
Grażyna Kurzawińska
Pracownia Biologii Molekularnej
Klinika Perinatologii i Chorób Kobiecych
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
60-535 Poznań, ul. Polna 33
e-mail: [email protected]
80
A. Lorenc, G. Kurzawińska, W. Kraśnik, H. Wolski, A. Seremak-Mrozikiewicz, K. Drews
Significance of coexistence of MTHFR, MTR, MTRR, TCII gene polymorphisms
in fetal hypotrophy
Objectives: Folate plays a key role in synthesis and repair of nucleic acids, methylation reactions and
homocysteine (Hcy) metabolism. Therefore, alterations in the folate-mediated one-carbon metabolism may
lead to abnormal fetal development. The 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), methionine
synthase (MS), methionine synthase reductase (MTRR) and transcobalamin II (TCII) regulate key reactions
in the folate and Hcy metabolism. Therefore, we investigated whether the genetic variants of this genes are
associated with intrauterine growth restriction. Material and methods: Genotyping was performed by
PCR/RFLP method. We studied six SNPs in four folate metabolism genes: MTHFR (rs1801133, rs1801131,
rs2274976), MTR (rs1805087), MTRR (rs1801394), TCII (rs1801198) in 120 mothers of children with fetal
hypotrophy (mean birth weight 1963,3 ± 601,0 g, 3,14 ± 2,83 percentile) and in 120 healthy women, who
delivered normal weight neonates (mean birth weight: 3490,3 ± 351,3 g, 52,2 ± 25,9 percentile). Results: No
statistically significant differences were found in genotype and allele frequencies of the tested variants 1298
> C, 1793A > G MTHFR, and 66A > G MTRR, 776C > G TCII. For 677C > T polymorphism of MTHFR gene
higher frequency of 677TT genotype observed in the IUGR group (677TT: 11,7 vs 6,7% in control group, WR
= 1,85, p = 0,13). Mutated homozygous 2756GG genotype twice more frequent was observed in study group
compared to control (4,2 vs. 2,5%, WR = 1,70, p = 0,36). Analysis of coexistence of genotypes revealed in
study group the higher incidence of combination of genotypes: 677TT MTHFR/ 776CG TCII (10,0 vs. 2,5%,
p = 0,01). Conclusons: The results on the prevalence of genotypes and alleles of SNPs 677C > T, 1298 > C,
1793G > A MTHFR, 2756 > G MTR, 66A > G MTRR and 776C > G gene TCII not indicate their direct relationship with the risk of IUGR. Analysis of co-occurrence of genotypes indicated the possibility of interactions
affecting the increased risk of IUGR, especially the cumulative effect of variations: 677C > T, 1298 > C, 1793G
> A MTHFR, 2756 > G MTR and 776C > G gene TCII.