Paulina Gałka-Marciniak Projektowanie i charakterystyka wektorów

Paulina Gałka-Marciniak
Projektowanie i charakterystyka wektorów shmiR,
wykorzystujących proces interferencji RNA do wyciszania ekspresji ludzkich genów.
Naturalna zdolność regulacji ekspresji genów przez endogenne miRNA znajduje swoje
odzwierciedlenie w technologii RNAi powszechnie wykorzystywanej do wyciszania ekspresji
genów. Reagenty shmiR należą do narzędzi technologii RNAi, które włączają się w naturalną
ścieżkę biogenezy miRNA na jej wczesnym etapie. Cząsteczki te zbudowane są na podstawie
pierwotnych transkryptów miRNA. Posiadają one sekwencje otaczające oraz pętlę terminalną
pri-miRNA, podczas gdy fragment zawierający sekwencję dupleksu miRNA/miRNA* ulega
wymianie na sekwencję wstawki siRNA. Ze względu na wysoką efektywność działania oraz
niski poziom wzbudzania efektów ubocznych, reagenty shmiR są szeroko stosowane w
wyciszaniu ekspresji genów in vivo. Jednak wewnątrzkomórkowa ekspresja reagentów shmiR
oraz dwuetapowy proces ich obróbki powoduje trudności w kontrolowaniu precyzji
uwalniania z nich cząsteczek siRNA.
Przedstawiona w niniejszej pracy charakterystyka wewnątrzkomórkowej obróbki
reagentów shmiR prowadzona była z wykorzystaniem uzupełniających się metod:
wysokorozdzielczej hybrydyzacji typu northern oraz sekwencjonowania nowej generacji
(NGS). Natomiast do analizy efektywności działania uwalnianych cząsteczek siRNA
zastosowano ekspresję sekwencji docelowej w systemie lucyferazowym.
Do konstrukcji reagentów shmiR wykorzystano dotychczas kilka prekursorów miRNA,
dlatego pierwszym etapem prowadzonych badań była szczegółowa charakterystyka
reagentów shmiR, wykorzystujących najczęściej stosowane prekursory nośnikowe pri-miR30a oraz pri-miR-155 oraz rzadziej stosowany pri-miR-21. Uzyskane wyniki potwierdziły, iż
zarówno wyjściowe prekursory jak i stworzone na ich podstawie reagenty shmiR uwalniają w
komórkach niejednorodne cząsteczki miRNA lub siRNA. Wykazano, że wzór heterogenności
uwalnianych cząsteczek nie jest stały dla danej sekwencji siRNA ani dla zastosowanego
prekursora nośnikowego, a stanowi wypadkową połączenia tych dwóch elementów.
Ze względu na zagrożenia związane z heterogennością uwalnianych w komórkach
cząsteczek siRNA sprawdzono czy zastosowanie pri-miRNA nośnikowych naturalnie
uwalniających homogenne miRNA może przynieść korzyści w niektórych zastosowaniach
technologii RNAi. W tym celu wytypowano nowego kandydata spośród znanych prekursorów
miRNA, który charakteryzował się wysokim stopniem homogenności uwalnianych
cząsteczek. Wykazano, że konstruowane w oparciu o pri-miR-136 reagenty shmiR uwalniają
w komórkach siRNA o znacznie wyższej homogenności w stosunku do opisywanych
w literaturze nośników pri-miRNA. Zastosowanie pri-miR-136 nie gwarantuje zachowania
niezmienionych miejsc cięcia w stworzonych na jego podstawie reagentach shmiR, ułatwia
jednak powstawanie homogennych siRNA w komórkach. W celu określenia szczegółowych
uwarunkowań tego zjawiska sprawdzono jakie cechy pri-miR-136 oraz wykorzystujących
go reagentów shmiR wpływają na precyzję oraz efektywność komórkowej obróbki tych
cząsteczek.
W pierwszej kolejności analizie poddano strukturę drugorzędową reagentów shmiR oraz
ich przewidywaną strukturę przestrzenną. Sprawdzono wpływ elementów rozluźniających
strukturę trzonu cząsteczek shmiR na sposób ich obróbki oraz efektywność działania
uwalnianych siRNA. Przeprowadzona analiza wykazała, znaczenie symetrycznych motywów
strukturalnych (pętli wewnętrznych) w obrębie trzonu struktury spinki zarówno dla
efektywności jak i precyzji uwalniania cząsteczek siRNA. Na analizowanym przykładzie
wykazano, że obecność takich motywów w reagentach shmiR związana jest ze spadkiem
efektywności oraz wzrostem precyzji ich obróbki. Uzyskane wyniki wskazują również na
uczestnictwo asymetrycznego wybrzuszenia w obrębie trzonu reagentów shmiR w procesie
wyboru substratów dla RNazy Dicer.
W kolejnym etapie badań sprawdzono wpływ sekwencji nukleotydowej w miejscach
cięcia przez RNazy Drosha oraz Dicer. Przeprowadzona analiza bioinformatyczna
na podstawie danych NGS umożliwiła określenie różnic w sekwencji nukleotydowej
w obrębie miejsc cięcia pomiędzy grupą homogennych oraz heterogennych miRNA.
Wykonano również analizy szeregu zmutowanych cząsteczek shmiR, posiadających
substytucje nukleotydowe w miejscach cięcia przez RNazy. Uzyskane wyniki wykazały, że
sekwencja nukleotydowa uczestniczy w wyborze optymalnego miejsca cięcia przez
analizowane RNazy oraz wpływa na jego precyzję.
Podsumowując, wyniki przeprowadzonych badań umożliwiły wykazanie złożoności
elementów, wpływających na funkcjonowanie reagentów shmiR w komórkach oraz
pozwoliły na sformułowanie wskazówek pomocnych przy projektowaniu tego typu
reagentów.