recenzja1 - Instytut Chemii Bioorganicznej

Warszawa, 8 sierpnia 2015
Ocena pracy doktorskiej mgr Pauliny Gałki-Marciniak
pt. „Projektowanie i charakterystyka wektorów shmiR, wykorzystujących proces interferencji
RNA do wyciszania ekspresji ludzkich genów”
Przedstawiona do oceny praca, wykonana pod kierunkiem promotora prof. Włodzimierza J.
Krzyżosiaka oraz promotora pomocniczego dr Marty Olejniczak w Zakładzie Biomedycyny
Molekularnej Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN dotyczy ważnego zagadnienia
optymalizacji konstrukcji efektywnych wektorów shmiR, których zadaniem jest dostarczanie
do komórki specyficznych, homogennych siRNA, wyciszających ekspresję docelowych
genów człowieka, przy minimalnym efekcie niespecyficznym. Oceniana rozprawa wpisuje się
w tematykę badawczą zespołu Promotora, będącego w Polsce jednym z prekursorów badań
nad mikroRNA i szerzej nad czynnikami wpływającymi na proces interferencji RNA.
Rozprawa Pani Gałki-Marciniak rozpoczyna się typowo od spisu treści i liczącego 34 strony
wprowadzenia do przedmiotu rozprawy. Omówione zostają biogeneza i mechanizmy
działania miRNA i innych krótkich RNA wraz z zasadami wykorzystywania zjawiska
interferencji RNA do wyciszania ludzkich genów docelowych. Muszę przyznać, że rozdział
ten został napisany wzorcowo i czyta się go z największą przyjemnością.
Następnie wymienione są cele pracy i zaraz za nimi rozpoczyna się omawianie wyników.
Ponieważ Autorka podjęła decyzję o umieszczeniu rozdziału „Materiały i Metody” pod
koniec swojej rozprawy, czytelnik zmuszony jest dla lepszego zrozumienia opisywanych
wyników przeskakiwać do tyłu rozprawy w celu znalezienia dokładniejszego opisu
przedstawianych eksperymentów. Równocześnie należy podkreślić, iż wykorzystane metody
zostały opisane bardzo szczegółowo, co dowodzi znakomitego warsztatu Doktorantki. Jedyna
moja uwaga do tej części Rozprawy dotyczy braku pełnej informacji dotyczącej
eksperymentu sekwencjonowania nowej generacji (NGS), do czego jeszcze wrócę niżej.
Za rozdziałem „Wyniki” liczącym 58 stron, znajduje się 20-stronicowa „Dyskusja”, po której
Autorka przedstawia wnioski płynące z wykonanych prac. Rozprawę kończy streszczenie w
języku polskim i angielskim, wspomniany już rozdział „Materiał i Metody” (24 strony) oraz
bibliografia, wykaz skrótów, wykaz publikacji Autorki i źródła finansowania badań.
Lista cytowanych prac jest imponująca i w dużej mierze, poza publikacjami klasycznymi,
których nie brakuje, zawiera artykuły z najnowszych kilku lat, w tym z bieżącego roku 2015.
Cytowane publikacje są trafnie dobrane, co było niełatwe, bo literatura dotycząca zarówno
mikroRNA, jak i interferencji RNA jest bardzo rozległa. Pokazuje to z jak godnym podziwu
zapałem Autorka śledzi najnowsze doniesienia i, pomimo obszerności materiału
literaturowego, w pełni go opanowała.
Pierwszym celem Rozprawy było scharakteryzowanie wad i zalet najczęściej stosowanych
nośników siRNA, jakimi są pri-miR-30a i pri-miR-155, a następnie zaproponowanie ich
modyfikacji lub wręcz alternatywnych rozwiązań (innych pri-miRNA), dzięki którym
dostarczane siRNA byłoby bardziej homogenne, optymalnie pozbawione efektu siRNA z
drugiej nici spinki, a więc o mniejszym sumarycznym efekcie „off-target”. Cele pracy są
ambitne, adekwatne do aktualnego stanu wiedzy i stanowią bardzo logiczną konsekwencję
wcześniejszych odkryć Zespołu Profesora Krzyżosiaka. Optymalizacja odczynników
wykorzystywanych do wyciszania ludzkich genów jest zadaniem niezmiernie ważnym o
potencjalnie olbrzymim znaczeniu w biotechnologii i medycynie.
W rozdziale „Wyniki” Autorka konsekwentnie przedstawia wszystkie etapy realizacji celów
Rozprawy. Prezentacja wyników jest w dużej części przejrzysta i zrozumiała, kolejne kroki
jasno wynikają z poprzedzających je eksperymentów.
Mam następujące pytania i uwagi odnośnie rozdziału „Wyniki”:
1. Rycina 16: opis ryciny sugeruje przesunięcie miejsca cięcia przez Dicer w kierunku
pętli terminalnej w shmiR-hsa-155b w stosunku do -155, czego na rycinie nie
zauważam; również łatwiej by było docenić poprawę efektywności obróbki reagenta
przez Dicer, gdyby ekspresja shRNA i siRNA była przedstawiona na jednym blocie.
ul. Banacha 1A, blok F, 02-097 Warszawa
tel. +48 22 599 21 89
http://medycynagenomowa.wum.edu.pl
www.wum.edu.pl
2. Rycina 19 i kolejne opisujące eksperymenty w systemie lucyferazy: wyniki
normalizowano względem lucR, ale nie jest dla mnie zrozumiałe z jaką kontrolą je
porównywano, w „Metodach” (str. 148 podane jest, że porównywano z kontrolą
nietraktowaną NC, ale w opisie wszystkich rycin NC oznacza pusty wektor
ekspresyjny, co więcej względna ekspresja żadnej kontroli na rycinie 19 nie jest równa
1).
3. Rozdział 2.7 „Wpływ ekspresji shmiR na poziom endogennych miRNA” – na
podstawie eksperymentu NGS wyciągnięto daleko idący wniosek, że „ekspresja
reagentów shRNA nie prowadzi do globalnych zaburzeń w ekspresji endogennych
miRNA”, co bez wątpienia ma kluczowe znaczenie. Nie jestem jednak pewien, czy
brak „istotnych” globalnych zmian w ekspresji mirnomu nie wynika ze sposobu
przeprowadzenia eksperymentu NGS, m.in. skrajnie małej liczby analizowanych
próbek. W „Metodach” (str. 146) napisano, że analizowano 5 próbek transfekowanych
różnymi shRNA, ale nie wiadomo, z jaką liczbą próbek kontrolnych je porównywano.
Jaką uzyskano całkowitą liczbę odczytów dla poszczególnych próbek? Jak jednorodne
były to liczby? Rycina 20 przedstawia zmianę ekspresji 10 miRNA, ale na jakim
poziomie znamienności (FDR) i przy jakim poziomie ekspresji (RPM)?
4. Rycina 22 i kolejne przedstawiające ekspresję uwalnianych siRNA o różnej długości –
metoda NGS jest, w przeciwieństwie do hybrydyzacji Northerna, metodą w pełni
ilościową, stąd też warto by było podać liczbę odczytów (RPM) dla każdego wariantu
siRNA.
5. Rozdział 4.1 „Wybór nośnikowego pri-miRNA” – podano szereg słusznych kryteriów,
na podstawie których wybrano optymalne nośnikowe dwa pri-miRNA (pri-miR-20a i
pri-miR-136); bez wątpienia znacznie więcej miRNA spełnia podane kryteria, stąd
ciekaw byłbym, jak dokładnie przebiegał proces wyboru nośnika.
W rozdziale Dyskusja Autorka przeprowadziła analizę uzyskanych wyników. Na ich
podstawie można stwierdzić, że recenzowana rozprawa ma charakter nowatorski i stanowi
znaczący wkład w reprezentowaną dziedzinę nauki, a szereg opisanych cech budowy nośnika
siRNA, wpływających na jego efektywność i specyficzność, istotnie poszerza naszą wiedzę
na temat procesu optymalnego budowania odczynników shmiR.
ul. Banacha 1A, blok F, 02-097 Warszawa
tel. +48 22 599 21 89
http://medycynagenomowa.wum.edu.pl
www.wum.edu.pl
W trakcie lektury tej ciekawej i dobrze napisanej Rozprawy, oprócz uwag wymienionych
wcześniej nasunęły mi się następujące pytania:
1. Powszechnie przyjmuje się, że Dicer tnie z mniejszą precyzją niż Drosha, z tego
powodu Autorka sugeruje (str. 46), że siRNA powinno się lokować w ramieniu 5’
nośnika shmiR– ma to zmniejszać ryzyko heterogenności po stronie cięcia przez
Drosha, czyli istotnego ze względu na lokalizację „jądra wiązania” końca 5’. Jeśli
założenie byłoby słuszne, znane miRNA, generowane z ramienia 3’ prekursora, jako
grupa powinny mieć większą heterogenność końca 5’ (cięcie DICER) niż miRNA
generowane z ramienia 5’. Czy tak rzeczywiście jest?
2. Jaka jest przewaga hybrydyzacji Northerna nad metodą sekwencjonowania nowej
generacji (NGS)? Autorka podaje, że obie metody są komplementarne w tym zakresie,
że hybrydyzacja Northerna dodaje do wyników NGS informację na temat pre-miRNA
(albo shRNA), której brakuje w NGS. Z tym argumentem akurat trudno się zgodzić,
jako że przy odpowiednim zaprojektowaniu eksperymentu NGS, bez problemu
uzyskujemy informację dot. dłuższych fragmentów RNA, w tym shRNA tudzież premiRNA, ale z pewnością są inne zalety hybrydyzacji Northerna.
W podsumowaniu recenzji mam przyjemność stwierdzić, że rozprawa mgr Pauliny GałkiMarciniak spełnia wszystkie wymagania stawiane pracom na stopień doktora nauk i stawiam
wniosek o dopuszczenie Autorki do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie,
wnioskuję o wyróżnienie tej pracy doktorskiej.
ul. Banacha 1A, blok F, 02-097 Warszawa
tel. +48 22 599 21 89
http://medycynagenomowa.wum.edu.pl
www.wum.edu.pl