Odwrotna transkryptaza Verte M-MLV

Novazym
NOVAZYMProducts
Products
Novazym
NovazymPolska
Polskaul.
ul.Żywokostowa
Żywokostowa23,
23,61-680
61-680Poznań,
Poznań,tel.
tel.+48
+480061
61610
61039
3910,
10, fax
fax+48
+480061
61610
610
39
3911,
11,email
[email protected]
[email protected]
Odwrotna transkryptaza Verte M-MLV
Opis produktu
Odwrotna Transkryptaza Verte M-MLV jest produktem genu pol mysiego wirusa leukemii Moloneya. Ze względu na swoją
aktywność polimerazy DNA zależnej od RNA pozwala na syntezę complementary DNA (cDNA) o długości do 5000 pz.
W przeciwieństwie do odwrotnej transkryptazy AMV (ang. Avian Mieloblastosis Virus), odwrotna transkryptaza M-MLV
posiada tylko szczątkową aktywność RNazy H.
Aktywność RNazy H – przejawia się specyficzną degradacją nici RNA w hybrydach RNA:DNA. Aktywność RNazy H może nie
wywierać znaczącego wpływu na ilość DNA, jeżeli całość syntezy komplementarnej nici DNA jest większa niż degradacja
RNA, związana z jej aktywnością.
Reakcja odwrotnej transkrypcji może zachodzić jedynie w obecności jonów Mg
2+
. Odwrotna transkryptaza Verte M-MLV
2+
wymaga do prawidłowej pracy jonów Mg .
Skład buforu reakcyjnego odwrotnej transkryptazy M-MLV (5x):
700 mM Tris-HCl, pH 8.3 / 25 °C, 166 mM (NH4)2SO4, 75 mM MgCl2
Stężenie: 200 U/µl
Przechowywanie: -20 °C
Lot. Nr 01-04032012-p2601
Exp. date 04.03.2013
Ograniczenia w zastosowaniu: Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został
przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów
związanych z produkcją leków.
UWAGA! Pewne składniki buforu reakcyjnego oraz buforu służącego do przechowywania mogą działać silnie drażniąco.
Radzimy podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP
9721099648, email [email protected], www.novazym.com
NOVAZYM Products
Protokół reakcji
Proponowany przez nas protokół odwrotnej transkrypcji zawiera przepis przeprowadzania reakcji odwrotnej
Novazym Polska
ul. Żywokostowa
+48Jednakże,
0 61 610 w39zależności
10, faxod
+48
0 61 610
transkrypcji
w warunkach
optymalnych23,
do 61-680
syntezy Poznań,
większościtel.
cDNA.
indywidualnej
charakterystyki
reakcji możliwe jest wprowadzanie odpowiednich modyfikacji i dostosowanie poniższej
39 11, email [email protected]
procedury do indywidualnych potrzeb.
1.
W probówce umieszczonej w lodzie zmieszać następujące składniki reakcji:
PROTOKÓŁ
SKŁADNIKI REAKCJI
LUB
LUB
ILOŚĆ
MATRYCA RNA
totalRNA
Specyficzny RNA
STARTERY
Losowe 6-nukleotydowe (RANDOM PRIMERS)
10-100 pmol/µL
OLIGO(dT)15
10-100 pmol/µL
WODA (DEPC, wolna od RNaz, DNaz)
1 µg
5 – 100 ng
1 µL
*zmienna
*zależy od objętości pozostałych składników reakcji.
2.
Składniki reakcji starannie wymieszać, a następnie zwirować.
3.
Mieszaninę inkubować 10 min w 65 ⁰C, po czym natychmiast umieścić probówkę na lodzie.
Po schłodzeniu zwirować.
4.
Umieścić probówkę w lodzie i dodać następujące składniki reakcji:
PROTOKÓŁ c.d.
SKŁADNIKI REAKCJI
M-MLV Buffer (5x)
DTT [100 mM]
dNTPs MIX [10 mM]
RNase inhibitor
M-MLV odwrotna transkryptaza
ILOŚĆ
4 µL
2 µL
1 µL
20 units
* 0,5 µL
*w przypadku prowadzenia reakcji w temp. powyżej 40 ⁰C zalecamy dodać 1 µL M-MLV
odwrotnej transkryptazy
Końcowa objętość po zmieszaniu wszystkich składników reakcji 20 µL.
5.
Inkubować mieszaninę 60 min w 37 ⁰C – 42 ⁰C.
6.
W celu zakończenia reakcji mieszaninę inkubować 10 min w 70 ⁰C, następnie umieścić probówkę w lodzie.
Zalecenia:

Wykorzystanie poli(A) RNA zamiast całkowitego RNA pozwala istotnie podnieść specyficzność i efektywność
reakcji syntezy cDNA.

Startery oligo d(T) 15 (w przeciwieństwie do starterów losowych) nie wymagają szczególnej optymalizacji warunków
reakcji.

Należy zwrócić uwagę na współzależność pomiędzy stężeniem starterów losowych, a ilością matrycy, od której
zależy długość uzyskiwanego cDNA. Zwiększenie stężenia losowych starterów pro wadzi do syntezy krótkich
(ok. 600 nukleotydowych) cDNA, natomiast zmniejszenie ich stężenia będzie sprzy jać syntezie dłuższych odcinków
cDNA.

Problemy związane z obecnością w RNA struktur drugorzędowych oraz sekwencji bogatych w G i C można
zmniejszyć poprzez podniesienie temperatury reakcji do 45 ⁰C (zamiast 37 ⁰C) lub poprzez dodanie DMSO do
mieszaniny reakcyjnej. Należy jednak pamiętać, że może to prowadzić do zmniejszenia wydajności syntezy cDNA.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP
9721099648, email [email protected], www.novazym.com