Ćwiczenie 2 - budowa i w³. bia³ek

Ćwiczenie 2
BUDOWA, WŁAŚCIWOŚCI I FUNKCJA BIAŁEK
Część doświadczalna obejmuje:
- ilościowe oznaczanie białek metodą biuretową
- wytrącanie kazeiny w punkcie izoelektrycznym
- frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu
- denaturacja białek (termiczna, etanolem o wyŜszym stęŜeniu, niektórymi kationami i anionami)
WPROWADZENIE
Łączenie się aminokwasów wiązaniami amidowymi prowadzi do utworzenia liniowej makrocząsteczki – polipeptydu. Łańcuchy polipeptydowe zawierające ponad 100 reszt aminokwasowych
przyjmuje się określać juŜ jako białka. Wiązanie amidowe, nazywane równieŜ wiązaniem peptydowym, powstaje z grupy α-karboksylowej i grupy α-aminowej. Na ryc. 1A przedstawiono dipeptyd (seryloalaninę) utworzony z seryny i alaniny. Wiązanie peptydowe jest stabilizowane mezomerycznie, gdyŜ wiązanie C-N ma częściowo charakter wiązania podwójnego C=N (Ryc.
1B). To usztywnienie wiązania peptydowego powoduje, Ŝe we wszystkich ułoŜeniach przestrzennych białek grupy amidowe pozostają płaskie. Swobodna rotacja jest moŜliwa tylko wokół wiązania N-Cα i Cα-C, a obroty są opisywane przez wartości kątów torsyjnych ϕ (fi) i ψ (psi) (Ryc.
1A).
Ryc. 1. Właściwości wiązania amidowego (peptydowego) (Koolman, Röhm 2005)
1
Ryc. 2. Struktury drugorzędowe białek (α-helisa, helisa kolagenu, pofałdowanej kartki, β-pętla)
(Koolman, Röhm 2005)
2
Konformacja łańcucha peptydowego utworzona przez kilka kolejnych reszt aminokwasowych
definiuje strukturę drugorzędową stabilizowaną wiązaniami wodorowymi (Ryc. 2).
Białka, ze względu na skład, dzieli się na białka proste i złoŜone. Białka proste zbudowane są
tylko z aminokwasów, natomiast białka złoŜone zawierają szereg róŜnych komponentów nieaminokwasowych, których rodzaj staje się podstawą podziału białek na:
- glikoproteiny - białka zawierające cukry obojętne (galaktoza, mannoza, fukoza), aminocukry
(N-acetyloglukozamina, N-acetylogalaktozamina) lub kwasy pochodne monosacharydów (kwas uronowy, kwas sjalowy)
- lipoproteiny – zawierają fosfolipidy, cholesterol i inne związki lipidowe
- metaloproteiny – zawierają jony metali związane jonowo lub koordynacyjnie
- fosfoproteiny – reszty tyrozyny, treoniny lub seryny są zestryfikowane kwasem fosforowym
- nukleoproteiny – zawierają RNA lub DNA
- chromoproteiny – zawierają grupę prostetyczną, którą stanowią róŜne związki barwne
Na ryc. 3 pokazano potencjalne miejsca modyfikacji łańcucha polipeptydowego. Modyfikacjom ulegają zwykle polarne reszty aminokwasów, stanowiąc waŜne źródło róŜnorodności białek.
Ryc. 3. Potranslacyjne modyfikacje łańcucha polipeptydowego (Koolman, Röhm 2005)
3
Białka ze względu na pełnione funkcje moŜna podzielić na:
- enzymatyczne – najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zróŜnicowanej masie cząsteczkowej
- strukturalne – są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek (kolagen, elastyna, tubulina, aktyna, α-keratyna). Do białek strukturalnych zalicza się takŜe histony pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie
- transportujące – np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO2 Niektóre białka osocza (prealbumina) transportujące hormony, transferyna przenosząca Ŝelazo,
niektóre białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów,
nośniki w transporcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transporcie aktywnym jonów i metabolitów
- regulacyjne – białkami są niektóre hormony (somatotropina, insulina), a takŜe receptory
uczestniczące w percepcji róŜnych cząsteczek sygnałowych. Białkami regulatorowymi są takŜe czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów
- odpornościowe – białka układu immunologicznego (np. immunoglobuliny) chronią organizm
przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami (substancjami obcymi
dla organizmu)
- motoryczne – uczestniczą w procesach związanych z ruchem (aktyna, miozyna); kinezyna
funkcjonuje w przemieszczaniu organelli w komórce
- zapasowe – owoalbumina w białku jaja stanowi źródło aminokwasów dla rozwijającego się zarodka; ferrytyna wiąŜe Ŝelazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym
mleka, niektóre białka budujące mięśnie mogą być wykorzystywane jako materiał energetyczny; takŜe wiele białek roślinnych pełni funkcję zapasową
Ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na: globularne (kuliste) i fibrylarne
(włókienkowate, skleroproteiny).
Do białek fibrylarnych naleŜą: α-keratyny włosów, wełny, piór, paznokci, kolageny zawarte
głównie w tkance łącznej, elastyny, fibroina jedwabiu.
Białka globularne obejmują:
-białka obojętne (albuminy, globuliny)
-kwaśne (prolaminy, gluteiny)
-zasadowe (histony, protaminy)
Na ryc. 4 przedstawiono półschematycznie, w około 1,5-milionowym powiększeniu, struktury
kilku wewnątrz- i pozakomórkowych białek.
4
Ryc. 4. Strukturalne i funkcjonalne zróŜnicowanie białek (półschematyczne struktury w około 1,5
mln powiększeniu; długość kolagenu w tym powiększeniu wynosi około 30 cm) (Koolman, Röhm
2005)
5
Rozpuszczalność białek globularnych
Cząsteczki białka są amfoterami tworzącymi w roztworach wodnych koloidy. Fazę rozproszoną stanowią cząsteczki białka o wymiarach 5-100 nm i masach cząsteczkowych sięgających nawet
miliona Daltonów (Da). Większość białek wykazuje duŜe powinowactwo do wody. Takie koloidy
nazywamy hydrofilowymi.
Białka, podobnie jak aminokwasy, posiadają ładunek, lecz w pH równym punktowi izoelektrycznemu (pI) są elektrycznie obojętne (Rys. 5). RóŜne białka mają róŜne wartości punktu izoelektrycznego. W pH powyŜej i poniŜej pI białka mają ładunek odpowiednio ujemny i dodatni, w
wyniku czego białko zostaje otoczone dipolami wody (hydratacja). Zjawisko to warunkuje rozpuszczalność w wodzie tak duŜych cząsteczek jak białka. Pozbawienie białek ładunku powoduje
dezintegrację otoczki wodnej i utratę rozpuszczalności. Białka róŜniące się wartościami punktu
izoelektrycznego w tym samym pH środowiska będą posiadały róŜny ładunek i róŜne powinowactwo do wody, co umoŜliwia ich frakcjonowanie i rozdział.
Ryc. 5. Udział ładunku elektrycznego w procesach wytrącania białka w roztworze
Z powyŜszego wynika, Ŝe wytrącanie białka zachodzi najłatwiej w punkcie izoelektrycznym. Jeśli proces ten będzie przebiegał w niskiej temperaturze (0-50 C), to uzyskane w osadzie
białko, po rozpuszczeniu zachowa cechy charakterystyczne dla białka natywnego.
Na ryc. 6 pokazana jest zaleŜność rozpuszczalności białka od pH w warunkach zróŜnicowanego stęŜenia NaCl. Rozpuszczalność białka wyraźnie maleje w pH zbliŜonym do pI. Największy
spadek rozpuszczalności obserwuje się w warunkach niskiego stęŜenia soli (1 mM NaCl).
6
Ryc. 6. Wpływ pH i niewielkich stęŜeń NaCl na rozpuszczalność β-laktoglobuliny w 250 C
(Lehninger 1979)
Wpływ stęŜenia soli na rozpuszczalność białek
Rozpuszczalność jest funkcją zarówno stęŜenia soli obojętnej, jak teŜ ilości ładunków wszystkich rodzajów jonów znajdujących się w roztworze. Wartości te określają siłę jonową roztworu: µ
= 1/2Σcizi2 (c – stęŜenie jonów; z – ładunek jonów)
Ryc. 7. Zasalanie (wsalanie) i wytrącanie białek (wysalanie) w warunkach rosnącej siły jonowej
roztworu (Koolman, Röhm 2005)
7
Rozpuszczalność białka w wodzie destylowanej jest bardzo mała, natomiast rośnie wraz ze
wzrostem siły jonowej, gdyŜ rośnie liczba jonów nieorganicznych na powierzchni białka zapobiegających ich agregacji. Zjawisko to nazywa się wsalaniem lub zasalaniem (Ryc. 7). Przy odpowiednio duŜej sile jonowej, sól odciąga cząsteczki wody od powierzchni białek i doprowadza do
ich agregacji (wysalanie białka) (Ryc. 7). Białko(a) wysolone rozpuszcza się ponownie po usunięciu soli lub po rozcieńczeniu roztworu.
Zdolność wysalająca soli zaleŜy zarówno od charakteru kationu, jak i anionu. Ze względu na
siłę wysalającą moŜna uszeregować kationy i aniony w następujący sposób:
Aniony: cytrynian3- > winian2-> siarczan2- > octan- > chlorek- > azotan- > rodanekKationy: Th3+ > Al2+ > Se2+ > Sr2+ > Ca2+ > Mg2+ > NH4+ > Na+ > Li+
Szeregi te noszą nazwę szeregów liotropowych lub szeregów Hofmeistera.
Rozpuszczalność białek jest takŜe funkcją stałej dielektrycznej środowiska, gdyŜ w warunkach nie zmieniającego się pH i siły jonowej maleje po dodaniu rozpuszczalników o niskiej
stałej dielektrycznej takich jak: etanol, aceton, glikol etylenowy. Białka w takich warunkach
agregują, gdyŜ dodany rozpuszczalnik zmniejsza stopień uwodnienia grup jonowych przez
zmniejszenie ilości dipoli wodnych na powierzchni cząsteczki białka. ObniŜenie stałej dielektrycznej roztworu przez dodanie rozpuszczalnika powoduje wzrost siły przyciągania pomiędzy
przeciwnie naładowanymi grupami.
Rozpuszczalność większości białek zwiększa się w ograniczonym zakresie (0 – 400 C) wraz ze
wzrostem temperatury. W temperaturze powyŜej 40-500 C większość białek zaczyna tracić trwałość i ulega denaturacji. Białka mogą takŜe denaturować w szczególnie drastycznych warunkach tj.
skrajne pH, wysoka temperatura, promieniowanie jonizujące. Denaturacja pociąga trwałą utratę
funkcji biologicznych i wiąŜe się ze zmianami w strukturze drugo-, trzecio- i czwartorzędowej białka.
8
WYKONANIE
Kolorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową
Zasada metody:
Metoda polega na oznaczaniu natęŜenia barwy powstałej w wyniku wytworzenia związków
kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym, z maksimum absorbancji
przy λ = 540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązań
peptydowych. ZaleŜność ta jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania białek. Czułość metody - 0,1 mg/ml.
Nazwa reakcji pochodzi od biuretu - związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe
Metoda biuretowa nie nadaje się do oznaczania białek w obecności soli amonowych, gdyŜ jon
amonu daje równieŜ barwne kompleksy z jonami miedzi (II). W reakcji przeszkadza takŜe siarczan
(VI) magnezu, poniewaŜ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu
maskuje właściwy odczyn.
9
Odczynniki:
- standardowy roztwór albuminy - 10 mg/ml w 0,9% NaCl
- odczynnik biuretowy: 1,5 g 5hydratu CuSO4 i 6,0 g winianu sodu i potasu rozpuścić w 500 ml
wody dest. w kolbie miarowej na 1000 ml. Następnie małymi porcjami stale mieszając dodać 300
ml 10% NaOH i uzupełnić objętość wodą dest. do 1 l. Dodać 2g KJ. Odczynnik jest stabilny.
Wykonanie krzywej standardowej i oznaczenie stęŜenia białek w surowicy krwi
Do suchych probówek odmierz pipetą kolejno podane w tabeli objętości standardowego roztworu albuminy, wody i odczynnika biuretowego. KaŜdą próbę wykonaj w dwóch powtórzeniach.
Nr próby
1
2
3
4
5
6
StęŜenie albuminy (mg/próbę)
1
2
3
4
5
0
Roztwór standardowy (ml)
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0
Woda destylowana (ml)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,5
Odczynnik biuretowy (ml)
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
A1
A540nm
A2
Aśr
K = mg albuminy w próbie
A540 nm
Równocześnie oznacz zawartość białka w 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi (do oznaczeń
pobierz 0,5 i 0,1 ml; w tym drugim przypadku próbę uzupełnij wodą do 0,5 ml). Po upływie 30
min zmierz absorbancję prób przy długości fali λ = 540 nm w 1 cm kuwetach. Pomiaru dokonaj
względem próby zerowej nie zawierającej białka (próba 6). Zapisz wyniki w tabeli. Oblicz współczynnik kierunkowy K. Narysuj krzywą wzorcową (zaleŜność wartości absorbancji od stęŜenia
białka w próbie). Przy obliczaniu ilości białka w próbie stosuj obliczony współczynnik K. Z oznaczonej w próbie zawartości białka oblicz stęŜenie białka w surowicy.
10
Wytrącanie i denaturacja białek
Wytrącanie białek
Wytrącanie białek w punkcie izoelektrycznym
Do 1 ml 0,1% roztworu kazeiny, rozpuszczonej w 50 mM roztworze octanu sodu, dodawać
bardzo powoli pipetą Pasteura, cały czas delikatnie wytrząsając, około 1,5 ml 0,5 M roztworu
kwasu octowego. Obserwować pojawianie się zmętnienia pochodzącego od wytrącającego się
białka, które powinno rosnąć z upływem czasu. Po 5 min dodać porcjami jeszcze około 1,5 ml
0,5 M roztworu kwasu octowego i obserwować czy wytrącona w pI kazeina rozpuszcza się po obniŜeniu pH roztworu (wartość pI kazeiny wynosi 4,7)
Frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu
Do wysalania białek stosujemy najczęściej związki o wysokim powinowactwie do wody tj.
siarczan (VI) amonu lub siarczan (VI) sodu.
Ćwiczenie wykonujemy w probówkach wirówkowych. Do 2 ml surowicy (10-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl) dodać 2 ml nasyconego roztworu (NH4)2 SO4. Po zmieszaniu
roztworów uzyskuje się półnasycenie (50% nasycenie) siarczanu (VI) amonu. Agregujące globuliny odwirować w wirówce stołowej, a następnie zlać klarowny supernatant do suchej probówki
wirówkowej. Do osadu globulin dodać niewielką ilość wody destylowanej do całkowitego rozpuszczenia białek. Do przelanego supernatantu dodawać, cały czas wytrząsając, kryształki
(NH4)2SO4, tak by uzyskać roztwór nasycony (kryształki siarczanu amonu przestają się rozpuszczać). Wzrost siły jonowej roztworu powoduje wytrącanie się frakcji albumin.
Wytrącanie białek surowicy krwi etanolem
Do 0,5 ml surowicy 10x rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl i oziębionej w lodzie dodać 1 ml
96% etanolu. Powstaje zmętnienie, które znika po natychmiastowym rozcieńczeniu 0,9% NaCl lub
wodą.
Denaturacja białek
Termin ten dotyczy wszystkich zmian w strukturze cząsteczki białka, w wyniku których białko
traci swoje biologiczne właściwości. Denaturacja następuje wówczas, gdy pod wpływem czynników fizycznych lub chemicznych ulega zniszczeniu struktura IV-, III- lub II-rzędowa.
11
Denaturacja cieplna białek
2 ml 1% roztworu albuminy lub 1% roztworu białka jaja kurzego ogrzać do zagotowania. Tworzy się biały osad wytrąconego białka.
Denaturacja białek etanolem
Rozpuszczalniki organiczne (etanol, aceton, eter) i detergenty działają na strukturę przestrzenną cząsteczki białka, osłabiając wiązanie hydrofobowe, reagują bezpośrednio z naładowanymi
grupami na powierzchni cząsteczki i dezorganizują płaszcz wodny cząsteczki. Działanie denaturujące etanolu objawia się dopiero przy większych jego stęŜeniach, po dłuŜszym czasie działania i w wyŜszej temperaturze (200- 300 C).
Do probówki dodać 1 ml 1% albuminy i 1 ml 96% etanolu. Po godzinie rozcieńczyć zawartość
probówki wodą. Osad nie rozpuszcza się. Porównaj z ćwiczeniem, w którym białka były wytrącane etanolem.
Strącanie białek za pomocą kationów
Białka w pH wyŜszym od pI posiadają ładunek ujemny i mogą reagować z kationami. Kationy
metali alkalicznych dają sole dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, natomiast kationy metali cięŜkich (Fe2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+, Ag+) tworzą sole nierozpuszczalne.
Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać parę kropel 1% roztworu FeCl3. Wytrąca się osad
białczanu Ŝelaza (III). Wykonać analogiczną próbę z HgCl2, Pb(CH3COO)2 oraz AgNO3.
Strącanie białek kwasem sulfosalicylowym i trójchlorooctowym
COOH
Cl
OH
Cl
HO3S
C
COOH
Cl
Kwas sulfosalicylowy
Kwas trójchlorooctowy
Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać 0,5 ml 10% roztworu kwasu trójchlorooctowego.
Końcowe stęŜenie kwasu niezbędne do odbiałczania nie powinno być niŜsze niŜ 5%.
Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać kilka kropel 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego.
12
Zagadnienia do przygotowania:
- budowa i właściwości wiązania amidowego (peptydowego)
- struktury drugorzędowe białek (wiązania stabilizujące strukturę)
-wiązania stabilizujące III- i IV- rzędową strukturę białek
- białka proste i złoŜone; przykłady potranslacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych
aminokwasów
-podział białek ze względu na funkcję (przykłady)
- kolorymetria (zasada ilościowego oznaczania białek metodą biuretową)
-właściwości białek w roztworze (zaleŜność rozpuszczalności białek od pH, siły jonowej, stałej
dielektrycznej rozpuszczalnika, temperatury)
-zasada wytrącania białek w pI, wytrącania przez wysalanie lub obniŜenie stałej dielektrycznej
roztworu
- denaturacją białek (termiczna, wyŜsze stęŜenie etanolu, kationy metali cięŜkich, niektóre kwasy
organiczne)
Piśmiennictwo:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Biochemia – AL. Lehninger PWR i L, Warszawa, 1979
Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
13