TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3

PRACE ORYGINALNE
Magdalena BODNAR1
£ukasz SZYLBERG1
Wojciech KAMIERCZAK2
Andrzej MARSZA£EK1,3
Ocena ekspresji tkankowych inhibitorów
metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) jako
czynników prognostycznych w raku
p³askonab³onkowym krtani
Evaluation of expression of tissue inhibitors of
etalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) as a
prognostic markers in laryngeal squamous cell
carcinoma
Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej,
Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ,
Collegium Medicum, Bydgoszcz
Kierownik:
Dr hab. Andrzej Marsza³ek prof. UMK
1
Katedra i Klinika Otolaryngologii,
Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ,
Collegium Medicum, Bydgoszcz
Kierownik: Prof. dr hab. Henryk KaŸmierczak
2
Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej,
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ
Kierownik: Prof. dr hab. Przemys³aw Majewski
3
Dodatkowe s³owa kluczowe:
rak p³askonab³onkowy krtani
tkankowe inhibitory metaloproteinaz
immunohistochemia
Additional key words:
laryngeal squamous cell carcinoma
tissue inhibitors of matrix metalloproteinases
immunohistochemistry
Adres do korespondencji:
Dr hab. Andrzej Marsza³ek, prof. UMK
Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej
Uniwersytet Miko³aja Kopernika w Toruniu
Collegium Medicum im. L. Rydygiera
w Bydgoszczy
ul. M. Sk³odowskiej-Cuire 9
85-094 Bydgoszcz
Tel.: 52 585 42 00; Faks: 52 585 40 49
e-mail: [email protected]
678
Raki krtani wci¹¿ stanowi¹ powa¿ny problem terapeutyczny, wynikaj¹cy
g³ównie z póŸnego rozpoznania nowotworu. Utrzymanie równowagi miêdzy aktywnoœci¹ enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów odgrywa
istotn¹ rolê w utrzymaniu prawid³owej
struktury tkanek oraz zapobiega degradacji sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej. Nadmierna ekspresja enzymów proteolitycznych oraz brak aktywnoœci odpowiednich inhibitorów prowadzi do destabilizacji wspomnianej
powy¿ej równowagi, co w konsekwencji u³atwia migracjê komórek nowotworowych. Celem niniejszej pracy
by³a ocena lokalizacji i poziomu ekspresji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) w
raku p³askonab³onkowym krtani. Badania immunohistochemiczne przeprowadzono na 78 reprezentatywnych
wycinkach tkankowych obejmuj¹cych
60 wycinków z rakiem p³askonab³onkowym krtani oraz 18 wycinków prawid³owej b³ony œluzowej. Stwierdzono ekspresjê oznaczanych czynników
zarówno w komórkach nowotworowych, jak i podœcielisku nowotworu.
Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych bia³ek, odpowiednio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22% (17/
78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przypadków raka p³askonab³onkowego
krtani. Stwierdzono ró¿nicê istotn¹ statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP1, TIMP-2 oraz TIMP-3 pomiêdzy ekspresj¹ tych parametrów w komórkach
nowotworu a podœcieliskiem (p<0,05).
Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ów
ch³onnych (N0 vs. N+) wykazano ró¿nice istotne statystycznie w poziomach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrêbie. Natomiast dla poziomów ekspresji TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 w nowotworze nie stwierdzono ró¿nic istotnych
statystycznie pomiêdzy pacjentami N0
vs. N+. Ocena wzajemnych interakcji
pomiêdzy wyszczególnionymi paramePrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
Laryngeal cancer is still a therapeutic problem mainly become of late diagnosis. Balance between the activity
of proteolytic enzymes and their inhibitors plays an important role in maintaining normal tissues structure and
prevents the degradation of extracellular matrix components. Proteolytic
enzymes overexpression and/or lack
of activity of their inhibitors lead to
destabilization of tissue structure,
which in turn facilitates the migration
of cancer cells. The aim of this study
was to assess the localization and
level of expression of tissue inhibitors
of metalloproteinases (TIMP-1, TIMP2, TIMP-3) in lanyngeal squamous cell
carcinoma. The immunohistochemical
study was performed on 78 representative tissue samples including: 60 sections of squamous cell carcinoma of
the larynx and 18 sections of normal
mucosa. Expression of determined
parameters was found in both tumor
cells and tumor stroma. We have found
cytoplasmic expression of studied proteins, respectively in 91% (71/78) for
TIMP-1, 22% (17/78) for TIMP-2, 100%
(78/78) for TIMP-3 cases of squamous
cell carcinoma of the larynx. Statistically significant difference between the
expression of TIMP-1, TIMP-2 and
TIMP-3 was found between tumor cells
and tumor stroma (p<0.05). Analyzing
the lymph node involvement (N0 vs. N
+) we found statistically significant difference (p<0.05) in the levels of expression of TIMP-1 and TIMP-3 between
those groups in the primary tumor
stroma. However, for expression levels of TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 in the
tumor cells there was no statistically
significant differences between patients N0 vs. N +. Assessment of interactions between parameters involved
in the process of tumor invasion may
contribute to the development of therapies based on the inhibition of invasion. Understanding the mechanisms
M. Bodnar i wsp.
trami, w procesie inwazji nowotworowej, mo¿e przyczyniæ
siê do rozwoju terapii opartej na dzia³aniu przeciwinwazyjnym, a poznanie mechanizmów interakcji dzia³ania okreœlonych metaloproteinaz oraz ich inhibitorów mo¿e mieæ
istotny wp³yw na strategie terapeutyczne.
Wstêp
Rak krtani wci¹¿ pozostaje istotnym problemem diagnostycznym jak i terapeutycznym. W obszarze krtani, najczêœciej wystêpuj¹cym nowotworem jest rak p³askonab³onkowy, stanowi¹cy ok. 90% rozpoznawanych
nowotworów z³oœliwych w tej lokalizacji. Etiologia tego nowotworu œciœle zwi¹zana jest z
ekspozycj¹ na czynniki œrodowiskowe,
wœród których podkreœla siê palenie tytoniu
oraz nadu¿ywanie wysokoprocentowych
alkoholi [2,32]. W Polsce w 2008 roku odnotowano 2075 nowych zachorowañ na
raka krtani oraz 1423 zgony spowodowane
tym typem nowotworu u mê¿czyzn. U kobiet dane te w 2008 roku przedstawia³y siê
nastêpuj¹co: 308 nowych zachorowañ i 182
zgony spowodowane rakiem krtani [Krajowy Rejestr Nowotworów].
Przerzuty powstaj¹ce w wyniku procesu transformacji nowotworowej stanowi¹
jedn¹ z g³ównych przyczyn zgonów. W procesie tworzenia przerzutów istotn¹ rolê odgrywa zdolnoœæ komórek do migracji, która
uwarunkowana jest degradacj¹ sk³adników
macierzy zewn¹trzkomórkowej determinowana obecnoœci¹ ró¿nych enzymów nale¿¹cych do rodziny endopeptydaz (tzw. metaloproteinaz, MMP). W szczególnoœci podkreœla siê rolê MMP-2 oraz MMP-9. Udowodniono lokalizacjê tych enzymów nie tylko na powierzchni komórek nowotworowych, ale tak¿e zdolnoœæ ich wydzielania
przez komórki podœcieliska nowotworu
[13,19].
W licznych badaniach wskazano na interakcje zachodz¹ce pomiêdzy komórkami
nowotworowymi a otaczaj¹cym je mikroœrodowiskiem, tzw. tumor host-reactions (interakcja guz-gospodarz), podkreœlaj¹c, ¿e nie
tylko sam nowotwór powoduje przekszta³cenie mikroœrodowiska, ale tak¿e reaguje na
czynniki pochodz¹ce z podœcieliska [13].
Mikroœrodowisko bierze udzia³ w promocji
mutagenezy komórek nowotworowych oraz
wp³ywa na modyfikacje komórek wchodz¹cych w sk³ad podœcieliska guza [10,31].
Podkreœlaj¹c udzia³ komórek mikroœrodowiska guza, zaproponowano model „mikroœrodowiskowej” inwazji nowotworu (tumor microenviroment invasion model), wed³ug której na ka¿dym etapie tworzenia przerzutów
nastêpuje aktywacja okreœlonych genów
wspomagaj¹cych ten proces [11,12,31].
Aktywacja MMP mo¿e odbywaæ siê na
dwóch poziomach: zewn¹trz i wewn¹trzkomórkowo. Wiêkszoœæ enzymów proteolitycznych aktywowana jest zewn¹trzkomórkowo. Metaloproteinazy wytwarzane i wydzielane s¹ w postaci nieaktywnych proenzymów, a aktywacja MMP zachodzi poprzez
usuniêcie prodomeny, co prowadzi do ods³oniêcia aktywnego miejsca enzymu. Zmiany te zachodz¹ pod wp³ywem specyficznych
aktywatorów oraz inhibitorów dzia³aj¹cych
na poziomie: ekspresji genów, aktywacji
pro-MMP, a tak¿e poprzez udzia³ specyficznych i niespecyficznych inhibitorów zaktyPrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
of interaction between several metalloproteinases and
their inhibitors may have a significant impact on therapeutic strategies in the future.
wowanych metaloproteinaz [7,28].
W warunkach fizjologicznych aktywnoϾ
i iloϾ MMPs regulowana jest poprzez endogenne inhibitory metaloproteinaz, czyli
tzw. tkankowe inhibitory metaloproteinaz
(ang. tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, TIMPs). Dotychczas znane s¹
cztery typy inhibitorów tkankowych, odpowiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4.
£¹cz¹ siê one z fragmentem C-koñcowym
cz¹steczki MMP wi¹zaniami niekowalencyjnymi. Powinowactwo poszczególnych inhibitorów do odpowiednich enzymów jest
zró¿nicowane. Udowodniono, ¿e TIMP-1
wykazuje zwiêkszone powinowactwo do
MMP-9, w porównaniu z powinowactwem
do MMP-2. Natomiast TIMP-2 wykazuje
znacznie wiêksze zdolnoœci zahamowania
aktywnoœci MMP-2, w porównaniu do efektu w przypadku pozosta³ych enzymów wchodz¹cych w sk³ad tej rodziny [16]. Udowodniono, ¿e TIMPs pe³ni¹ tak¿e funkcje ligandów dla receptorów czynników wzrostu oraz
cytokin. Wywieraj¹ tak¿e wp³yw na regulacjê aktywnoœci komórek nowotworowych,
niezale¿nie od aktywnoœci MMPs [4]. Ponadto tkankowe inhibitory metaloproteinaz
zaanga¿owane s¹ w degradacjê macierzy
zewn¹trzkomórkowej poprzez zdolnoœæ do
eliminacji MMPs, jak równie¿ zdolnoœæ do
hamowania aktywacji tych enzymów. Tworz¹ wi¹zania zarówno z formami aktywnymi
jak i latentnymi MMPs, powoduj¹c zablokowanie mo¿liwoœci od³¹czenia koñca
N okreœlonych metaloproteinaz, co uniemo¿liwia ich aktywacjê [4,16]. G³ówn¹ funkcj¹ TIMPs, oprócz zdolnoœci do hamowania aktywnoœci MMPs, jest zdolnoœæ do stymulowania rozwoju nowotworów. Stwierdzono, ¿e TIMPs bior¹ udzia³ zarówno w procesach degradacji jak i syntezy macierzy pozakomórkowej reguluj¹c oba te procesy. W
wyniku nadmiernego wydzielania MMPs,
m.in. przez komórki nowotworowe, dochodzi do zwiêkszonego wydzielania TIMP.
Ponadto w przebiegu procesu nowotworowego, wzrost syntezy MMPs, zarówno w komórkach guza, jak i podœcielisku nowotworu, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹ inhibitorów metaloproteinaz. Nadmierna syn-
teza MMPs, w porównaniu do syntezy inhibitorów tkankowych, powoduje nasilenie
procesów degradacyjnych, co z kolei mo¿e
powodowaæ zwiêkszon¹ migracjê komórek
guza [7,13,15].
Celem niniejszej pracy by³a ocena lokalizacji i poziomu ekspresji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2,
TIMP-3) jako czynników zwi¹zanych z aktywacj¹ enzymów proteolitycznych nale¿¹cych do ¿elatynaz. Ponadto podjêto próbê
opisania przebudowy podœcieliska nowotworu w trakcie jego powstawania i rozwoju, na
przyk³adzie raka p³askonab³onkowego krtani
poprzez ocenê lokalizacji i poziomu ekspresji
tych parametrów w obszarze prawid³owej
b³ony œluzowej i raku p³askonab³onkowym
krtani.
Materia³ i metody
Grupa badana:
Badania wykonano na materiale pochodz¹cym od
31 mê¿czyzn oraz 6 kobiet, którym wykonano laryngektomiê w Katedrze i Klinice Otolaryngologii i Onkologii
Laryngologicznej CM UMK, Szpitala Klinicznego nr 1 im.
dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. Wiek pacjentów waha³ siê
od 44 do 77 lat, tj. u mê¿czyzn od 44 do 77 lat (œrednia
wieku: 57 lat), a u kobiet od 50 do 69 lat (œrednia wieku:
60 lat). Na badania otrzymano zgodê lokalnej Komisji
Bioetycznej.
W zgromadzonym materiale rozpoznano raka p³askonab³onkowego krtani, co zosta³o zweryfikowane poprzez dwukrotn¹ ocenê materia³u tkankowego przeprowadzon¹ przez dwóch lekarzy patologów. Ustalono stopnieñ z³oœliwoœci histologicznej. Stopieñ G3 zdiagnozowano u 2 pacjentów, G2 u 32, a G1 u 3 pacjentów.
Dokonano oceny klinicznego stopnia zaawansowania procesu nowotworowego zgodnie z klasyfikacj¹ TNM
(wg IUAC). Dwóch pacjentów zakwalifikowano do stadium T2, 24 pacjentów do T3, a 11 pacjentów do T4. U
dwudziestu pacjentów nie stwierdzono przerzutów do
wêz³ów ch³onnych. Przerzuty do okolicznych wêz³ów
ch³onnych zdiagnozowano u 17 chorych (jedenastu chorych z N1, trzech w N2, trzech w N3). W analizowanej
grupie nie stwierdzono przerzutów odleg³ych.
Wszyscy pacjenci z grupy badanej palili papierosy.
Dwudziestu oœmiu pali³o do 20 papierosów dziennie, a
dziewiêciu ponad 20 papierosów dziennie. Ponadto 29
chorych nadu¿ywa³o alkoholi wysokoprocentowych.
Materia³ tkankowy podzielono na nastêpuj¹ce grupy badawcze: 1. grupê badan¹ stanowi³y wycinki tkankowe z rakiem p³askonab³onkowym: 60 wycinków tkankowych. 2. grupê kontroln¹ stanowi³ obszar prawid³owej
b³ony œluzowej: 18 wycinków tkankowych.
Tabela I
Skala oceny reakcji immunohistochemicznej wg Remmele-Stegner w modyfikacji w³asnej.
The immunohistochemical reaction scale of Remmel-Stegner with own modification.
IntensywnoϾ ekspresji
Komórki/obszar o pozytywnej ekspresji
[SI]
[PP]
0 – brak ekspresji
0 = brak komórek
Skala IRS
1 – s³aba ekspresja
1 = < 5% komórek
[SI] x [PP]
2 – umiarkowana ekspresja
2 = 6 - 20% komórek
3 – silna ekspresja
3 = 21 - 50% komórek
4 = 51 - 80% komórek
5 = > 81% komórek
679
Badanie immunohistochemiczne
Przeprowadzono badania immunohistochemiczne
postêpuj¹c wg standardowej procedury opisanej we
wczeœniejszych publikacjach [1].
Wykorzystano pierwszorzêdowe przeciwcia³a skierowane przeciwko TIMP-1; Dako, Denmark, klon VT7,
1:50; TIMP-2, Abcam, klon 3A4, 1:50; TIMP-3, Abcam,
klon Loop1, 1:500. Ocenê poziomu ekspresji wykonano
stosuj¹c zasady oceny morfometrycznej. Do oceny poziomu ekspresji oznaczanych czynników zastosowano
zmodyfikowan¹ skalê (0-15) wg Remmele-Stegner [21]
(tabela I).
Zbadano zgodnoœæ poszczególnych zmiennych z
rozk³adem normalnym wykorzystuj¹c test Ko³mogorowaSmirnowa z poprawk¹ istotnoœci Lillieforsa oraz testem
Shapiro-Wilka. JednorodnoϾ wariancji oceniono za
pomoc¹ testu Levene'a.
Rozk³ad uzyskanych wyników odbiega³ od rozk³adu normalnego, dlatego analizê statystyczn¹ przeprowadzono za pomoc¹ testów nieparametrycznych. Do
oceny ró¿nic istotnych statystycznie, miêdzy dwoma grupami (uwzglêdniaj¹c lokalizacjê tj. w komórkach prawid³owego nab³onka versus komórkach nowotworu oraz
podœcielisku [zrêbie] w prawid³owej b³onie œluzowej oraz
w utkaniu nowotworu), wykorzystano test nieparametryczny U Manna-Whitneya. Ocenê ekspresji oznaczanych parametrów wzglêdem lokalizacji i obecnoœci lub
nie, przerzutów do wêz³ów ch³onnych (cecha N) wykonano za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa. W celu porównañ statystycznych analizowanych zmiennych w niniejszej pracy wykorzystano modu³ budowy i analizy drzew
klasyfikacyjnych, z zastosowaniem testu zgodnoœci Chi
kwadrat. Za ró¿nicê istotn¹ statystycznie przyjêto wartoœci p<0,05.
Wyniki
Stwierdzono spadek przeciêtnych wartoœci ekspresji dla TIMP-1 oraz TIMP-2 zarówno w zrêbie jak i nowotworze u pacjentów pal¹cych powy¿ej 20 papierosów dziennie w porównaniu z grupa osób pal¹cych
do 20 papierosów dziennie. Natomiast przeciêtne wartoœci ekspresji TIMP-3 w obu grupach znajdowa³y siê na zbli¿onym poziomie.
Najwy¿sze wartoœci ekspresji stwierdzono
dla TIMP-3, natomiast najni¿sz¹ ekspresjê
odnotowano dla TIMP-2 w obu analizowanych grupach. Jednak¿e ze wzglêdu na zbyt
du¿¹ ró¿nicê w liczebnoœci poszczególnych
grup (uwzglêdniaj¹c liczbê wypalanych
dziennie papierosów) nie przeprowadzono
analizy statystycznej. W niniejszej pracy
zwróciliœmy uwagê na ocenê ekspresji oznaczanych parametrów podczas procesu biologicznego, zw³aszcza interakcji pomiêdzy
nowotworem a podœcieliskiem w raku krtani - nowotworze, którego patogeneza œciœle zwi¹zana jest z ekspozycj¹ na dym tytoniowy.
Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych parametrów (TIMP-1,
TIMP-2, TIMP-3) w prawid³owym nab³onku
oraz otaczaj¹cym je utkaniu ³¹cznotkankowym (ekspresja obecna w komórkach nacieku zapalnego). Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych bia³ek, odpowiednio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22%
(17/78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przypadków raka p³askonab³onkowego krtani.
Zaobserwowano wy¿sz¹ ekspresjê oznaczanych inhibitorów tkankowych w utkaniu
nowotworu, w porównaniu z podœcieliskiem.
Najwy¿sz¹ ekspresjê zarówno w nowotworze jak i zrêbie stwierdzono dla TIMP-3 (odpowiednio: 8 i 6). Natomiast najni¿sz¹ ekspresjê stwierdzono w badaniu TIMP-2, w
komórkach nowotworu 0,5 i 0 w zrêbie nowotworu (tabela II).
680
Tabela II
Porównanie poziomów ekspresji badanych antygenów pomiêdzy grup¹ kontroln¹ a badan¹ w nab³onku,
nowotworze i zrêbie.
Comparison of the expression levels of studied antigens between the control group and epithelium, tumor cells and
tumor stroma.
Grupa kontrolna
Oznaczany param etr
TIM P-1
TIM P-2
TIM P-3
Grupa badana
Lokalizacja
M ediana
Lokalizacja
M ediana
IstotnoϾ
staty sty czna P
nab³onek
10
now otw ór
4
0,000 *
zr¹b
4
zr¹b
4
0,795
nab³onek
5
now otw ór
0,5
0,000 *
zr¹b
0
zr¹b
0
0,000 *
nab³onek
12
now otw ór
8
0,000 *
zr¹b
9
zr¹b
6
0,000 *
* ró¿nica istotna statystycznie
Tabela III
Wyniki analiz statystycznych ekspresji oznaczanych parametrów z uwzglêdnieniem obecnoœci lub braku
przerzutów do wêz³ów ch³onnych za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa.
The results of statistical analysis of expression of determined parameters including lymph node involvement using
Kruskal-Wallis test.
NOWOTWÓR
ZR ¥ B
N0
N1
N2
N3
IstotnoϾ
staty sty czna:
N0 v s. N+3
N0
N1
N2
N3
IstotnoϾ
staty sty czna:
N0 v s. N+3
6
4
6
1
ns
6
4
1,5
1
p<0,05
TIM P-2
1
0,5
0
1
ns
0
0
0
1
ns
TIM P-3
8
8
7
10
ns
8
8
7
10
p<0,05
TIM P-1
Rycina 1
Ekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnych
w nowotworze.
Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in the
tumor cells.
Porównuj¹c poziom ekspresji oznaczanych antygenów w komórkach nab³onka grupy kontrolnej i badanej, w analizie statystycznej stwierdzono istotne statystycznie ró¿nice dla oznaczanych parametrów: TIMP-1,
TIMP-2, TIMP-3. Oceniaj¹c poziom ekspresji badanych antygenów w zrêbie stwierdzono ró¿nice istotne statystycznie pomiêdzy
ekspresj¹ TIMP-2 i TIMP-3 pomiêdzy grup¹
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
kontroln¹ a grup¹ badan¹. Nie stwierdzono
ró¿nic istotnych statystycznie w przypadku
porównania poziomów ekspresji TIMP-1 w
zrêbie oraz kontroli grupy badanej. Ponadto wykorzystuj¹c test nieparametryczny U
Manna-Whitneya stwierdzono ró¿nicê istotn¹ statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP1, TIMP-2 oraz TIMP-3 w komórkach nowotworu a podœcieliskiem (p<0,05).
M. Bodnar i wsp.
Rycina 2
Ekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnych
w zrêbie.
Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in tumor
stroma.
Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ów
ch³onnych, pacjentów podzielono na nastêpuj¹ce grupy: bez przerzutów do wêz³ów
ch³onnych (N0), z przerzutami do wêz³ów
ch³onnych (odpowiednio: N1, N2, N3) i przeprowadzono analizê ró¿nic ekspresji badanych parametrów. Wykazano ró¿nice istotne statystycznie (test Kruskala-Wallisa) w
poziomach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrêbie zmiany pierwotnej porównuj¹c materia³
od pacjentów z przerzutami lub bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych. Natomiast dla
poziomów ekspresji TIMP-1, TIMP-2 TIMP3 w nowotworze nie stwierdzono ró¿nic istotnych statystycznie pomiêdzy pacjentami z
N+ (³¹cznie N1-N3) lub bez przerzutów do
wêz³ów ch³onnych
W wyniku analizy ekspresji oznaczanych parametrów uwzglêdniaj¹cej stopieñ
zajêcia wêz³ów ch³onnych zaobserwowano
w obrêbie pierwotnego nowotworu spadek
ekspresji TIMP-1 oraz TIMP-2 wraz ze wzrostem stopnia zajêcia wêz³ów ch³onnych.
Wartoœci TIMP-1 w nowotworze dla poszczególnych grup wynosi³y odpowiednio
N0 - 6, N1 - 4 i N3 - 1. Dla TIMP-2 w nowotworze wynosi³y: N0 - 1,0, N1 - 0,5 oraz N2
- 0. Natomiast w przypadku ekspresji TIMP3 stwierdzono wzrost wartoœci ekspresji
oznaczanego parametru, porównuj¹c pacjentów bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych N0 - 8 i pacjentów w stopniu N3 - 10
(rycina 1).
Ponadto w zrêbie nowotworu zaobserwowano spadek ekspresji TIMP-1 u pacjentów, u których stwierdzono przerzuty do
wêz³ów ch³onnych (N1 - 4, N2 - 1,5, N3 - 1)
w porównaniu z ekspresj¹ oznaczanego
enzymu w stadium N0 - 6. Podobn¹ tendencjê stwierdzono analizuj¹c poziom ekspresji TIMP-3. U pacjentów, u których nie
stwierdzono przerzutów do wêz³ów ch³onnych, przeciêtne wartoœci ekspresji TIMP-3
by³y wy¿sze (N0 - 6) w porównaniu z eksPrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
presj¹ tego antygenu u pacjentów z przerzutami do wêz³ów ch³onnych (N2 - 4, N3 - 4)
(rycina 2).
Dyskusja
Transformacja nowotworowa jest procesem z³o¿onym i wieloetapowym.
Z biologicznego punktu widzenia „naturalna historia nowotworu” rozpoczyna siê
pojawieniem pierwotnego ogniska guza.
Nastêpnie obserwujemy miejscowy wzrost
guza. Natomiast kluczowym etapem w procesie dalszego rozwoju jest uwolnienie komórek nowotworowych z pierwotnego utkania guza. Rozwój tego stadium uzale¿niony
jest od nabycia przez komórki nowotworowe tzw. „fenotypu inwazyjnego”. Zjawisko to
w konsekwencji determinuje zdolnoœæ komórek nowotworowych do naciekania otaczaj¹cych tkanek i ostatecznie daje mo¿liwoœæ tworzenia przerzutów. Inwazja komórek nowotworowych do podœcieliska staje
siê mo¿liwa dziêki zdolnoœci do degradacji
b³on podstawnych, które stanowi¹ podstawow¹ barierê chroni¹c¹ przed ekspansj¹ komórek guza. Powstawanie przerzutów odleg³ych w ró¿nych narz¹dach jest wynikiem
zró¿nicowanych interakcji pomiêdzy komórkami nowotworowymi a nowym mikroœrodowiskiem [9].
Proces inwazji nowotworowej zwi¹zany
jest g³ównie z degradacj¹ macierzy zewn¹trzkomórkowej (ECM) otaczaj¹cej nowotwór
[13]. Doniesienia licznych autorów wskazuj¹ na ekspresjê MMPs w ró¿nych typach
nowotworów z³oœliwych, w tym tak¿e w rakach p³askonab³onkowych obszaru g³owy i
szyi [5]. W niniejszej pracy dokonano szczegó³owej oceny ekspresji poszczególnych
parametrów zarówno w komórkach raka p³askonab³onkowego krtani, jak i w podœcielisku nowotworu. Zrozumienie oraz poznanie
wielostronnych interakcji zachodz¹cych pomiêdzy utkaniem guza a jego podœcieliskiem
oraz wskazanie dominuj¹cych zale¿noœci
pomiêdzy guzem a podœcieliskiem umo¿liwi³oby lepsze poznanie biologii nowotworu.
Do jednych z g³ównych enzymów proteolitycznych zaanga¿owanych w proces degradacji podœcieliska nowotworu, a przede
wszystkim proteolizy sk³adników b³on podstawnych (kolagenu typu IV), nale¿¹ metaloproteinazy zaliczane do grupy ¿elatynaz:
¿elatynaza-A (MMP-2) oraz ¿elatynaza-B
(MMP-9) [15]. Wydzielane s¹ w postaci nieaktywnych form, tzw. zymogenów, a ich aktywacja regulowana jest na kilku poziomach,
tj. zarówno na poziomie transkrypcji, jak i
na poziomie posttranslacyjnym. Na poziomie posttranslacyjnym aktywnoœæ wyszczególnionych enzymów proteolitycznych kontrolowana jest w macierzy zewn¹trzkomórkowej, poprzez koordynowanie aktywacji i
wydzielania proenzymów oraz interakcji aktywnych form enzymów proteolitycznych z
ich inhibitorami [8,15]. Do najwa¿niejszych
nale¿¹ TIMP-1 oraz TIMP-2. £¹cz¹ siê one
w stosunku stechiometrycznym (1:1). Ponadto ¿elatynazy (zarówno MMP-2, jak i
MMP-9) s¹ jedynymi enzymami proteolitycznymi wœród wszystkich MMPs, które wykazuj¹ zdolnoœæ do interakcji z odpowiednimi
dla nich inhibitorami zarówno w formie aktywnej, jak i w postaci zymogenów [5,15].
W warunkach fizjologicznych aktywnoϾ
i iloϾ MMPs regulowana jest poprzez endogenne inhibitory metaloproteinaz (TIMP).
Dotychczas znane s¹ cztery TIMP, odpowiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4.
Tkankowe inhibitory metaloproteinaz tak¿e
s¹ zaanga¿owane w degradacjê macierzy
zewn¹trzkomórkowej poprzez zdolnoœæ do
eliminacji MMPs oraz zdolnoœæ do hamowania aktywacji tych enzymów. Tworz¹ wi¹zania zarówno z formami aktywnymi jak i
latentnymi MMPs powoduj¹c zablokowanie
mo¿liwoœci od³¹czenia koñca N-terminalnego okreœlonych metaloproteinaz, co uniemo¿liwia ich aktywacjê. Biologiczna funkcja
tkankowych inhibitorów metaloproteinaz jest
ró¿norodna.
Z jednej strony odpowiedzialne s¹ za
zahamowanie syntezy oraz aktywnoœci enzymów proteolitycznych, natomiast z drugiej
strony wykazuj¹ w³aœciwoœci antyapoptotyczne oraz proproliferacyjne [30]. G³ówn¹
funkcj¹ TIMPs, oprócz zdolnoœci do hamowania aktywnoœci MMPs, jest tak¿e zdolnoœæ do stymulowania wzrostu nowotworów.
Stwierdzono, ¿e TIMPs bior¹ udzia³ zarówno w procesach degradacji, jak i syntezy
macierzy pozakomórkowej reguluj¹c oba te
procesy.W wyniku nadmiernego wydzielania MMPs, m.in. przez komórki nowotworowe, dochodzi do zwiêkszonego wydzielania
TIMP. Ponadto w przebiegu procesu nowotworowego wzrost syntezy MMPs, zarówno
w komórkach guza jak i podœcielisku nowotworu, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹
inhibitorów metaloproteinaz. Nadmierna synteza MMPs, w porównaniu do syntezy inhibitorów tkankowych, powoduje nasilenie procesów degradacyjnych, co z kolei powoduje
zwiêkszon¹ migracjê komórek guza [30].
Wed³ug niektórych autorów TIMP-1 wydzielany jest g³ównie przez komórki zrêbu,
natomiast TIMP-2 zarówno przez podœcielisko jak i komórki nowotworowe [17,27,29].
Ponadto w badaniach innych autorów, opie681
raj¹c siê na badaniach immunohistochemicznych, wykazano, ¿e ekspresja tych parametrów by³a wy¿sza w porównaniu z ekspresj¹ ¿elatynaz, co mo¿e sugerowaæ ich
aktywnoœæ hamujac¹ w stosunku do enzymów proteolitycznych [5].
W niniejszej pracy wykazano niewielkie
ró¿nice w ekspresji MMP-2 i MMP-9 a odpowiadaj¹cym im inhibitorom w utkaniu guza
(dane niepublikowane). Zaobserwowano
natomiast znacznie wy¿sze wartoœci ekspresji MMP-2 w zrêbie nowotworu w porównaniu z ekspresj¹ TIMP-2 w tej samej lokalizacji. Ponadto wykazano zale¿noœæ pomiêdzy ekspresj¹ MMP-9 a TIMP-1 (dane niepublikowane).
Ocena lokalizacji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz pozostaje wci¹¿ nierozstrzygniêta. Istniej¹ doniesienia stwierdzaj¹ce, ¿e ekspresja TIMP-1, TIMP-2 zachodzi wy³¹cznie na powierzchni komórek nowotworowych [18]. Natomiast wyniki badañ
Sutinena i wsp. [27] oraz innych autorów [29]
wskazuj¹ na ekspresjê TIMP-2 w zlokalizowanych bezpoœrednio przy utkaniu guza
komórkach zrêbu. W wyniku badañ przedstawionych w niniejszej pracy wykazano
ekspresjê oznaczanych parametrów zarówno w komórkach nowotworowych jak i w
podœcielisku nowotworu. Warto podkreœliæ,
i¿ zaobserwowano wy¿sz¹ ekspresjê oznaczanych inhibitorów tkankowych w utkaniu
nowotworu w porównaniu z otaczaj¹cym do
podœcieliskiem. W niniejszej pracy wykazano ekspresjê TIMP-1 w 91% przypadków
SCC i TIMP-2 w 22% przypadkach SCC,
natomiast TIMP-3 w 100% badanych prób.
Ponadto dla TIMP-3 odnotowano najwy¿sz¹
ekspresjê zarówno w nowotworze jak i zrêbie. Natomiast najni¿sze poziomy ekspresji
stwierdzono w przypadku TIMP-2. Analizuj¹c ekspresjê badanych czynników w podœcielisku, zaobserwowano zmniejszon¹ ekspresjê bezpoœrednio przy froncie naciekania nowotworu (w fibroblastach), natomiast
siln¹ ekspresjê stwierdzono w nacieku zapalnym. Ponadto nie zaobserwowano ekspresji inhibitorów w podœcielisku znajduj¹cym siê wewn¹trz utkania nowotworu. W
œwietle dostêpnych danych literaturowych
jest to nowe stwierdzenie, które mo¿e czêœciowo t³umaczyæ zjawisko promocji nowotworu przez naciek zapalny. Dotychczas
naciek zapalny by³ traktowany jako silne Ÿród³o czynników wzrostowych wzmagaj¹cych
proliferacjê komórek nowotworu. W œwietle
wyników niniejszej pracy naciek zapalny
wokó³ nowotworu, poprzez wydzielanie inhibitorów enzymów degraduj¹cych podœcielisko, jest tak¿e czynnikiem hamuj¹cym powstanie przerzutów. W aspekcie obrony organizmu przed nowotworem (tumor-host
interaction) w wiêkszoœci dostêpnego piœmiennictwa naciek zapalny jest opisywany
jako wyk³adnik immunologicznego „zwalczania” komórek nowotworowych. Wyniki niniejszych badañ wskazuj¹ na mo¿liwoœæ istnienia tak¿e innych mechanizmów obronnych
przed progresj¹ nowotworow¹. Christopoulos i wsp. [5] wykazali prawie dwukrotnie
wy¿sz¹ ekspresjê oznaczanych parametrów
(TIMP) w tkance nowotworowej ni¿ w materiale kontrolnym. Zjawisko to wskazuje na
pewn¹ zale¿noœæ sugeruj¹c¹, i¿ wy¿sze stê¿enia tkankowych inhibitorów w utkaniu
682
guza maj¹ za zadanie „przygotowaæ” tkankê do inwazji nowotworowej. Autorzy wskazuj¹ na zdolnoœæ syntezy TIMP-2 nie tylko
przez komórki podœcieliska, ale tak¿e przez
komórki nowotworowe, zw³aszcza w póŸnych etapach rozwoju nowotworu [5].
Cytoplazmatyczn¹ ekspresjê tkankowego inhibitora-1 stwierdzono w wielu typach
nowotworów m.in. w raku piersi [33], p³uc
[34], ¿o³¹dka [25], a tak¿e w raku p³askonab³onkowym krtani [8]. Badania Görötha i wsp.
[8] wskazuj¹ na supresorowe w³aœciwoœci
tkankowych inhibitorów metaloproteinaz
(TIMP-1, TIMP-2) w stosunku do inwazji oraz
wzrostu nowotworu. Badania autorów wykaza³y tak¿e, ¿e zwiêkszenie ekspresji na poziomie transkrypcyjnym inhibitorów TIMP-1
i TIMP-2 w konsekwencji prowadzi do
zmniejszenia aktywnoœci enzymatycznej
MMPs, podlegaj¹cych regulacji okreœlonym
inhibitorom. Ponadto badania Sato i wsp.
[22-24] wykaza³y, ¿e w wyniku aktywacji
MMPs, dochodzi jednoczeœnie do syntezy
tkankowych inhibitorów metaloproteinaz
przez komórki zrêbu. Immunohistochemiczna analiza ekspresji TIMP-3, przeprowadzona przez Miyazaki i wsp. wykaza³a ekspresjê oznaczanego parametru w utkaniu nowotworu, zaznaczaj¹c jej brak przy „froncie
naciekania” guza. Ci sami autorzy stwierdzili
obni¿on¹ ekspresjê w centralnej czêœci,
wskazuj¹c na wzrost ekspresji TIMP-3 w
zewnêtrznej czêœci utkania nowotworu [14].
Znamienn¹ korelacjê spadku ekspresji
TIMP-3 z nasileniem stopnia inwazji oraz
obecnoœci¹ przerzutów do wêz³ów ch³onnych, potwierdzaj¹ nasze obserwacje. Analiza ekspresji TIMP-3 wykaza³a spadek œrednich wartoœci TIMP-3 w podœcielisku oraz w
komórkach nowotworowych w stadium N2
w stosunku do N0. Natomiast w N3 odnotowano wzrost ekspresji tego inhibitora. Ponadto liczni autorzy podkreœlili znaczenie
prognostyczne TIMP-3, wskazuj¹c, i¿ pacjenci, u których obserwowano spadek ekspresji tkankowego inhibitora-3 charakteryzowali siê krótszym czasem prze¿ycia, w porównaniu z pacjentami z wy¿sz¹ ekspresj¹ TIMP-3. Badania te sugeruj¹ znaczenie
TIMP-3 jako czynnika wykazuj¹cego w³aœciwoœci supresorowe w stosunku do wzrostu
nowotworów oraz procesu angiogenezy
[20,26].
Na podstawie przedstawionej powy¿ej
dyskusji mo¿na wysun¹æ hipotezê, ¿e w ró¿nych typach raków p³askonab³onkowych
obszaru g³owy i szyi, istniej¹ zró¿nicowane
mechanizmy zwi¹zane z procesem transformacji nowotworowej uzale¿nione od MMPs
i ich inhibitorów.
Utrzymanie równowagi miêdzy aktywnoœci¹ enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów odgrywa istotn¹ rolê w utrzymaniu prawid³owej struktury tkanek oraz zapobiega
degradacji sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej. Nadmierna ekspresja enzymów
proteolitycznych oraz brak aktywnoœci odpowiednich inhibitorów prowadzi do destabilizacji równowagi pomiêdzy okreœlonymi bia³kami, co w konsekwencji u³atwia migracjê
komórek nowotworowych. Natomiast nadekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w stosunku do enzymów proteolitycznych prowadzi do zahamowania migracji
komórek oraz tworzenia przerzutów odlePrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
g³ych [15]. Rozwój wiedzy dotycz¹cej roli
metaloproteinaz oraz ich inhibitorów, podkreœla znaczenie szlaków aktywacji MMP2 i MMP-9 [3,6,28]. Ponadto ocena wzajemnych interakcji pomiêdzy wyszczególnionymi parametrami, w procesie inwazji
nowotworowej, mo¿e przyczyniæ siê do rozwoju terapii opartej na dzia³aniu przeciwinwazyjnym, a poznanie mechanizmów interakcji dzia³ania okreœlonych metaloproteinaz oraz ich inhibitorów mo¿e mieæ istotny
wp³yw na strategie terapeutyczne.
Piœmiennictwo
1. Bodnar M, Rekwirowicz H, Burduk P. i wsp.: Impact of tobacco smoking on biologic background of
laryngeal squamous cell carcinoma. Przegl. Lek.
2009, 66, 598.
2. Bieñ S., Kamiñski B., ¯y³ka S. i wsp.: Ewolucja
obrazu epidemiologicznego i klinicznego raka krtani
i krtaniowej czêœci gard³a w Polsce w latach 19912001. Otolaryngol. Pol. 2005, 59, 169.
3. Birkedal-Hansen B., Pavelic Z.P., Gluckman J.L.
et al.: MMP and TIMP gene expression in head and
neck squamous cell carcinomas and adjacent tissues. Oral Dis. 2000, 6, 376.
4. Blavier L., Henriet P., Imren S. et al.: Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in cancer. Ann. N
Y Acad. Sci. 1999, 878, 108.
5. Christopoulos T.A., Papageorgakopoulou N.,
Ravazoula P. et al.: Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in squamous
cell laryngeal carcinoma. Oncol. Rep. 2007, 18, 855.
6. Clark I.M., Swingler T.E., Young D.A.: Acetylation
in the regulation of metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression. Front
Biosci. 2007, 12, 528.
7. Egeblad M., Werb Z.: New functions for the matrix
metalloproteinases in cancer progression. Nat. Rev.
Cancer. 2002, 2, 161.
8. Göröth T., Beier U.H., Bäumken J. et al.: Metalloproteinases and their inhibitors: influence on tumor
invasiveness and metastasis formation in head and
neck squamous cell carcinomas. Head Neck. 2006,
28, 31.
9. Gupta G.P., Massagué J.: Cancer metastasis: building a framework. Cell. 2006, 127, 679.
10. Hunter K.W.: Host genetics and tumor metastasis. Br. J. Cancer 2004, 90, 752.
11. Jodele S., Blavier L., Yoon J.M. et al.: Modifying
the soil to affect the seed: role of stromal-derived
matrix metalloproteinases in cancer progression.
Cancer Metastasis Rev. 2006, 25, 35.
12. Kalluri R., Zeisberg M.: Fibroblasts in cancer. Nat.
Rev. Cancer 2006, 6, 392.
13. McAllister S.S., Wienberg R.A.: Tumor-host interactions: a far-reaching relationship. J. Clin. Oncol.
2010, 28, 4022.
14. Miyazaki T., Kato H., Nakajima M. et al.: An immunohistochemical study of TIMP-3 expression in
oesophageal cell carcinoma. Br. J. Cancer. 2004,
91, 1556.
15. Murphy G., Nagase H.: Progress in matrix
metalloproteinase research. Mol. Aspects Med.
2008, 29, 290.
16. Nakopoulou L., Tsirmpa I., Alexandrou P. et al.:
MMP-2 protein in invasive breast cancer and the
impact of MMP-2/TIMP-2 phenotype on overall survival. Breast Cancer Res. Treat. 2003, 77, 145.
17. Oberg A., Höyhtyä M., Tavelin B. et al.: Limited
value of preoperative serum analyses of matrix
metalloproteinases (MMP-2, MMP-9) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMP-1, TIMP2) in colorectal cancer. Anticancer Res. 2000, 20,
1085.
18. Ohashi K., Nemoto T., Nakamura K. et al.: Increased expression of matrix metalloproteinase-7,
and -9 and membrane type matrix metalloproteinase
in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer.
2000, 88, 2201.
19. Oppenheimer S.B.: Cellular basis of cancer metastasis: A review of fundamentals and new advances. Acta Histochem. 2006, 108, 327.
20. Qi J.H., Ebrahem Q., Moore N. et al.: A novel function for tissue inhibitor of metalloproteinases-3
(TIMP-3): inhibition of angiogenesis by blockage of
M. Bodnar i wsp.
VEGF binding to VEGF receptor-2. Nat. Med. 2003,
9, 407.
21. Remmele W., Stegner H.E.: Vorschlag zur
einheitlichen Definition eines immunoreactiven Score
(IRS) für den Immunohistochemischen Ostrogenrezeptor - Nachwies (ER-ICA) im Mammakarzinomgewebe. Pathologe. 1987, 8, 138.
22. Sato H., Kida Y., Mai M. et al.: Expression of genes
encoding type IV collagen-degrading metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in various human tumor cells. Oncogene
1992, 7, 77.
23. Sato H., Takino T., Kinoshita T. et al.: Cell surface
binding and activation of gelatynase A induced by
expression of membranr-type-1- matrix metallo-proteinase (MT1-MMP). FEBS Lett. 1996, 385, 238.
24. Sato H., Takino T., Okada Y. et al.: A matrix
metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumor cells. Nature. 1994, 370, 61.
25. Shim K.N., Jung S.A., Joo Y.H. et al.: Clinical sig-
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
nificance of tissue levels of matrix metalloproteinases
and tissue inhibitors of metalloproteinases in gastric
cancer. J. Gastroenterol. 2007, 42, 120.
26. Spurbeck W.W., Ng C.Y., Strom T.S. et al.: Enforced
expression of tissue inhibitor of matrix metallo-proteinase-3 affects functional capillary morphogenesis
and inhibits tumor growth in a murine tumor model.
Blood. 2002, 100, 3361.
27. Sutinen M. Kainulainen T., Hurskainen T. et al.:
Expression of matrix metalloproteinase (MMP-1 and
-2) and their inhibitors (TIMP-1, -2, and -3) in oral
lichen planus, dysplasia, squamous cell carcinoma
and lymph node metastasis. Br. J. Cancer. 1998, 77,
2239.
28. Vihinen P., Käkäri V.M.: Matrix metalloproteinases
in cancer: prognostic markers and therapeutic targets. Int. J. Cancer 2002, 99, 157.
29. Visscher W., Höyhtyä M., Ottosen S.K. et al.: Enhanced expression of tissue inhibitor of metalo-proteinase-2 (TIMP-2) in the stroma of breast carcinoma
correlates with tumor recurrence. Int. J. Cancer 1994,
59, 339.
30. Visse R., Nagase H.: Matrix metalloproteinases and
tissue inhibitors of metalloproteinases: structure,
function, and biochemistry. Circ. Res. 2003, 92, 827.
31. Wang W., Goswami S., Sahai E. et al.: Tumor cells
caught in the act of invading: their strategy for enhanced cell motility. Trends Cell Biol. 2005, 15, 138.
32. Wierzbicka M., Szyfter W., Bieñ S. i wsp.: Zalecenia
diagnostyczno-terapeutyczne dla wybranych
nowotworów g³owy i szyi. Rak krtani. Wspó³cz. Onkol.
2006, 5, 195.
33. Wu Z.S., Wu Q., Yang J.H. et al.: Prognostic significance of MMP-9 and TIMP-1 serum and tissue expression in breast cancer. Int. J. Cancer. 2008, 122, 2050.
34. Ylisirnio S., Hoyhtya M., Turpeenniemi-Hujanen
T.: Serum matrix metalloproteinase-2, -9 and tissue
inhibitors of metalloproteinase-1, -2 in lung cancerTIMP-1 as prognostic marker. Anticancer Res. 2000,
20, 1311.
683