Etiopatogeneza choroby von Willebranda,MikroRNA w terapii

Polski zespół odkrył nową metodę
obrazowania molekularnego
Zespół prof. Wiesława Gruszeckiego z UMCS w Lublinie pobił światowy
rekord rozdzielczości w mikroskopii podczerwieni oraz odkrył nową
metodę obrazowania molekularnego. Wyniki zostały ogłoszone w pismach
„Nanoscale” i „Analytical Chemistry”.
Badania opisane w „Nanoscale” dotyczą obrazowania mikroskopowego próbek w
oparciu o zjawisko absorpcji promieniowania z zakresu podczerwieni (IR).
Rozdzielczość konwencjonalnych metod obrazowania mikroskopowego w
podczerwieni sięga zaledwie kliku mikrometrów (milionowych części metra), co
odpowiada rozmiarom typowej bakterii. Ostatnie lata przyniosły ogromny postęp
w mikroskopii IR, w związku z opracowaniem systemu mikroskopowego o nazwie
„nano-IR”. Umożliwił on osiągnięcie rozdzielczości w obrazowaniu IR na poziomie
około 100 nanometrów (miliardowych części metra). 100 nanometrów to nieco
mniej niż średnica wirusa HIV.
Logo UMCS
źródło: UMCS
Zespół prof. Gruszeckiego we współpracy z fizykami z Politechniki Federalnej w
Lozannie (EPFL), podjął udaną próbę pobicia tego rekordu – udało się obniżyć
granicę rozdzielczości do poziomu około 10 nm (taka jest na przykład średnica
najmniejszych cząsteczek dymu tytoniowego). Impulsy lasera nagrzewają próbkę,
co przekłada się na różnicę położenia skanującej ją dźwigienki. Odbite od tej
dźwigienki światło lasera podlega zmianom, z których można odczytać obraz.
Osiągnięcie tak dużej rozdzielczości było możliwe dzięki opracowaniu specjalnych
próbek złożonych z dwóch składników (lipidów i białek)różniących się znacznie
przewodnictwem termicznym oraz charakteryzujących się znacznym
uporządkowaniem w kierunku prostopadłym do płaszczyzny próbki.
Drugie osiągnięcie, ogłoszone na łamach czasopisma Analytical Chemistry,
związane jest z odkryciem metody obrazowania molekularnego w oparciu o efekt
foto-termiczny. Nowa technika nazwana została przez autorów mikroskopią
obrazowania foto-termicznego (PTIM, Photo-Thermal Imaging Microscopy).
Umożliwia ona obrazowanie w nanoskali obiektów molekularnych, bazując na
wydzielanym przez nie cieple. Metoda ta może być zastosowana w badaniach
próbek biologicznych, a także w naukach materiałowych.
„W trakcie prowadzenia prac badawczych często napotykamy na bariery istotnie
ograniczające ich postęp. W wielu przypadkach bariery te wynikają z ograniczeń
samych technik eksperymentalnych. Zdarza się również, iż niejako „przy okazji”,
badacze dokonują modyfikacji tych metod, a nawet odkrywają i proponują nowe
techniki badawcze. Historia wielkiej nauki, jak też i codziennej praktyki
laboratoryjnej, jest bogata w tego typu przypadki. Wydaje się, iż do tej kategorii
zaszeregować można nasze ostatnie wyniki” – powiedział i prof. Gruszecki.
Badania zespołu prof. Gruszeckiego były finansowane ze środków pochodzących z
programu TEAM Fundacji na rzecz Nauki Polskiej. Profesor jest laureatem
programu TEAM.
Źródło: www.naukawpolsce.pap.pl
Etiopatogeneza
Willebranda
choroby
von
Choroba von Willebranda jest najczęstszą skazą krwotoczną i jest
związana z niedoborem lub upośledzeniem funkcji czynnika von
Willebranda. Czynnik von Willebranda pełni w hemostazie podwójną
funkcję – uczestniczy w procesie adhezji płytek krwi w miejscu
uszkodzenia naczynia oraz stabilizuje czynnik VIII krzepnięcia, z którym
tworzy w osoczu kompleks.
Choroba została po raz pierwszy opisana w 1926 roku przez fińskiego lekarza
Erika von Willebranda, który scharakteryzował, zaobserwowane wśród
mieszkańców Wysp Alandzkich, dziedziczne i poważne zaburzenie krzepliwości
krwi. Ze względu na patogenezę wyróżnia sie trzy typy choroby: typ 1 (łagodny,
ilościowy), typ 2 (jakościowy) oraz typ 3 (ciężki; całkowity brak czynnika von
Willebranda) [1].
Czynnik von Willebranda (vWF, ang. von Willebrand factor) jest białkiem
adhezyjnym o charakterze multimetrycznej. Syntetyzowany jest w komórkach
śródbłonka naczyń krwionośnych oraz w megakariocytach pod kontrolą genu
znajdującego się w chromosomie 12. W hemostazie pełni on podwójną funkcję,
bierze udział w adhezji płytek krwi w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej
oraz chroni krążące we krwi cząsteczki czynnika VIII przed proteolityczną
degradacją przez aktywowane białko C [2]. Czynnik von Willebranda może
występować w osoczu w postaci małych (LMW, ang. low molecular weight),
średnich (IMW, ang. intermediate molecular weight) oraz dużych (HMW , ang.
high molecular weight) multimetrów, które są rozkładane przez metaloproteinazę
ADAMTS13 [3].
Choroba von Willebranda (vWD, ang. von Willebrand disease) jest uważana za
najczęściej występującą skazę krwotoczną. Przyjmuje się, że częstość objawowej
choroby wynosi 1 na 1000 osób w populacji ogólnej [4]. Obecna klasyfikacja
schorzenia opiera się na kryteriach International Society on Thrombosis and
Haemostasis i wyróżnia trzy typy vWD.
Tabela 1. Klasyfikacja choroby von Willebranda [2]
Ze względu na fakt, że w przebiegu skazy krwotocznej większość oznaczanych
parametrów koagulologicznych ma wartości prawidłowe, diagnostyka choroby jest
bardzo trudna. Przedstawiony przez Polskie Towarzystwo Hematologów i
Transfuzjologów algorytm postępowania w diagnostyce choroby opiera się na
przeprowadzeniu szczegółowego wywiadu klinicznego z pacjentem, wykonaniu
laboratoryjnych testów przesiewowych, badań wstępnych oraz specjalistycznych
[5]. U większości chorych choroba przebiega bezobjawowo, dlatego bardzo często
mogą oni nie wiedzieć o jej istnieniu. Do najczęstszych objawów skazy zaliczamy
łatwe siniaczenie, częste lub przedłużające się krwawienie z nosa, długotrwale
gojenie się skaleczeń, krwawienia z układu pokarmowego, przedłużone
krwawienie po zabiegu stomatologicznym lub chirurgicznym, u kobiet obfite i
długie miesiączki oraz krwotoki poporodowe. Nasilenie objawów jest zależne od
typu choroby von Willebranda. Typ 1 manifestuje się niewielkimi objawami skazy
krwotocznej, podczas gdy w typie 2 i 3 są one zwykle duże, a w typie 3
przypominają hemofilię. Zróżnicowanie objawów jest spowodowane niepełną
penetracją wady genetycznej, u której podstaw leżą wpływ genetycznych
czynników modyfikujących (m.in. białek biorących udział w obróbce
postranslacyjnej modyfikacji, grupa krwi) i niegenetycznych (np. poziom
hormonów tarczycy, stres) [3].
Klasyfikacja vWD na poszczególne typy i podtypy została oparta na ocenie
stężenia antygenu i aktywności czynnika von Willebranda oraz na
specjalistycznych testach, takich jak m.in. analiza multimetrów, test wiązania
FVIII przez vWF czy badania genetyczne. W typie 1 (70% chorych) obserwujemy
częściowy, ilościowy niedobór vWF. Dziedziczenie następuje w sposób
autosomalny dominujący. W podtypie 2A obserwuje się selektywny niedobór
dużych multimetrów, którego przyczyną są nadmierna proteoliza pod wpływem
metaloproteinazy ADAMTS13 lub upośledzenie ich syntezy. Dochodzi tu także do
osłabienia adhezji płytek krwi zależnej od vWF. Ten podtyp także jest dziedziczony
w sposób autosomalny dominujący. Podtyp 2B manifestuje się zwiększonym
powinowactwem vWF do glikoproteiny Ib (GPIb), co nasila proteolizę cząsteczki
von Willebranda oraz usuwanie z krążenia dużych multimetrów. Dochodzi także
do cyklicznej małopłytkowości, wywołanej proteolityczną degradacją agregatów,
powstających z płytek krwi i vWF. Wymienione defekty są skutkiem mutacji w
obrębie regulatorowej sekwencji białka, odpowiedzialnej za wiązanie GPIb z vWF.
W podtypie 2M na skutek mutacji dochodzi do osłabienia interakcji między vWF a
GPIb, wada może być dziedziczona autosomalnie dominująco lub recesywnie.
Podtyp 2N jest zwany inaczej wariantem Normandy i jest dziedziczony jest
autosomalnie recesywnie. Dochodzi tu do obniżenia zdolności wiązania czynnika
von Willebranda z czynnikiem VIII. Obserwuje się niskie stężenie czynnika VIII
przy prawidłowym stężeniu i aktywności vWF. W typie 3 czynnik von Willebranda
jest nieoznaczalny co skutkuje obniżeniem aktywności czynnika VIII.
Następstwem są masywne krwawienia [3].
Logo UMCS
źródło: UMCS
Leczenie choroby von Willebranda jest uzależnione od typu i opiera się na
stymulowaniu wyrzutu vWF z komórek śródbłonka, na zapobieganiu oraz
minimalizowaniu krwawień, podawaniu leków hormonalnych,
antyfibrynolitycznych. Obecnie najczęściej stosuje się desmopresynę oraz
liofilizowane preparaty czynników krzepnięcia krwi. Desmopresyna stymuluje
wyrzut czynnika von Willebranda z ziarnistości Weibela-Palade’a śródbłonka
naczyniowego do osocza. W typie 3 i niektórych podtypach typu 2 desmopresyna
jest lekiem nieskutecznym, a podtypie 2B może wywołać małopłytkowość. Dożylne
podawanie czynników krzepnięcia jest określane mianem terapii substytucyjnej
[4].
Ewelina Olech
Piśmiennictwo:
1.Zawilska K., Windyga J., Undas A. Zaburzenia hemostazy [W:] Gajewski P. red.
Interna Szczeklika 2012, Kraków; 2012: 1719-1721
2. Iwaniec T. Diagnostyka choroby von Willebranda. J Trans Med, 2011, 4, 4:
178–182.
3. Bogusz M., Lewandowski K. Choroba von Willebranda: od struktury genu do
zaburzeń funkcji cząsteczki białkowej. Acta Haematologica Polonica, 2005, 35, 1:
33-43.
4. Windyga J. Współczesne zasady rozpoznawania i leczenia choroby von
Willebranda. Acta Haematologica Polonica, 2011, 42, 3: 401-414.
5. Zdziarska J., Chojnowski K., Klukowska A. i wsp. Postępowanie w chorobie von
Willebranda. Zalecenia Polskiego Towarzystwa Hematologów i Transfuzjologów
2008. Medycyna Praktyczna, wydanie specjalne 2008, 12.
MikroRNA w terapii nowotworów
(I) — małe cząsteczki o wielkim
znaczeniu
Był rok 1993. Zespoły Victora Ambrosa oraz Gary’ego Ruvkuna badając
nicienia Caenorhabditis elegans, modelowy organizm współczesnej
genetyki i nauk biologicznych odkryły, że ilość białka o symbolu LIN14
regulowana jest przez małe RNA, kodowane przez gen o nazwie lin-4[1].
Ich odkrycia zwiastowały prowadzenie badań nad mikroRNA na szeroką
skalę.
MikroRNA to krótkie (20 – 23 nukleotydowe), jednoniciowe, niekodujące
cząsteczki RNA. [2] Dotychczasowe badania pozwalają sądzić, że w organizmie
człowieka występuje ok. 1000 genów kodujących mikroRNA. Ta ilość reguluje
około 30% ludzkich genów. Szacuje się obecnie, że 70% genów mikroRNA
znajduje się w obszarze egzonów oraz/ lub intronów innych genów. 30%
zlokalizowane jest w sekwencjach niekodujących.
Narodziny cząsteczki — jak powstaje mikroRNA?
Geny mikroRNA można znaleźć zarówno w intronach, egzonach, jak również
pomiędzy genami odpowiedzialnymi za kodowanie białka lub niekodującego RNA.
[3] Stąd traskrybowane są przez polimerazę II RNA. Generuje ona jednak nie
„gotowe” cząsteczki, lecz ich prekursory zwane pri-mikroRNA. Zawierają one
fragmenty przypominające kształtem nieregularną, wydłużoną spinkę (około 70
nukleotydów długości).
Następnie ma miejsce dojrzewanie mikroRNA. Jest ono dwuetapowe i przebiega z
udziałem rybonukleaz Drosha i Dicer, zaliczanych do rodziny RNaz III.[3]
Pierwszy etap, przycinanie pri-mikroRNA do pre-mikroRNA przebiega w jądrze
komórkowym. Przeprowadza go kompleks Mikroprocesora, w skład którego
wchodzą Drosha oraz białko DGCR8. Następnie, z pomocą Eksportyny-5 zachodzi
transport utworzonej w ten sposób cząsteczki poprzez pory jądrowe do
cytoplazmy, gdzie ma miejsce II etap dojrzewania. W jego efekcie wytwarzany jest
dupleks mikroRNA/mikroRNA*. Aby powstał, do akcji wkracza rybonukleaza
Dicer. Zazwyczaj występuje ona w kompleksie z białkiem Argonaute (popularnie
nazywanym Argo) oraz TRBO i/lub PACT. Białka te pozostają także w składzie
aktywnego kompleksu odpowiedzialnego za wyciszanie ekspresji genów.
MikroRNA funkcjonują w kompleksie rybonukleoproteinowym o nazwie miRISC
(ang. microRNA induced silencing complex). [3] Zależnie od stopnia w jakim
sekwencja mikroRNA jest komplementarna do miejsca jego wiązania w mRNA a
także rodzaju białka Ago wchodzącego w skład miRISC, może on prowadzić do
nukleolitycznego przecięcia mRNA albo represji jego translacji.
Warto zauważyć, że większość zwierzęcych mikroRNA posiada zdolność wiązania
się z minimum kilkoma częściowo komplementarnymi miejscami, które występują
zwykle w 3’UTR. [3] Ich działanie jest kooperatywne, w efekcie czego następuje
inhibicja syntezy białka. Poziom transkryptu zazwyczaj się wtedy nie zmienia.
Następnie regulowane transkrypty są transportowane do tzw. ciałek P — miejsc
ich przechowywania i/lub degradacji.
Małe cząsteczki o wielkim znaczeniu
MikroRNA pełni szereg istotnych funkcji, uczestnicząc w regulacji wielu ważnych
procesów biologicznych. Według różnych badań różnego rodzaju cząsteczki
mikroRNA biorą udział w kontroli proliferacji komórki — czyli jej namnażania, a
także różnicowania, apoptozy, w metabolizmie tłuszczów, sekrecji insuliny oraz
procesach hematopoezy. [2] Wspomniane już mikroRNA lin-4 stanowi najlepiej
poznany przykładem czynności mikroRNA. Ulega on ekspresji w pierwszym
stadium larwalnym L1 Caenorhabditis elegans. Cząsteczka ta odpowiada za
inhibicję ekspresji genów lin-14 oraz lin-28, będących regulatorami wczesnych
stadiów rozwojowych nicienia. Jego mutacja skutkuje powtórzeniem podziałów z
pierwszego stadium larwalnego zamiast różnicowania komórek.
Jakie są inne przykłady działalności tych małych cząsteczek? MikroRNA-15a
uczestniczy w regulacji apoptozy, jednej z rodzajów śmierci komórki, działając na
gen BCL-2, mikroRNA-221 bierze udział w regulacji erytropoezy, czyli procesów
namnażania i różnicowania czerwonych ciałek krwi, mikroRNA-27 reguluje
metabolizm ksenobiotyków działając na gen CYP1B, natomiast mikroRNA-375
wpływa na sekrecję insuliny oddziałując na gen o symbolu MTPN .[2]
Olga Andrzejczak
Logo UMCS
źródło: UMCS
Literatura
1. MicroRNAs in body fluids—the mix of hormones and biomarkers; Cortez M. A.
et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 467–477 (2011)
2. Perspektywy zastosowania mikroRNA w leczeniu nowotworów; Ciepłucha A. i
wsp.; Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str. 425–435
3. Rola mikroRNA w patogenezie, diagnostyce i terapii nowotworów; Majorek K.,
Krzyżosiak W.;Współczesna Onkologia (2006) vol. 10; 8 (359–366)
Rola βhCG i USG w ciąży
prawidłowej i nieprawidłowej
Oznaczenie stężenia βhCG w surowicy lub osoczu krwi pełni obecnie
istotną, chociaż pomocniczą rolę w potwierdzeniu ciąży, jej monitorowaniu
oraz prognozowaniu dalszego przebiegu ciąży, a także służy do oceny
wydolności łożyska oraz oceny stanu płodu.
Gonadotropina kosmówkowa (ang. human Chorionic Gonadotropin) zbudowana
jest z dwóch podjednostek: alfa-wytwarzanej przez cytotrofoblast oraz betawytwarzanej przez syncytiotrofoblast. Rutynowe oznaczenia dotyczą stężenia
wolnej podjednostki beta we krwi i wykonywane są z użyciem przeciwciał
monoklinalnych swoistych dla βhCG oraz przeciwciał znakowanych metodą
sandwich (1). Badanie cieszy się dość dużym zainteresowaniem, ponieważ jest
stosunkowo prostym i powszechnie dostępnym sposobem na potwierdzenie
wczesnej ciąży. Oznaczeniu poziomu βhCG czasem towarzyszy oznaczenie
poziomu progesteronu, który informuje o czynności ciałka żółtego ciążowego i
stanowi objaw rokowniczy.
W komercyjnych testach ciążowych poziom βhCG oznaczany jest w moczu.
Pozytywny wynik testu można już uzyskać po 8 dniach od zapłodnienia (w
zależności od czułości testu, zwykle od 25 mIU/ml) niemniej jednak biologiczna
aktywność βhCG jest większa w surowicy krwi niż w moczu, a test najlepiej jeast
wykonać najwczesniej w terminie spodziewanej miesiączki. Stężenie βhCG we
krwi ulega logarytmicznemu podwajaniu co 2-3 dni, uzyskując maksimum około
9-12 tygodnia ciąży. Wzrost hormonu we krwi obserwuje się do 12-14 tygodnia
ciąży, po czym jego poziom stopniowo się obniża w miarę dojrzewania łożyska,
uzyskując wartości śladowe w ostatnim trymestrze ciąży (1,4).
Normy βhCG mogą nieznacznie różnić się między laboratoriami, bowiem zależą od
analizatora i zestawu odczynników, a także jednostek miary stosowanych w
danym laboratorium. Wyniki badań mogą być wyrażone w mIU/ml lub IU/L.
Istnieją różnego typu kalkulatory przyrostu βhCG (np. kalkulator), które jednak
powinny być traktowane wyłącznie jako informacja orientacyjna, bowiem wnikliwa
interpretacja wyników należy do lekarza.
Poza okresem ciąży u kobiet przed menopauza wartość βhCG jest niższa od 1
mIU/ml lub 5 mIU/ml w zależności od laboratorium, natomiast u kobiet po
menopauzie poniżej 9 mIU/ml.
Przykładowe normy βhCG w okresie ciąży (analizator Elecsys 2010, odczynniki
HCG+β, ROCHE, normy laboratoryjne):
Tydzień
ciąży
Poziom βhCG
(mIU/ml)
1-4 tydzień
6-71
4-5 tydzień
10-750
6-7 tydzień
160- 32.000
8-9 tydzień
32.065-150.000
9-10
tydzień
63.800-151.000
10-12
tydzień
46.500-187.000
12-13
tydzień
28.000-210.000
13-15
tydzień
14.000-62.500
15-16
12.000-71.000
tydzień
16-17
tydzień
9.000-56.000
17-39
8.100-58.000
tydzień
Uważa się, że poziom βhCG może mieć również związek z tzw.
niepowściągliwymi wymiotami ciężarnych (ang. hyperemesis gravidarum,
HG). HG dotyczy nudności i wymiotów, które pojawiają się przed 20. tygodniem
ciąży i są na tyle ciężkie, że mogą prowadzić do hospitalizacji. Duża częstotliwość
występowania wymiotów może bowiem powodować odwodnienie, kwasicę,
zaburzenia elektrolitowe i równowagi kwasowo-zasadowej oraz inne poważne
stany. Objawy rozwijają się równolegle ze wzrostem βhCG we krwi ciężarnej.
Niektóre wyniki badań wskazują na wyższy niż przeciętnie poziom βhCG u kobiet
z HG. Upatruje się także związku HG ze stanami zwiększonego stężenia βhCG
takimi jak ciąża bliźniacza, zaśniad groniasty oraz z zespołem Downa i płcią
żeńską płodu (7).
W przypadku niższych niż spodziewane stężeń βhCG we wczesnej ciąży można
podejrzewać upośledzenie funkcji trofoblastu i spodziewać się poronienia, bądź
też być oznaką poronienia zatrzymanego, ciąży ektopowej (pozamacicznej) lub
obumarcia płodu (1).
Poronienia samoistne występują w 25% do 50% ciąż przed 14 tygodniem ciąży.
Wyróżnia się poronienie całkowite, niecałkowite oraz opóźnione. Wśród cech
świadczących o poronieniu całkowitym wymienia się całkowite usunięcie
elementów jaja płodowego, zamknięta szyjka macicy, endometrium cieńsze niż 15
mm. Poronienie niecałkowite może cechować się niecałkowitym usunięciem
elementów jaja płodowego, otwartą lub zamkniętą szyjką macicy, tkanka może
zawierać pęcherzyk ciążowy i być heterogeniczna. O poronieniu opóźnionym (w
tym ‘pustym jaju płodowym’) może świadczyć brak usuwania elementów jaja
płodowego, zamknięta szyjka macicy, obecność pęcherzyka ciążowego o wielkości
powyżej 20 mm bez echa zarodka i pęcherzyka żółtkowego, obecność pęcherzyka
ciążowego o wielkości poniżej 20 mm i bez wzrostu w ciągu 7 dni, zgrubienie na
krawędzi embrionu (ang. fetal pole) powyżej 6 mm bez wykrywalnej aktywność
serca zarodka, bądź poniżej 6 mm bez zmian w ciągu 7 dni (3).
Przyczyny poronień:
1. Zaburzenia w obrębie jaja płodowego;
2. Patologie matczyne (zaburzenia anatomiczne narządów rodnych, mięśniaki,
zrosty zapalne);
3. Nieprawidłowości kosmówki (zmiany naczyniowe, zwyrodnienie zaśniadowe,
zmiany wsteczne, mikrozawały, zwapnienia);
4. Zaburzenia czynnościowe (niewydolność ciałka żółtego, upośledzona zdolność
wydzielania hCG i progesteronu, poronienie biochemiczne);
5. Choroby matki (wirusowe, zakaźne, immunologiczne, urazy, czynniki
psychiczne);
6. Czynniki środowiskowe (leki-cytostatyki, antymetabolity, preparaty jodu,
sulfonamidy) (4).
Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienia tzw. ciąży
bezzarodkowej (ang. anembryonic pregnancy) zwanej także poronieniem
chybionym (ang. missed abortion) oraz występującą także pod popularną, choć
zwykle nieużywaną przez lekarzy nazwą pustego pęcherzyka ciążowego –‘pustego
jaja płodowego’ (ang. blighted ovum). Stanowi ono około 49% do 90% wszystkich
poronień samoistnych. Wśród przyczyn pustego jaja płodowego wymienia się
przede wszystkim nieprawidłowy kariotyp, w którym dominuje przede wszystkim
autosomalna trisomia, triploidia oraz monosomia X. Podejrzenie pustego jaja
płodowego może pojawić się, gdy w USG stwierdza się takie cechy jak pęcherzyk
ciążowy w macicy przy braku echa zarodka i pęcherzyka żółtkowego, zbyt mała
średnica pęcherzyka ciążowego w stosunku do wieku ciąży, nieprawidłowy wzrost
pęcherzyka ciążowego (gdy pęcherzyk wielkości 2,5 cm przyrasta mniej niż 75% w
ciągu 1 tygodnia), nisko osadzony pęcherzyk ciążowy, przy równoczesnym
prawidłowym lub nieprawidłowym przyroście βhCG. Bicie serca płodu powinno
być już wykrywalne w 8 tygodniu ciąży, dlatego też stwierdzenie we wczesnej
ciąży braku pewnych ultrasonograficznych cech budzi pewne podejrzenia. Zaleca
się wykonanie kolejnego USG po 7-14 dniach celem potwierdzenia i podjęcia
odpowiednich działań terapeutycznych (wyczekiwanie na poronienie lub środki
farmaceutyczne lub zabieg łyżeczkowania) (2, 3).
Seryjne oznaczenia βhCG odgrywają dość dużą rolę w diagnostyce ciąży
pozamacicznej. Poziom tego hormonu jest względnie stały w 70% takich ciąż,
natomiast w co piątej ciąży pozamacicznej poziom βhCG może mieć prawidłowy
przyrost. Oprócz oznaczeń beta hCG duże znaczenie diagnostyczne mają także w
USG przezpochwowe, poziom progesteronu w surowicy krwi, wgląd do jamy
otrzewnej za pomocą laparoskopii oraz diagnostyczne wyłyżeczkowanie jamy
macicy. Uważa się, że poziom progesteronu poniżej 5 ng/ml dość wiarygodnie
wskazuje na duże prawdopodobieństwo wystąpienia ciąży pozamacicznej lub
patologicznej ciąży wewnątrzmacicznej. Już po 5,5 tygodnia trwania ciąży można
wykazać w USG przezpochwowym pozamaciczną lokalizację ciąży, jednak gdy
poziom βhCG jest poniżej 1.000 mIU/dl nie można na tej podstawie postawić
jednoznacznej diagnozy (5,6).
Istnieje także mozliwość równoczesnego istnienia ciąży pozamacicznej oraz
wewnatrzmacicznej. Zjawisko to nazywane jest ciążą heterotopową (6).
Należy również pamiętać, że poza wykryciem i monitorowaniem ciąży, poziom
βhCG znajduje zastosowanie w monitorowaniu pacjentów z chorobami
trofoblastycznymi oraz pacjentów z produkującymi ten hormon komórkami
nowotworowymi. Podwyżone wartości hcG wraz z podjednostką beta występują w
wielu nowotworach złośliwych takich jak choriokarcinoma jądra lub łożyska,
zaśniad groniasty, nasieniak, rak trzustki, żołądka, jajnika, okrężnicy, płuca,
piersi, wątroby czy nerki (8).
Logo UMCS
źródło: UMCS
Wykorzystanie seryjnych oznaczeń odpowiednich hormonów płciowych, w tym
βhCG, wraz z badaniem ultrasonograficznym pozwala w około 95% do 99%
przypadków na ustalenie właściwego rozpoznania ciąży zagrożonej lub
nieprawidłowej oraz rokowania co do jej dalszych losów.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
PIŚMIENNICTWO:
1. Kaźmierczak W. i wsp. Przydatność oznaczeń biochemicznych we współczesnej
diagnostyce poronień. Gin Prak 2004;4(12):16-20.
2. Bernard KG., Cooperberg PL. Sonographic differentiation between blighted
ovum and early viable pregnancy. AJR 1985; 144:597-602
3. Allison JN. et al. Management of first trimester pregnancy loss can be safely
moved into the office. Rev Obstet Gynecol. 2011; 4(1): 5–14.
4. Kaźmierczak W. i wsp. Przyczyny, etiologia oraz współczesne metody
diagnostyki i leczenia poronień. Gin Prakt 2004, 12, 4: 26-29
5. Jakiel G. i wsp. Ciąża ektopowa. Prz Menopauz 2006; 1: 61–64.
6. Farquharson RG. et al. Updated and revised nomenclature for description of
early pregnancy events. Hum Reprod. 2005 ;20(11):3008-3011.
7. Tkaczuk-Włach J. i wsp. Niepowściągliwe wymioty ciężarnych. Prz Menopauz
2007; 5: 310–315.
8. Stenman UH. et al. Human chorionic gonadotropin in cancer. Clin Biochem
2004; 37(7): 549-61
Profesor Cebrat: Z punktu
widzenia biologicznego in vitro
powinno być zabronione
22 lipca 2015 prezydent Bronisław Komorowski podpisał ustawę o in
vitro. Wcześniej ustawa została przyjęta przez Sejm oraz Senat. Wejdzie w
życie po trzech miesiącach od podpisu prezydenta. Tymczasem eksperci od
genetyki człowieka od lat podnoszą racjonalne argumenty, z którymi
trudno się jest nie zgodzić. Są to między innymi: koszty ciągnione
procedury, częstsze wady rozwojowe u poczętych tą metodą dzieci,
powikłania w czasie ciąży i porodu, wcześniactwo oraz pojawianie się
nowych mutacji. Przeczytajcie ciekawe wywiady z ekspertem od genomiki –
prof. Stanisławem Cebratem z Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu
Wrocławskiego.
1. Czy metoda in vitro jest bezpieczna dla dzieci poczętych w ten sposób? Czy
państwo powinno ją refundować?Czy powinniśmy eksperymentować z genomem
człowieka? Dlaczego z punktu widzenia biologicznego in vitro powinno być
zabronione? Z prof. Stanisławem Cebratem, kierownikiem Zakładu Genomiki
Uniwersytetu Wrocławskiego rozmawia w Gazecie Wrocławskiej Maciej
Sas: http://www.gazetawroclawska.pl/artykul/626099,prof-cebrat-in-vitro-to-wielki
-biznes-a-nie-nauka,3,id,t,sa.html
2. Narażamy życie całej populacji: http://www.rp.pl/artykul/988154.html
https://www.youtube.com/watch?v=tHNcjP5AjQo
Metody wykrywania białka M w
gammapatiach monoklonalnych (I)
W diagnostyce chorób układu krwiotwórczego przebiegających ze
zwiększoną liczbą komórek plazmatycznych, niezwykle ważne są badania
laboratoryjne stężenia immunoglobulin, wydzielanych przez te komórki.
Do dyspozycji lekarza i diagnosty pozostaje kilka metod wykrywania
patologicznego białka, takich jak immunoelektroforeza białek surowicy
krwi oraz immunofiksacja. Jednakże obecnie jednym z najbardziej
przydatnych, zarówno przy ustalaniu rozpoznania, doborze leczenia, jak i
w jego monitorowaniu jest badanie wolnych łańcuchów lekkich w surowicy
(ang. serum Free Light Chains, sFLC).
Charakterystyka gammapatii monoklonalnych
Do tzw. gammapatii monoklonalnych zalicza się m.in. zespoły MGUS, szpiczaka
mnogiego, makroglobulinemię Walderstroema, chorobę łańcuchów ciężkich
(HCD), oraz amyloidozę z łańcuchów lekkich. We wszystkich tych schorzeniach
mamy do czynienia z rozrostem klonalnym komórek plazmatycznych lub
limfoplazmatycznych, które produkują kompletne bądź niekompletne (łańcuchy
lekkie/ciężkie) cząsteczki tego samego wariantu immunoglobuliny. Zgodnie z
typem struktury wydzielanej immunoglobuliny możemy mówić o monoklonalnym
białku IgG, IgA, IgM (wyjątkowo rzadko IgD, IgE), oraz o łańcuchach lekkich
kappa i lambda. Do diagnostyki podtypów Ig jeszcze wrócimy, zwróćmy jednak
uwagę na wysoce zmienny charakter cząsteczek immunoglobulin. Ze względu na
swoją rolę w wykrywaniu obcych antygenów, poliklonalne immunoglobuliny
fizjologicznie występujące w ustroju są bardzo różnorodne. Dlatego struktura
monoklonalnej immunoglobuliny w gammapatiach jest w zasadzie unikalna dla
każdego chorego. Wynika stąd wiele problemów diagnostycznych, o czym za
chwilę.
Najnowszy podział gammapatii monoklonalnych jest oparty o odsetek
plazmocytów w szpiku chorego, stężenie produkowanej immunoglobuliny (zwanej
także białkiem M), stosunek stężeń łańcuchów lekkich kappa i lambda, oraz o
objawy konstytucjonalne u chorego. Tetrada objawów klinicznych, określana
akronimem CRAB dotyczy zwiększonego poziomu wapnia, uszkodzenia nerek,
anemii i ubytków kostnych. W zależności od powyższych kryteriów wyróżniono:
–zespoły MGUS – gammapatie monoklonalne o niezidentyfikowanym znaczeniu
(najniższe ryzyko konwersji do pełnoobjawowego szpiczaka);
Logo UMCS
źródło: UMCS
–szpiczak tlący się (ang. smouldering myeloma)- bez objawów konstytucjonalnych,
ale istnieje wyraźne ryzyko progresji do pełnoobjawowego szpiczaka;
–szpiczak plazmocytowy – forma objawowa;
–białaczka plazmocytowa – agresywna, uogólniona postać szpiczaka mnogiego o
przebiegu ostrej białaczki;
–szpiczak niewydzielający – forma szpiczaka produkująca bardzo niewielkie ilości
białka M lub cechujące się bardzo szybką jego degradacją w ustroju;
–makroglobulinemia Walderstroema – typ chłoniaka nieziarniczego z komórek
limfoplazmatycznych, wydzielających immunoglobulinę monoklonalną klasy IgM;
-choroba łańcuchów ciężkich (choroba Franklina, choroba Seligmanna) – bardzo
rzadki rozrost monoklonalny z komórek limfoplazmatycznych, wydzielający
jedynie fragmenty łańcucha ciężkiego, bez łańcuchów lekkich;
–amyloidoza AL (z łańcuchów lekkich) – choroba spichrzeniowa powodowana
odkładaniem się w tkankach nieprawidłowego białka monoklonalnego,
produkowanego przez nowotworowy klon plazmocytów [1].
2. Zmienność białka M
Kłopoty diagnostyczne związane z wykrywaniem białka monoklonalnego są
spowodowane fizjologiczną heterogennością cząsteczek przeciwciał i różną
charakterystyką
nowotworowego
klonu
komórek
plazmatycznych/limfoplazmatycznych. Wykazano że w część przypadków
gammapatii produkowane jest tylko białko w postaci kompletnych przeciwciał, w
innych są to tylko łańcuchy lekkie lub jednocześnie występują łańcuchy lekkie i
kompletne Ig. Dodatkowo szpiczaki niewydzielające mogą produkować na tyle
mało białka M, że jest ono niewidoczne w badaniach laboratoryjnych.
Zmienność Ig prowadzi także do problemów z wynikami fałszywie ujemnymi, gdy
stosowane testy oparte są o przeciwciała monoklonalne anty-Ig. W
przeciwieństwie do poliklonalnych, wykrywają one pojedyncze epitopy na
cząsteczkach Ig, które mogą być nieobecne w niektórych wariantach tak
zmiennych białek. Osobnym problemem jest ko-migracja immunoglobuliny
monoklonalnej (szczególnie IgA) z frakcją białek beta w obrazie
elektroforetycznym. W rzadkich przypadkach w szpiczaku obserwujemy białko
biklonalne, produkowane równolegle przez 2 odrębne klony szpiczakowe [2].
W części drugiej niniejszego opracowania przedstawimy metody
laboratoryjne wykorzystywane w rutynowej diagnostyce gammapatii i
wskażemy, jak radzić sobie z powyższymi problemami, aby uniknąć
wyników fałszywie negatywnych.
Piśmiennictwo:
1. Dmoszyńska A. Dyskrazje plazmocytowe [W:] Dmoszyńska A. (red.) Wielka
Interna – Hematologia, wyd. I, Warszawa, Medical Tribune Polska 2011., str.
532-551.
2. Attaelmannan M, Levinson SS. Understanding and Identifying Monoclonal
Gammopathies. Clinical Chemistry 2000, 46(8) 1230-1238.
Była sobie otyłość. Część 2: Wstęp
do genetyki otyłości.
Jak już pisaliśmy w poprzednim odcinku przyczyną otyłości oprócz
dodatniego bilansu energetycznego są uwarunkowana genetyczne,
zaburzenia wewnątrzwydzielnicze czynności gruczołów, uszkodzenie
podwzgórza oraz wpływ niektórych leków. Otyłość może również wystąpić
po urodzeniu z powodu lepszej przyswajalności pokarmu oraz wzrostu
łaknienia. Pojawia się wtedy jako rekompensata niedożywienia płodu.
Przekarmianie sprzyja rozwojowi otyłości, jednakże istnieje uwarunkowana
genetycznie otyłość tzw. hiperplastyczna (rozrostowa), związana ze zwiększeniem
liczby adipocytów. Ten typ otyłości może również być wynikiem przekarmiania w
dzieciństwie i nie jest zbytnio podatny na odchudzanie.
Intensywne badania nad otyłością wykazały, iż kluczową rolę w patogenezie
otyłości odgrywają czynniki genetyczne. Wyodrębniono 5 genów, które zaliczane
są do tzw. genów otyłości:
-gen ob (obese) – gen leptyny;
-gen db (diabetes) – gen receptora leptyny;
-gen fat –gen karboksypeptydazy E;
-gen agouti – gen peptydu agouti, antagonisty receptora melanotropowego;
-gen tub – gen białka tubby.
Z praktycznego punktu widzenia genetyczne przyczyny otyłości podzielono na:
-Mutacje pojedynczego genu skojarzone z otyłością;
-Mutacje wielogenowe.
Do mutacji pojedynczego genu zalicza się przede wszystkim:
-polimorfizm genu receptora melanokortyny- 4;
-mutacje w genie POMC i agouti;
-mutacje genu receptora dopaminy D4;
-mutacje genów kodujących czynniki stymulujące termogenezę;
-mutacje genów leptyny i receptora leptyny.
Logo UMCS
źródło: UMCS
W następnej części….: polimorfizm genu MC4R oraz mutacje w genie POMC i
agouti jako jedne z przyczyn zaburzeń gospodarki lipidowej.
Biotechnologia medyczna
niezaspokojona pasja życia
—
Biotechnologię medyczną definiuje się jako wykorzystanie układów żywych
do procesów technologicznych znajdujących zastosowanie w przemyśle
zdrowotnym. Dla mnie termin ten określa sztukę zgłębienia największej
znanej człowiekowi tajemnicy — życia, dlatego nie tak znowu dawno temu
zdecydowałam się zasilić szeregi studentów Międzyuczelnianego Wydziału
Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu
Medycznego, pełna podziwu dla czekających na mnie możliwości.
Studia organizują dwie jednostki akademickie, w tym jedna medyczna, ale nie
oznacza to, że program jest ukierunkowany jednotorowo. Choć rzeczywiście
kładzie się duży nacisk na takie obszary, jak histologia, immunologia, czy biologia
komórki nowotworowej, przedmioty są dobrane tak, by nie zawężać horyzontów i
dać jednocześnie dość obszerne pojęcie o tematyce niezwiązanej bezpośrednio z
medycyną, dotyczącej na przykład biotechnologii roślin albo mikrobiologii.
Student decyduje o pogłębianiu wiadomości w danej dziedzinie — biologii
molekularnej i komórkowej, wirusologii molekularnej, czy wspomnianej już
biotechnologii medycznej i roślin — w związku z wyborem tematyki oraz miejsca
wykonywania projektu licencjackiego i pracy magisterskiej.
Nasi wykładowcy nie są technikami, którzy mechanicznie dystrybuują informacje.
Starają się rozniecać naukową wyobraźnię i żądzę wiedzy. Dbają też o to — co jest
moim zdaniem jedną z największych zalet tego kierunku — byśmy szybko nauczyli
się odnajdywać w środowisku naukowym, dzięki czemu czytanie publikacji,
przygotowanie i wygłoszenie prezentacji wyników badań w języku angielskim nie
stanowi dla absolwenta najmniejszego problemu.
Uczelnia ma do zaoferowania bogaty system stypendialny. Studenci studiów
licencjackich mogą otrzymywać stypendium w ramach tak zwanego „kierunku
zamawianego”. Inne propozycje wiążą się z możliwością wyjazdów. Zanim jeszcze
otrzymaliśmy legitymacje, zaproponowano nam udział w rekrutacji na trzyletnie
studia zagraniczne, realizowane we współpracy z konsorcjum dziesięciu
europejskich uniwersytetów („Job Creation Oriented Biotechnology Diploma”). Z
kolei w trakcie studiów drugiego stopnia mogliśmy ubiegać się o stypendium na
wykonywanie pracy magisterskiej na Uniwersytetach w Chicago i Wirginii.
Prężnie działa również system programu „Erasmus” umożliwiający wymiany na
rok akademicki i wakacyjne praktyki. Wydział pozostawia dużą swobodę w
wyborze jednostki prowadzącej. Koledzy najczęściej wyjeżdżają do ośrodków
naukowych z Europy i Stanów Zjednoczonych, chociaż niektórzy wolą rodzime
instytuty (ja swoje pierwsze praktyki odbywałam w PAN). Dodatkowo, co roku
Park Naukowo-Technologiczny w Gdyni ogłasza rekrutację na niebanalne praktyki
dla studentów z całej Polski.
Studenci rozwijają swoje biotechnologiczne zainteresowania, prowadząc badania
w projektach koła naukowego „BIO-MED”. Aktualnie realizowane są między
innymi doświadczenia mające na celu określenie zależności między wrażliwością
komórek nowotworowych jelita grubego na witaminę D, a ekspresją genów
związanych z jej aktywnością.
Jeśli w wakacje ktoś zatęskni za studiami, może wziąć udział w cyklu wykładów
prowadzonych przez polskich i zagranicznych naukowców w trakcie corocznej
„Letniej Szkoły Biotechnologii”.
Władze obu uniwersytetów podejmują także konkretne działania w celu
zapewnienia studentom miejsca pracy. Wspólnie z Politechniką Gdańską Wydział
powołuje ośrodek badawczo-wdrożeniowy Bałtyckie Centrum Biotechnologii i
Diagnostyki Innowacyjnej, w którym prowadzone będą badania z zakresu
diagnostyki innowacyjnej, użyteczne w powiązanych z biotechnologią gałęziach
przemysłu.
Takie studia na pewno świetnie przygotowują do pracy naukowej. Wydział jest
bardzo elastyczny i ciągle się zmienia, aby doskonalić swój i tak wysoki poziom
kształcenia — w rankingu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego znajduje
się w najwyższej, pierwszej kategorii. Nasi studenci i absolwenci są mile widziani i
dobrze odbierani na uczelniach z całego świata. Nauka na MWB otwiera
perspektywy uczestniczenia w projektach nad badaniami podstawowymi biologii
nowotworów, komórek eukariotycznych i prokariotycznych, a także
poszukiwaniem nowych leków, tworzeniem nowatorskich szczepionek i systemów
diagnostycznych. Można oczywiście też próbować swoich sił jako diagnosta (po
ukończeniu kursu podyplomowego), technik kryminalistyki (po szkoleniu
policyjnym), w koncernach farmaceutycznych, czy kosmetycznych. Młody
człowiek, który ma głowę pełną pomysłów, jest odrobinę szalonym fascynatem, a
zadowolenie z tego, co robi, najzupełniej wynagradza mu skromne życie, na
pewno odnajdzie tutaj swoje miejsce.
Martyna Franczuk
Logo UMCS
źródło: UMCS
Gravity flow – krok naprzód w
dziedzinie izolacji DNA
Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym i
powszechnym, że nie zastanawiamy się nawet nad jej istnieniem.
Naukowcy z firmy A&A Biotechnology postanowili skorzystać z siły
grawitacji aby znacznie uprościć i przyspieszyć proces izolacji DNA.
Jak to działa?
Tradycyjne metody wykorzystujące różnego rodzaju złoża do izolacji kwasów
nukleinowych wymagają specjalnych urządzeń takich jak: wirówki, pompy
próżniowe lub generatory pola magnetycznego. Urządzenia te są niezbędne do
wytworzenia sił napędzających kolejne etapy izolacji. Metoda przepływu
grawitacyjnego (Gravity flow) opracowana przez A&A Biotechnology korzysta
jedynie z naturalnej siły grawitacji i zjawisk kapilarnych. Dzięki specjalnie
opracowanej membranie jonowymiennej i probówce odbierającej możliwy jest
swobodny przepływ roztworów i elucja wyizolowanego DNA.
Metoda Gravity flow.
Specjalnie opracowana membrana i probówka lub płytka odbierająca pozwala na
swobodny przepływ roztworów pod wpływem siły grawitacji. Tak zaprojektowany
układ pozwala zredukować do minimum wszelkie czynności manualne oraz
potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń. Dzięki temu metoda jest wyjątkowo
prosta, szybka i płynna.
Dodawanie i przepływ kolejnych roztworów w metodzie Gravity flow przebiega
płynnie, bez potrzeby wirowania i wymiany probówek odbierających.
Porównanie izolacji DNA metodą wirówkową oraz Gravity flow
Ilość czynności manualnych potrzebnych do przeprowadzenia izolacji metodą
grawitacyjną w porównaniu do metody wirówkowej jest znacznie mniejsza.
Gravity flow na żywo
Manualna izolacja DNA metodą Gravity flow.
Izolacja DNA metodą Gravity flow z wykorzystaniem Stacji Pipetującej
epMotion®.
Cztery powody, dla których warto izolować DNA metodą Gravity flow.
1. Wyjątkowa prostota, szybkość i płynność procedury
Po przeprowadzeniu lizy do izolacji potrzebny jest jedynie statyw i pipeta. Aż do
momentu elucji reszta czynności polega jedynie na dodawaniu kolejnych
roztworów. Jest to najprostsze i bardzo wygodne dla każdego rozwiązanie,
niezwykle pomocne do celów dydaktycznych oraz dla osób zabezpieczających
próbki poza laboratorium np.próbki środowiskowe. Wszystkie kroki izolacji, aż do
samej elucji odbywają się z wykorzystaniem jednej probówki odbierającej. To
znacznie zmniejsza ilość czynności manualnych i tym samym okazji do popełnienia
pomyłki lub kontaminacji próbek. Mniejsza ilość probówek to także mniejsza ilość
plastikowych odpadów.
2. Elastyczność
Metoda Gravity flow uniezależnia nas od planowania i oczekiwania na zajęte
urządzenia laboratoryjne. Kolejne etapy izolacji nie wymagają nadzoru, a w razie
potrzeby można robić pomiędzy nimi przerwy.
3. Większa wydajność
W porównaniu do innych metod izolacji, metoda Gravity flow pozwala na
uzyskanie do 50 % więcej czystego DNA z tej samej ilości materiału.
4. Łatwość automatyzacji
Z uwagi na wyjątkowo nieskomplikowaną procedurę i małą ilość kroków, metoda
Gravity flow jest idealna do zastosowania w wielu, nawet najprostszych modelach
urządzeń typu liquid handler, na przykład w formacie płytek 96.
Właściwy czas, żeby się przekonać
Firma A&A Biotechnology do końca roku ustala 40 % rabat na wszystkie
swoje zestawy do izolacji DNA metodą grawitacyjną. Ponadto oferujemy
darmowe zestawy demonstracyjne oraz nagrody za wypróbowanie tej
innowacyjnej metody i podzielenie się z nami swoją opinią. Więcej na
www.aabiot.com/gravity Zapraszamy!
Przechowywanie
próbek
w
biotechnologii: „jak”, „gdzie” i
„jak długo”? (III)
Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla
klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do
późniejszego wykorzystania, wreszcie- dla celów terapeutycznych. W
poprzednich częściach ( I oraz II) zostało opisane postępowanie z materiałem
biologicznym. Ostatnia część cyklu będzie koncentrowała się wokół produktów
syntetycznych używanych w biotechnologii. Syntetyczne oligo i polinukleotydy
Syntetyczne cząsteczki DNA, LNA czy PNA można potraktować tak samo jak
plazmidy (część II niniejszego opracowania). Są one dostarczane do klienta na
ogół w formie liofilizatu, który przechowuje się najczęściej po rozpuszczeniu w
odpowiedniej objętości wody lub buforu w temperaturze -20 lub <-70 stopni.
Jeżeli często używamy ich do przygotowywania reakcji- korzystajmy z mniejszych
alikwot i stężeń roboczych. Sondy i barwniki fluorescencyjne W przypadku
sond i barwników sytuacja jest zbliżona do oligonukleotydów. Bezwzględnym
warunkiem przechowywania jest ciemność, gdyż wszelkie związki absorbujące i
emitujące światło są wrażliwe na zbyt długą i silną ekspozycję. Najlepiej
przechowywać jest je w próbówkach nieprzezroczystych, lub w specjalnych
próbówkach typu amber (bursztynowych), które częściowo pochłaniają
promieniowanie świetlne nie pozbawiając nas wglądu w próbkę. Niektóre
barwniki sproszkowane lub w roztworach stabilizujących można przechowywać
nawet latami w lodówce lub w temperaturze pokojowej- wszystko zależy od
specyfiki barwnika. Taka informacja musi znaleźć się na opakowaniu. W
przypadku sond i znakowanych starterów należy przyjąć strategię taką jak z
przechowywaniem innych syntetycznych oligo, mając na uwadze to, że znaczniki
fluorescencyjne są bardziej podatne na degradację, w związku z czym
przechowujemy je w ciemności i hołdujemy zasadzie, że im mniej cykli
zamrażania-rozmrażania tym lepiej. Zamawiając znakowane oligo mierzmy siły na
zamiary- nie zamawiajmy największej możliwej skali syntezy tylko po to, by
barwnik po kilku latach się „wyświecił”, lepiej zamawiać częściej w mniejszych
ilościach. Natywne białka enzymatyczne i przeciwciała Białka są bardzo
heterogenną pod względem podatności na degradację grupą związków. Niektóre
spośród nich są odporne na działanie czynników zewnętrznych (np. niektóre
białka strukturalne), większość jednak jest uzależniona od warunków pH,
temperatury, siły jonowej, statusu RED-OX czy też obecności stabilizujących
ligandów. Dlatego oczyszczone białka należy dobrze poznać by móc stworzyć im
dogodne warunki przechowywania. Zwykle roztwory wodne niemrożone mają
trwałość do ok. miesiąca czasu, białka przechowywane w glicerolu lub glikolu w
-20°C około roku (aczkolwiek utrata aktywności nie następuje szybko, ale
stopniowo, więc pewną zdolnośc katalizy np. enzymy mogą zachować nawet
ponad 10 lat!). Mrożone w <-70°C lub liofilizowane białka często można
przechowywać latami. Z reguły liofilizaty wykazują po renaturacji mniejszą
wyjściową aktywność niż roztwory po jednym cyklu mrożenie-rozmrożenie, są
jednak od tej zasady odstępstwa. Jeżeli szukamy sposobu na przechowanie
otrzymanego właśnie przez nas latach prób białka, możemy skorzystać z gotowych
roztworów krioprotekcyjnych, zawierających stabilizatory (jak glikol, dekstrany,
glicerol, mannitol), reduktory (np. DTT), inhibitory proteaz (chelatory, PMSF,
białka). Materiały radioaktywne W kwestii preparatów znakowanych
pierwiastkami promieniotwórczymi istnieje cały szereg odrębnych przepisów,
regulujących ich przewóz, składowanie i utylizację. Każdy pracownik przed
rozpoczęciem pracy z radioizotopami musi zapoznać się z tymi
regulacjami, a niniejszy artykuł to tylko bardzo ogólna „ściąga”. W
laboratoriach naukowych najczęściej wykorzystywane są związki trytu, siarki,
fosforu i węgla, emitujące promieniowanie beta- o stosunkowo długim okresie
półtrwania (trytu i węgla liczony w latach, siarki ok. 3 miesięcy, fosforu 2
tygodnie). W pracowniach radioizotopowych laboratoriów klinicznych repertuar
związków jest o wiele większy, warto wspomnieć np. o radionuklidach chromu,
żelaza czy jodu. Miejsce przechowywania związków zawierających radioizotopy
musi być oznaczone specjalną tablicą (wzór określony odpowiednim
rozporządzeniem ministerialnym). W takim pomieszczeniu zabrania się
składowania substancji łatwopalnych, wybuchowych, wydzielających opary żrące i
powodujących korozję, a także gazów sprężonych. Źródła i odpady
promieniotwórcze przechowuje się w sposób uniemożliwiający rozprzestrzenianie
się skażeń promieniotwórczych, najczęściej w ołowianych pojemniczkach
odpowiednich do rodzaju promieniowania.Dostęp do materiałów
promieniotwórczych powinny mieć tylko osoby do tego uprawnione i
przeszkolone. Korzystając z wyznakowanych radioaktywnie substancji pamiętajmy
o okresie półtrwania: jeżeli przechowujemy je dłuższy czas, przed użyciem
przeliczmy, czy aktywność związku dalej jest wystarczająca do przeprowadzenia
eksperymentu (bardzo rzadko się o tym pamięta a czasami ma to istotne
znaczenie na powodzenie np. hodowli komórkowej w pożywce z radionuklidem).
Oczywiście w diagnostyce medycznej producent zestawu określa datę
przydatności do użycia (w przypadku jodu ok. 3 miesiące) i nie musimy kłopotać
się oznaczaniem aktywności.
Logo UMCS
źródło: UMCS
Temat przechowywania w biotechnologii jest bardzo obszerny, w codziennej pracy
możemy spotkać się z różnymi odczynnikami i materiałami które przyjdzie nam
składować przez dłuższy czas. Żeby móc zachować ich właściwości, często
musimy dobrze poznać każdą substancję. Jeżeli nie dysponujemy instrukcją
przechowywania- pytajmy znajomych w innych laboratoriach, szukajmy w
książkach i protokołach firm. Wbrew pozorom w dzisiejszych czasach producenci
odczynników zachęcają konsumentów do kupna swoich odczynników bardzo
profesjonalnymi opracowaniami na temat użytkowania tych produktów.
Piśmiennictwo: 1. Protein stability and storage. Pierce, 2005, 9. 2. Materiały
dydaktyczne z zakresu diagnostyki izotopowej (podziękowania dla kadry prof.
Rybczyńskiej!) 3. Doświadczenia własne