Cała podgrupa (A lub B) wykonująca ćwiczenie przynosi 1 jajko kurze

Pracownia biochemii
Wydział Chemii UW
Otrzymywanie i badanie hydrolizatu RNA z drożdży
Otrzymywanie hydrolizatu kwasu rybonukleinowego z drożdży (Pracujemy w rękawiczkach!)
20 g drożdży piekarskich rozmieszać w zlewce z 24 cm3 wody na jednolitą papkę. Następnie, przez
cały czas mieszając, dodać 5 cm3 40% roztworu NaOH i pozostawić na około 5-10 min. Po tym
czasie dodać, mieszając, 4 cm3 stężonego HCl a następnie lodowaty kwas octowy do pH 4-5 (około
0.25 ml). Odstawić na 5-10 min. Wytrącony osad białek odsączyć na lejku Schotta G4.
Pobrać 10 cm3 klarownego przesączu i dodać 2 cm3 6% roztworu siarczanu magnezu (jeśli nie
wytrąci się osad, dodać niewielką ilość 10% roztworu HCl). Wytrącony osad odwirować przez 10
min. przy 3-4 tys rpm. Supernatant odrzucić, a osad nukleinianu magnezu zawiesić w niewielkiej
ilości etanolu, przenieść do wytarowanej probówki eppendorfa i odwirować. Osad przemyć jeszcze
dwukrotnie etanolem a na końcu eterem. Wysuszyć i zważyć.
Przygotowanie 0.1 % roztworu hydrolizatu RNA
Odważyć 10 mg uzyskanego preparatu RNA i rozpuścić je w 10 cm3 0.1 M roztworu NaOH.
Spektrofotometryczne oznaczanie czystości preparatu RNA
Przygotowany roztwór hydrolizatu RNA (minimum 40μl) rozcieńczyć 50-krotnie i zarejestrować
widmo w zakresie 230 – 300 nm. Zanotować wartość absorpcji roztworu w maksimum (powinno
znajdować się przy długości fali 260 nm) oraz przy 280 nm.
Badanie rozpuszczalności
Odczynniki: 0.1% roztwór hydrolizatu RNA w 0.1 M NaOH, wzorcowy roztwór DNA (0.1%
roztwór w 0.1 M NaOH), 1 M HCl, 1 M NaOH, 96% etanol
Sprzęt:
4 probówki szklane, 5 pipetek plastikowych
Do 1 cm3 roztworu: hydrolizatu RNA (1) oraz wzorcowego DNA (2) dodać kroplami 1 M roztwór
HCl (około 200 μl) - obserwować zmiany. Następnie dodać taką samą objętość 1 M roztworu
NaOH i obserwować zmiany.
Do 1 cm3 roztworu: hydrolizatu RNA (1) oraz wzorcowego DNA (2) dodać stopniowo etanol (ok. 2
cm3) i obserwować zmiany.
Reakcja orcynolowa
Odczynniki: 0.1% roztwór hydrolizatu RNA w 0.1 M NaOH, wzorcowy roztwór DNA (0.1%
roztwór w 0.1 M NaOH), 0.1% roztwór rybozy, 0.1% roztwór galaktozy odczynnik
orcynolowy
Sprzęt:
5 probówek szklanych, 4 dodatkowe pipetki plastikowe, łaźnia wodna
Do pięciu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: hydrolizatu RNA (1),
wzorcowego DNA (2), rybozy (3), galaktozy (4) i wody (5). Dodać po 1 cm3 odczynnika
orcynolowego i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez ok. 15 minut. Obserwować zmianę barwy.
Reakcja z floroglucyną
Odczynniki: 0.1% roztwór hydrolizatu RNA w 0.1 M NaOH, wzorcowy roztwór DNA (0.1%
roztwór w 0.1 M NaOH), 0.1% roztwór rybozy, 0.1% roztwór galaktozy,
stęż. HCl, floroglucyna in subst.
Sprzęt:
5 probówek szklanych, 1 dodatkowa pipetka plastikowa, łopatka metalowa, łaźnia
wodna
Do pięciu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: hydrolizatu RNA (1),
wzorcowego DNA (2), rybozy (3), galaktozy (4) i wody (5). Dodać po 1 cm3 stężonego HCl i parę
kryształków floroglucyny. Ogrzewać do wrzenia i obserwować zmianę barwy.
Reakcja Dischego
Odczynniki: 0.1% roztwór hydrolizatu RNA w 0.1 M NaOH, wzorcowy roztwór DNA (0.1%
roztwór w 0.1 M NaOH), 0.1% roztwór rybozy, 0.1% roztwór 2’-deoksyrybozy,
odczynnik difenyloaminowy
Sprzęt: 5 szklanych probówek, 1 dodatkowa pipetka plastikowa, łaźnia wodna
Do pięciu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: hydrolizatu RNA (1),
wzorcowego DNA (2), rybozy (3), 2’-deoksyrybozy (4) i wody (5). Dodać po 2 cm3 odczynnika
difenyloaminowego i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Obserwować zmianę
barwy.
Reakcja z molibdenianem amonu
Odczynniki: 0.1% roztwór hydrolizatu RNA w 0.1 M NaOH, 0.1M roztwór fosforanów,
5% roztwór molibdenianu amonu, stęż. HNO3
Sprzęt: 3 szklane probówki, 1 dodatkowa pipetka plastikowa, łaźnia wodna
Do trzech probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: hydrolizatu RNA (1),
wzorcowego fosforanu (2) i wody (3). Dodać po 6 kropli stężonego HNO3, a następnie po 1 cm3
roztworu molibdenianu amonu. Ogrzać we wrzącej łaźni wodnej.
Opis ćwiczenia powinien zawierać:
1. krótkie przedstawienie procesu izolacji hydrolizatu RNA z drożdży ( w punktach: co
zrobiono i w jakim celu)
2. omówienie wykonywanych reakcji według następującego schematu:
• zasada, na której opiera się próba (+ równanie reakcji, tak gdzie jest to możliwe)
• obserwacje
• wnioski
• lub według schematu: obserwacje, wnioski, wyjaśnienie
3. oszacowanie czystości preparatu hydrolizatu RNA:
• zasada, na której opiera się metoda
• obliczenie stosunku A280/A260 (przy poprawnej preparatyce stosunek ten powinien
być ≤ 0.49)
• wnioski