andrzej k - Nowiny Lekarskie - Uniwersytet Medyczny im. Karola

Nowiny Lekarskie 2008, 77, 1, 8–11
KRZYSZTOF STRZYŻEWSKI1, MARIA PIORUŃSKA-STOLZMANN1, WACŁAW MAJEWSKI2
OCENA PEROKSYDACJI LIPIDÓW I STĘŻENIA WYBRANYCH ANTYOSKYDANTÓW
W SUROWICY PACJENTÓW
Z MIAŻDŻYCOWYM NIEDOKRWIENIEM KOŃCZYN DOLNYCH
EVALUATION OF LIPID PEROXIDATION AND CONCENTRATION OF SELECTED ANTIOXIDANTS
IN SERUM OF PATIENTS WITH ATHEROSCLEROSIS OF LOWER LIMBS
1
Zakład Chemii Ogólnej
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik Zakładu Chemii Ogólnej: dr hab. Maria Iskra
2
Klinika Chirurgii Ogólnej i Naczyń
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. Wacław Majewski
Streszczenie
Wstęp. Peroksydacja lipidów jest procesem powodującym utleniające modyfikacje w ścianie naczyń oraz w innych strukturach
zawierających lipidy. Jednym z czynników ryzyka miażdżycy jest wysokie stężenie cholesterolu związanego z liporoteinami o małej
gęstości (LDL-ch). W stanach nasilonego stresu oksydacyjnego cząsteczki LDL są modyfikowane, co przyspiesza proces atherogenezy.
Materiał i metody. W surowicy krwi pacjentów z miażdżycowym niedokrwieniem kończyn dolnych oznaczono stężenia nadtlenków
lipidowych, dialdehydu malonowego (MDA), całkowitej zdolności antyoksydacyjnej organizmu (FRAP) oraz wolnych grup –SH.
Wymienione parametry oznaczono również dla grupy kontrolnej
Wyniki. Obserwowano znamienny wzrost stężenia nadtlenków lipidowych, MDA i zdolności antyoksydacyjnej w grupie pacjentów
z niedokrwieniem kończyn dolnych w porównaniu do grupy kontrolnej.
Wnioski. Miażdżycowemu niedokrwieniu kończyn dolnych towarzyszą zmiany zdolności pro- i antyoksydacyjnej organizmu.
SŁOWA KLUCZOWE: peroksydacja lipidów, zdolność antyoksydacyjna organizmu, miażdżyca.
Summary
Introduction. Lipid peroxidation is a well known example of oxidative damage in cell membranes, and other lipid-containing structures. Low-density lipoprotein (LDL) cholesterol is an established risk factor of atherosclerosis. In the presence of oxidative stress
LDL particles can become oxidized to form ox-LDL that is particularly atherogenic.
Material and methods. In serum of patients with chronic arterial occlusion of the lower limbs, plasma malonyldialdehyde (MDA),
lipid hydroperoxides, ferric reducing antioxidant power (FRAP), -SH group concentrations, were measured. These parameters were
also measured in a control group.
Results. It was found that the concentration of MDA, lipid hydroperoxides, FRAP were significantly higher than in control group.
Conclusions. Taken together, chronic arterial occlusion of the lower limbs is associated with changes in oxidative and antioxidative
capacity of serum.
KEY WORDS: lipid peroxidation, antioxidative capacity of serum, atherosclerosis.
Wstęp
Badania ostatnich lat dostarczają dowodów na
większy, aniżeli sądzono, udział wolnych rodników
tlenowych i rodników generowanych wtórnie przez
rodniki tlenowe w tworzeniu i rozroście blaszki
miażdżycowej. Oksydacyjna teoria miażdżycy zakłada, że
modyfikacje lipoprotein, a szczególnie lipoprotein o małej
gęstości (LDL) mają zasadniczy wpływ na proces
aterogenezy [1]. LDL powstają w krążeniu z lipoprotein o
bardzo małej gęstości (VLDL), w wyniku działania lipazy
lipoproteinowej, a ich zadaniem jest dostarczanie
komórkom cholesterolu. LDL zawiera ok. 60%
całkowitego cholesterolu osocza krwi. Połowa spośród
obecnych w fosfolipidach, estrach i triacyloglicerolach
reszt kwasów tłuszczowych to reszty wielonienasyconych
kwasów tłuszczowych, które są szczególnie podatne na
peroksydację.
Utlenienie LDL prowadzi do powstawania
różnorodnych fragmentów lipidowych i białkowych
lipoprotein. Produkty peroksydacji lipidów, takie jak
dialdehyd malonowy czy 4-hydroksynonenal mogą
tworzyć związki typu zasad Shiffa, modyfikując w ten
sposób cząsteczkę lipoproteiny. Tak zmodyfikowana
cząsteczka lipoproteiny nie jest rozpoznawana przez
receptor dla LDL apolipoproteinę B/E (apoB/E)
podlegający regulacji na zasadzie sprzężenia zwrotnego,
ale przez tzw. „scavenger receptor” (SR), czego
wynikiem jest ciągły napływ obładowanych lipidami
cząsteczek lipoprotein do ściany naczyń. Główną
Ocena peroksydacji lipidów i stężenia wybranych antyoskydantów w surowicy pacjentów z miażdżycowym niedokrwieniem … 9
przyczyną uruchomienia szlaku „scavenger receptor” są
modyfikacje białkowej części LDL – apolipoproteiny B100 (apoB-100), przez produkty peroksydacji.
Pierwszym etapem tego procesu jest powstanie
utlenionej cząsteczki LDL (ox-LDL). Produkty
peroksydacji lipidów, takie jak dialdehyd malonowy czy
4-hydroksynonenal reagują z grupami aminowymi,
zwłaszcza z grupą ε-aminową lizyny, w apoB-100
obecnych w cząsteczkach LDL. Reakcje takie prowadzą
do powstania zasad Schiffa i do utraty dodatnich
ładunków zjonizowanych grup aminowych.
Blaszki miażdżycowe tworzone są w błonie
wewnętrznej naczyń krwionośnych, gdy monocyty
przekształcane są w makrofagi, które w wyniku
pochłonięcia ogromnych ilości lipidów zmieniane są w
kolejnym etapie w komórki piankowate. Komórki
piankowate powstają z makrofagów i komórek mięśni
gładkich proliferujących w miejscu tworzenia blaszki
miażdżycowej.
Dzięki nowatorskim badaniom, Goldstein i Brown
[2] ustalili rolę receptorów LDL w regulacji stężenia
cholesterolu w surowicy i wykazali, że defekt tego
receptora prowadzi do hipercholesterolemii i rozwoju
miażdżycy zarówno u ludzi, jak i wielu gatunków
zwierząt. Twórcą koncepcji zakładającej, że miażdżyca
jest przewlekłym procesem zapalnym toczącym się w
błonie wewnętrznej tętnic, wywołanym czynnikami
działającymi uszkadzająco na śródbłonek naczyń jest
Ross [59]. Teoria ta zakłada, że proces zapalny
determinuje obecność cholesterolu. Alternatywne teorie
zakładają, że dopiero modyfikacja cholesterolu
umożliwia inicjację procesu miażdżycowego [3, 4].
Celem obecnej pracy była ocena stężeń wybranych
produktów peroksydacji lipidów i całkowitej zdolności
antyoksydacyjnej w surowicy krwi pacjentów z
miażdżycowym niedokrwieniem kończyn dolnych
(MNKD).
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiły surowice pochodzące od
kobiet i mężczyzn leczonych w Klinice Chirurgii Ogólnej
i Naczyń Uniwersytetu Medycznego im. Karola
Marcinkowskiego w Poznaniu, ul. Długa oraz w Szpitalu
Wojewódzkim w Poznaniu, ul Juraszów. W grupie badanej
(wiek 44–74 lat) u 44 pacjentów stwierdzono miażdżycowe
niedokrwienie kończyn dolnych (MNKD). U wszystkich
chorych oznaczono podstawowe parametry biochemiczne.
Wszystkich pacjentów z MNKD poddano zabiegowi
operacyjnego wszycia protezy rozwidlonej aortalnobiodrowej. Krew pobierano dzień przed operacją.
Grupę kontrolną stanowiły surowice, które
przygotowano z krwi otrzymanej z Wojewódzkiej Stacji
Krwiodawstwa w Poznaniu, pobranej na czczo z żyły ramiennej
od 29 zdrowych mężczyzn, krwiodawców po uprzednim
badaniu lekarskim.
Badania uzyskały zgodę Komisji Etycznej
Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu (06.01.2005 r.).
Stężenia nadtlenków lipidowych (LOOH) oznaczono
metodą spektrofotometryczną (FOX-2) wg E. Sodergren
i wsp. [5] polegającą na utlenianiu jonów żelazawych do
żelazowych przez LOOH w środowisku kwaśnym.
Powstające jony żelaza (III) są kompleksowane przez
oranż ksylenolowy, który generuje niebiesko-purpurową
barwę. Trifenylofosfina (TPP) stosowana w tej metodzie
użyta była jako specyficzny reduktor LOOH.
Stężenie dialdehydu malonowego (MDA) mierzono
metodą H. Ohkawa i wsp. [6, 7]. Metoda wykorzystuje
reakcję MDA z kwasem tiobarbiturowym (TBA) w
środowisku kwaśnym i podwyższonej temperaturze, a
produktem jest barwny addukt MDA-TBA2 (różowy) z
maksimum absorbancji przy λ = 532 nm.
W metodzie FRAP [8], [9] (ferric reducing/antioxidant
power) antyoksydanty obecne w surowicy, w środowisku
kwaśnym, redukują kompleks Fe-tripirydylotriazyna (FeIIITPTZ) do formy FeII-TPTZ, o intensywnym niebieskim
kolorze. Zmianę absorbancji roztworu mierzy się przy
długości fali λ = 593 nm, w przedziale czasu 0–6 minut w
temperaturze pokojowej. Krzywą wzorcową wyznaczono
wykorzystując wodny roztwór witaminy E (Trolox). Udział
poszczególnych antyoksydantów w całkowitej zdolności
antyoksydacyjnej organizmu jest następujący: 60% – kwas
moczowy, 15% – kwas askorbinowy, 10% – białka i po 5%
α-tokoferol i bilirubina.
Pomiary stężenia wolnych grup -SH w surowicy
wykonano spektrofotometryczną metodą Miao-Lin Hu.
Metoda oparta jest na reakcji wolnych grup tiolowych (SH)
z kwasem 2,2-ditiobisnitrobenzoesowym (DTNB), w
wyniku której powstaje barwny produkt z maksimum
absorbancji przy długości fali λ = 412 nm. Krzywą
standardową przygotowano dla roztworu zredukowanego
glutationu (GSH) w zakresie stężeń 0–200 μg/ml.
Wyniki
Na rycinie 1. przedstawiono stężenia nadtlenków
lipidowych w surowicy krwi pacjentów z MNKD przed
operacją i w grupie kontrolnej. Najwyższe stężenie
nadtlenków lipidowych obserwowano w surowicy krwi
pacjentów z MNKD przygotowanych do operacji
wszycia protezy „rozwidlonej” aortalno-dwuudowej i
wynosiło ono 1,19 ± 0,15 μmol/l. Było znamiennie
wyższe w porównaniu do wartości obserwowanej w
grupie kontrolnej (0,60 ± 0,04 μmol/l).
Stężenia MDA w surowicach krwi badanych grup
pacjentów przedstawia rycina 2. Stężenie MDA w
surowicy krwi pacjentów z MNKD (3,94 ± 0,25 μmol/l)
było znamiennie wyższe w porównaniu do wartości w
grupie kontrolnej (2,82 ± 0,15 μmol/l).
Całkowitą zdolność antyoksydacyjną badaną jako
FRAP, w surowicy krwi pacjentów z MNKD i w grupie
kontrolnej przedstawia rycina 3. Najwyższą zdolność
antyoksydacyjną, wynoszącą 484,1 ± 20,4 μmol/l,
obserwowano u pacjentów przed zabiegiem i była
znamiennie wyższa w porównaniu do grupy kontrolnej,
wynoszącej 321,9 ± 9,8 μmol/l.
10
Krzysztof Strzyżewski i inni
Rycina 4. przedstawiająca stężenia wolnych grup –
SH w surowicy krwi pacjentów z MNKD oraz w grupie
kontrolnej nie wykazuje różnic w stężeniu badanego
parametru między grupami.
Ocena peroksydacji lipidów i stężenia wybranych antyoskydantów w surowicy pacjentów z miażdżycowym niedokrwieniem … 11
Ryc. 1. Porównanie stężeń nadtlenków lipidowych w surowicy
krwi pacjentów z miażdżycowym niedokrwieniem kończyn
dolnych oraz w grupie kontrolnej.
Fig. 1. Comparison of lipid hydroperoxide concentration in
serum of patients with atherosclerosis of lower limbs and in
control group.
Ryc. 4. Porównanie stężeń wolnych grup -SH w surowicy krwi
pacjentów z miażdżycowym niedokrwieniem kończyn dolnych
oraz w grupie kontrolnej.
Fig. 3. Comparison of –SH groups concentration in serum of
patients with atherosclerosis of lower limbs and in control
group.
Dyskusja
Ryc. 2. Porównanie stężeń MDA w surowicy krwi pacjentów z
miażdżycowym niedokrwieniem kończyn dolnych oraz w
grupie kontrolnej.
Fig. 2. Comparison of MDA concentration in serum of patients
with atherosclerosis of lower limbs and in control group.
Ryc. 3. Porównanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej
surowicy krwi pacjentów z miażdżycowym niedokrwieniem
kończyn dolnych oraz w grupie kontrolnej.
Fig. 3. Comparison of ferric reducing antioxidant power
(FRAP) concentration in serum of patients with atherosclerosis
of lower limbs and in control group.
W powstawaniu zmian miażdżycowych istotną rolę
przypisuje się wolnym rodnikom, które inicjując proces
peroksydacji lipidów zawartych w lipoproteinach i
lipidach błon biologicznych powodują zachwianie
równowagi
prooksydacyjnej
i
antyoksydacyjnej
organizmu, czemu towarzyszy stres oksydacyjny [11,
12].
Miażdżyca kończyn dolnych najczęściej występuje w
piątej dekadzie życia i później, a jednym z
sugerowanych mechanizmów odpowiedzialnych za jej
powstawanie jest proces utleniania lipidów. W
cząsteczkach LDL peroksydacji mogą ulegać zarówno
wolne, jak i zestryfikowane wielonienasycone kwasy
tłuszczowe, głównie: kwas oleinowy, linolowy i
arachidonowy [13, 14]. LDL mogą ulegać modyfikacji
in vivo również pod wpływem kontaktu z komórkami
sródbłonka,
mięśni
gładkich
i
makrofagów w błonie wewnętrznej naczyń [15, 16].
Utlenione LDL są mieszaniną wodoronadtlenków
lipidów, oksysteroli, lizofosfatydylocholiny i aldehydów.
Nasilenie stresu oksydacyjnego, czemu towarzyszy
wzrost stężenia nadtlenków lipidowych w surowicy krwi
oraz stężenia wolnych rodników i MDA w tkankach,
obserwuje się w reperfuzji. Proces ten związany jest
również
z obniżeniem aktywności enzymów antyoksydacyjnych, co
pozwala przypuszczać, że wzrost stężenia wolnych
rodników jest jedną z głównych przyczyn powikłań w
zespole niedokrwienie/reperfuzja [17, 18, 19, 20].
W pH obojętnym MDA występuje w formie anionu
enolowego i mimo niewielkiej reaktywności chemicznej
jest toksyczny, powodując uszkodzenie wielu ważnych
biologicznie molekuł. Dialdehydowi malonowemu
przypisuje się nie tylko mutagenne i aterogenne działanie,
ale również wykazano, że uszkadza on kolagen, poprzez
tworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań poprzecznych,
powodujących sztywność naczyń krwionośnych [21].
Krzysztof Strzyżewski i inni
12
Stres oksydacyjny związany jest nie tylko ze wzrostem
tworzenia wolnych rodników tlenowych, ale i aktywnością
mechanizmów obronnych. Komórki i tkanki wyposażone
są w system enzymów antyoksydacyjnych oraz szereg
niskocząsteczkowych związków, które chronią je przed
toksycznym działaniem wolnych rodników [22]. Zdolność
antyoksydacyjna organizmu nie odzwierciedla stężenia
tylko pojedynczego antyoksydantu, ale wynika ze
współdziałania szeregu związków pełniących funkcje
antyoksydacyjne.
Badania zdolności antyoksydacyjnej organizmu u
chorych z MNKD przed zabiegiem operacyjnym wszycia
protezy wykazały, że była ona wyższa niż w grupie
kontrolnej. W dotychczas opublikowanych badaniach
można napotkać na wiele rozbieżności. Gawron i wsp. [23]
obserwowali wyższą zdolność antyoksydacyjną u
pacjentów z chorobą wieńcową niż w grupie kontrolnej.
Badania prowadzone przez Lantos i wsp. [24] w surowicy
pacjentów
z nadciśnieniem tętniczym również potwierdzają te
obserwacje. Duman i wsp. [25], także obserwowali wzrost
zdolności antyoksydacyjnej u pacjentów z typem 2
cukrzycy, jednak nie był on znamienny. Wydaje się, że
wzrost zdolności antyoksydacyjnej jest mechanizmem
obronnym na wzrost stężenia produktów peroksydacji
lipidów.
Wnioski
Wzrost stężenia MDA i nadtlenków lipidowych w
surowicy krwi pacjentów z MNKD wskazuje, że
miażdżycy tętnic kończyn dolnych towarzyszy proces
peroksydacji lipidów, a w zdolności antyoksydacyjnej
szczególną
rolę
odgrywają
niskocząsteczkowe
antyoksydanty.
Piśmiennictwo
1. Chisolm G.M., Steinberg D.: The oxidative modification
hypothesis of atherosclerosis: an overview. Free Radic.
Biol. Med., 2000, 28(12), 1815-1826.
2. Goldstein J.L, Brown Bron.S.: Progress in understanding
the LDL receptor and HMG-CoA reductase, two
membrane proteins that regulate the plasma cholesterol.
J. Lipid Res., 1984, 25, 1450-1461.
3. Jon K., Tabas I.: The response-to-retention hypothesis of
early atherogenesis. Atheroscler. Thromb. Vasc. Biol.,
1995, 15, 551-561.
4. Nabab M., Berliner J.A., Watson A.D.: The yin and yang
of oxidation in development of the fatty streak.
Atheroscler. Thromb. Vasc. Biol., 1996, 16, 831-842.
5. Sodergren E., Nourooz-Zadeh J., Berglund L., Vessby
B.: Re-evaluation of the ferrous oxidation in xylenol
orange assay for the measurement of plasma lipid
hydroperoxides. J. Biochem. Biophys. Methods, 1998, 37:
137-146.
6. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K.: Assay for lipid
peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid
reaction. Anal. Biochem., 1979, 95, 351-358.
7. Yagi K.: Simple procedure for specific assay of lipid
hydroperoxides in serum or plasma. Free Radic Antioxid
Protocols, 1998, 108, 101-106.
8. Benzie I., Strain J.: Ferric reducing/antioxidant power
assay: direct measure of total antioxidant activity of
biological fluids and modified version for simultaneous
measurement of total antioxidant power and ascorbic
acid concentration. Methods Enzymol, 1999, 299, 15-27.
9. Benzie I., Strain J.: The ferric reducing ability of plasma
(FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP
assay. Anal. Biochem., 1996, 239, 70-76.
10. Hu M.-L., Measurement of protein thiol groups and
glutathione in plasma. Methods Enzymol., 1994, 233,
380–385.
11. Sies H.: Oxidative stress II. Oxidants and antioxidants.
Academic Press, London 1991.
12. Strocker R., Keany J.F.: Role of oxidative modifications
in atherosclerosis. Physiol. Res., 2004, 84, 1381-1478.
13. Criag W.Y., Paulin S.E., Palomaki G.E., Neveux L.M.,
Ritchie R.F., Ledue T.B.: Oxidation-related analytes and
lipid and lipoprotein concentrations in healthy subject.
Atheroscler. Thromb. Vasc. Biol., 1995, 15, 733-739.
14. Skoczyńska A., Andrzejak R.: Peroksydacja lipidów w
patogenezie miażdżycy. Post. Hig. Med. Dośw., 1997, 5,
515-529.
15. Aviram M., Rosenblat M.: Phospholipase A2 and
phospholipase D are involved in macrophage NADPH
oxidase-mediated oxidation of low density lipoprotein.
Isr. J. Med. Sci., 1996, 32, 749-756.
16. Skoczyńska A.: Rola lipidów w powstawaniu miażdżycy.
Post. Hig. Med. Dośw., 2005; 59, 346-357.
17. Chan P.H.: Role of oxidants in ischemic brain damadge.
Stroke, 1996, 27(6), 1124-1129.
18. Wu M.L, Tsai K.L, Wang S.N., Wu J.C., Wang B.S., Lee
Y.T.: Mechanism of hydrogen peroxide and hydroxyl
free radical – induced intracellular acidification in
cultured rat cardiac myoblasts. Circ. Res., 1996, 78(4),
564-572.
19. Xia Y., Khatchikian G., Zweier L.L.: Adenosine
deaminase inhibition prevents free radicals – mediated
injury in the postischemic heart. J. Biol. Chem., 1996,
271(17), 10096-10102.
20. Zhao B., Shen J., Li M., Li M., Wan Q., Xin W.:
Scavenging effect of chinonin on NO and oxygen free
radicals and its protective effect on the myocardium from
the injury on ischemia – reperfusion. Biochim. Biophys.
Acta, 1996, 1315(2), 131-137.
21. Del Rio D., Stewart A.J., Pellegrini N.A.: A review of
recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and
biological marker of oxidative stress. Nutr. Metab.
Cardiovasc., 2005, 15, 316-328.
22. Sies H.: Strategies of antioxidant defence. Eur. J.
Biochem., 1993, 215, 213-219.
23. Gawron A, Chrzczanowicz J, Nowak D, Nonas M,
Drygas W, Jegier A, Kostka T.: Total antioxidant
capacity of blood plasma in healthy men and in men with
coronary heart disease. Prz. Lek., 2005, 62(3), 31-34.
24. Lantos J., Roth E., Czopf L., Nemes J., Gal I.:
Monitoring of plasma total antioxidant status in different
disease. Acta Chir. Hung., 1997, 36, 188-189.
25. Duman B.S., Ozturk M., Yilmazer S., Hatemi H.: Thiols,
malonaldehyde and total antioxidant status in the turkish
patients with type 2 diabetes mellitus. Tohoku J. Exp.
Med., 2003, 201, 147-155.
Adres do korespondencji:
dr Krzysztof Strzyżewski
Ocena peroksydacji lipidów i stężenia wybranych antyoskydantów w surowicy pacjentów z miażdżycowym niedokrwieniem … 13
Katedra i Zakład Chemii i Biochemii Klinicznej
ul. Grunwaldzka 6
60-780 Poznań
14
Krzysztof Strzyżewski i inni