Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych w j

ZAŁĄCZNIK 2
Autoreferat przedstawiający opis dorobku
i osiągnięć naukowych
dr Aneta Strachecka
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie
Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt
Katedra Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej
Zakład Biologii Eksperymentalnej i Środowiskowej
Lublin 2015
1 Autoreferat – A. Strachecka
1. POSIADANE DYPLOMY, STOPNIE NAUKOWE
2006r.
2010r.
Dyplom magistra biologii specjalność biochemia; Wydział Biologii i
Nauk o Ziemi (obecnie Wydział Biologii i Biotechnologii),
Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie
Praca magisterska pt. „Analiza systemu proteolizy kwaśnej powierzchni
ciała owada społecznego – pszczoły miodnej (Apis mellifera)”
Stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biologii; Wydział
Biologii i Nauk o Ziemi (obecnie Wydział Biologii i Biotechnologii),
Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie
Praca doktorska pt. „Proteazy i inhibitory proteaz na powierzchni ciała
pszczoły miodnej (Apis mellifera) jako element odporności nieswoistej”
2. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU W
JEDNOSTKACH NAUKOWYCH
01.10.2010 - Asystent w Katedrze Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej,
30.09.2011 Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w
Lublinie
01.10.2011 – Adiunkt w Katedrze Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej,
do chwili
Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w
obecnej
Lublinie
3. WSKAŹNIKI BIBLIOMETRYCZNE
Moja praca naukowa rozpoczęła się już na studiach magisterskich w 2004 roku.
Stopień doktora nauk biologicznych uzyskałam w 2010 roku. W ciągu 11 lat mojej
działalności naukowej opublikowałam 46 (po uzyskaniu stopnia doktora - 41)
oryginalnych prac naukowych i 9 (wszystkie po uzyskaniu stopnia doktora) prac
przeglądowych. 37 z tych 55 prac (w tym 35 po uzyskaniu stopnia doktora) to prace z
Impact Factor (zsumowany IF = 18,023). W moim dorobku znajduje się także 38
komunikatów konferencyjnych, 6 artykułów popularno-naukowych i 3 recenzje książek w
czasopismach naukowych. Szczegółowy wykaz zawiera Zał. 1 - „Wykaz opublikowanych
prac naukowych lub twórczych prac zawodowych oraz informacja o osiągnięciach
dydaktycznych, współpracy naukowej i popularyzacji nauki”.
2 Autoreferat – A. Strachecka
4. PROBLEMATYKA BADAWCZA PRZED UZYSKANIEM STOPNIA
DOKTORA
Badania realizowane przed uzyskaniem stopnia doktora można podzielić na dwa
okresy; podczas studiów magisterskich (Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w
Lublinie) i podczas studiów doktoranckich (Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie).
4.1.
Okres studiów magisterskich
W czasie studiów magisterskich, od 2004 do 2006 roku, byłam członkiem i
jednocześnie prezesem Naukowego Koła Biochemików na Wydziale Biologii i Nauk o
Ziemi Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. W czasie wakacyjnych obozów
naukowych pobierałam owady z Helu oraz z Dębna, a następnie określałam aktywności
anty-entomopatogenne na powierzchni ich ciał. Wyniki zostały przedstawione na dwóch
studenckich konferencjach w Wiśle i w Kazimierzu Dolnym. Jednocześnie, nie zdając
sobie w pełni z tego jeszcze sprawy, rozpoczęłam kontynuowane do dziś badania nad
mechanizmami biochemicznej odpowiedzi organizmów owadów na presję środowiska.
Pracę magisterską pt. „Analiza systemu proteolizy kwaśnej powierzchni ciała owada
społecznego – pszczoły miodnej (Apis mellifera)” realizowałam w Zakładzie Biochemii na
Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie,
pod kierunkiem prof. dr hab. Krzysztofa Grzywnowicza uzyskując stopień magistra nauk
biologicznych w roku 2006. W ramach tych badań określiłam aktywność kwaśnych
proteaz (asparaginowych) i ich inhibitorów na kutikuli matek, robotnic i trutni A. mellifera,
stawiając hipotezę, że pełnią one dużą rolę w systemie nieswoistej odporności kutikuli.
Równocześnie uczestniczyłam w badaniach mających na celu wstępne określenie
aktywności proteaz obojętnych i zasadowych oraz ich inhibitorów na powierzchni ciała u
tych trzech kast pszczół. Moje zainteresowania zaczęły się koncentrować wokół biochemii
A. mellifera, ze szczególnym uwzględnieniem, wtedy zupełnie nie poznanego, systemu
proteolitycznego ich kutikuli.
4.2.
Okres studiów doktoranckich
Po uzyskaniu stopnia magistra nauk biologicznych, w latach 2006-2010, podjęłam i
kontynuowałam studia doktoranckie na Wydziale Biologii i Hodowli Zwierząt
Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie, gdyż tam, w należącej do tego Uniwersytetu
pasiece doświadczalnej, były szersze możliwości do prowadzenia badań na pszczołach A.
mellifera. Kontynuowałam prace nad systemem proteolitycznym kutikuli pszczół.
Moim opiekunem naukowym był prof. dr hab. Jerzy Demetraki-Paleolog. Moje
zainteresowania naukowe w latach 2006-2010 koncentrowały się na dwóch zagadnieniach:
A) Kontynuowałam, rozpoczęte podczas studiów magisterskich, badania nad aktywnością
enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów na powierzchni ciała u robotnic A. mellifera.
Związki te, opisane po raz pierwszy w pracy, której byłam współautorem, okazały się
elementem systemu oporności nieswoistej u tej pszczoły (Zał. 1, II A poz. 26). Byłam
3 Autoreferat – A. Strachecka
wówczas współpomysłodawcą określenia „the body-surface proteolytic system” pszczół.
Aktywność proteaz i ich inhibitorów, jak głosiły moje hipotezy robocze, zależy od kasty,
stadiów preimaginalnych A. mellifera, a nawet od pór roku. Następnie postawiłam pytanie,
jak zmienia się aktywność systemu proteolitycznego na kutikuli pszczół pod wpływem
zanieczyszczeń środowiska. W celu udzielenia odpowiedzi na to pytanie, pobierałam jaja,
larwy, poczwarki i imago robotnic A. mellifera z dwóch różnych środowisk: czystego
(Nowiny, k. Lublina) i zanieczyszczonego - przy drodze szybkiego ruch (S17, Lublin).
Okazało się, że silna presja środowiska spowodowana skutkami wzmożonego ruchu
ulicznego i uprzemysłowieniem jest przyczyną niszczenia proteolitycznych barier
ochronnych na powierzchni ciała pszczół, niezależnie od stadium rozwojowego i w
konsekwencji osłabienia ich odporności nieswoistej (Zał. 1, II A poz. 25). Wyniki tych
dwóch prac skłoniły mnie do poszerzenia badań: (1) o analizę systemu proteolitycznego
kutikuli w kolejnych stadiach rozwoju robotnic, z naciskiem na stadia preimaginalne w
określonych dniach rozwoju ontogenetycznego; (2) do sprawdzenia wpływu innych, tym
razem antropogenicznych czynników środowiskowych, tj. akarycydy, środowisko
bytowania [naturalne; - ul versus laboratoryjne; – klatka], na procesy proteolityczne
kutikuli robotnic; (3) w tamtym czasie, zupełnie nowymi były odkrycia z zakresu
epigenetycznej regulacji ekspresji genomu, w tym próby określenia roli mechanizmów
epigenetycznych w kształtowaniu odpowiedzi organizmu na różnorodne wpływy
środowiska. Dlatego wzięłam udział, w prowadzanym we współpracy z ośrodkami z USA,
badaniu
wpływu
niskocząsteczkowego
przełącznika
epigenetycznego
fenyloacetyloglutaminianu sodu [PG] na ekspresję genów A. mellifera wzbogacając je o
określenie wpływu PG na system proteolityczny kutikuli (poziom fizjologiczny).
Wszystkie te prace zaowocowały obroną dysertacji doktorskiej, pt. „Proteazy i inhibitory
proteaz na powierzchni ciała pszczoły miodnej (A. mellifera) jako element odporności
nieswoistej” na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej
w Lublinie i uzyskaniem stopnia naukowego doktora nauk biologicznych w zakresie
biologii (23 czerwca 2010).
Wyniki badań przedstawione w pracy doktorskiej i publikacjach Zał. 1, IIA poz. 18,
21 oraz IID poz. 2, 7 wzbogaciły wiedzę o biochemicznych aspektach odporności
nieswoistej A. mellifera o następujące, nowe treści:
- na etapie larwy 1-4 dniowej, 8-dniowej oraz poczwarki i pszczoły gniazdowej (nest bee)
aktywowane są elementy systemu proteolitycznego, które zabezpieczają te stadia przed
patogenami, co wykazałam w testach in vitro aktywności przeciwgrzybowej i
przeciwbakteryjnej. Najniższą aktywność proteolityczną obserwowałam u jajeczek,
pszczół od wygryzienia do dwu dni po wygryzieniu i u pszczół lotnych – zbieraczek
(forager bee). U larw i poczwarek większość stanowiły białka hydrofilne, a u robotnic
hydrofobowe. Białka hydrofobowe miały zarówno wyższe aktywności, jak i bardziej
hamowały rozwój grzybów i bakterii, niż białka hydrofilne. Ponadto, potwierdziłam
przewagę proteaz asparaginowych i serynowych na powierzchni ciała A. mellifera, ale
także zaobserwowałam proteazy tiolowe i metalozależne, których dotychczas na
powierzchni ciała pszczół nie opisano.
4 Autoreferat – A. Strachecka
- pospolicie stosowane chemioterapeutyki, jako nowy, antropogeniczny element
pszczelego środowiska stworzony w skutek usiłowań zapobiegania ich wymieraniu,
wywierają nadspodziewanie silny, destrukcyjny wpływ na aktywność proteolityczną
powierzchni ciała robotnic. Spostrzeżenie to wzbogaciło wiedzę o przyczynach
obserwowanego w wielu krajach spadku odporności pszczół.
- chów laboratoryjny (środowisko klatki) wpływa destabilizująco, a niekiedy i supresyjnie,
na aktywność systemu proteolitycznego na powierzchni ciała utrzymywanych w niej
pszczół. Należy brać to pod uwagę przy interpretowaniu wyników testów klatkowych
wykonywanych dla potrzeb weterynaryjnych i w doświadczeniach biologicznych.
- podanie PG w stadium larwy, zwiększało stężenie białka ogólnego zmniejszając
jednocześnie aktywność proteaz i ich inhibitorów na powierzchni ciała robotnic
powstałych z tych larw w 4 – 6 tygodniu po podaniu PG i przepoczwarzeniu. Tym samym
potwierdziłam, że PG, stosowane także w terapii antynowotworowej, jest bardzo
aktywnym,
długotrwale
działającym,
niskocząsteczkowym
przełącznikiem
epigenetycznym, a skutki jego działania (długoterminowy efekt epigenetyczny) są
wyraźnie widoczne wśród białek powierzchni ciała pszczół, które otrzymywały pokarm z
dodatkiem PG jeszcze w stadium larwy.
B) Dodatkowym cyklem badawczym, który rozpoczęłam przed i kontynuowałam po
uzyskaniu stopnia doktora, były prace związane z zależnymi od wieku zmianami
elementów morfotycznych krwi i kluczowych wskaźników biochemicznych u ptactwa
domowego, głównie kur i indyków (Zał. 1, II D, poz. 11, 12). W zakresie mojej
odpowiedzialności były badania biochemiczne. Zespoły zajmujące się apiologią i
ptactwem domowym wchodzą w skład Zakładu Biologii Eksperymentalnej i
Środowiskowej, którego jestem pracownicą, więc podjęcie takiej współpracy wyłoniło się
w sposób naturalny, dając szersze możliwości wykorzystania moich umiejętności
biochemicznych.
Ważnym aspektem tego okresu mojej działalności naukowej było poszerzenie
profilu badawczego zespołu apidologicznego Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie.
Przed moim do niego dołączeniem, zajmował się on biologią behawioralną, środowiskową
oraz genetyką i hodowlą pszczół. Nie zajmował się natomiast fizjologią i biochemią tych
owadów. Mój wkład polegał na wniesieniu metodologicznego know-how oraz wkładu
intelektualnego do planowania i prowadzenia doświadczeń z zakresu biochemicznych
aspektów biologii środowiskowej A. mellifera. W konsekwencji rozwinęłam laboratorium
umożliwiające wykonywanie analiz biochemicznych materiału pozyskanego od pszczół.
Ponadto, zmodyfikowałam metody (w tym warunki konkretnych reakcji) określania
aktywności enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów stricte dla pszczół. Można to
traktować jako element nowatorski i mój skromny wkład do poszerzenia wiedzy o
metodach analitycznych u A. mellifera. Było to możliwe nie tylko dzięki ukończonym
przeze mnie studiom o profilu biochemicznym, ale przede wszystkim dzięki
doświadczeniu jakie zdobyłam jeszcze w latach 2004-2006, podejmując pracę oraz
praktyki w akredytowanych laboratoriach analitycznych różnych branż przemysłu
(Załącznik 3) i odbyciu szeregu specjalistycznych kursów zawodowych (Załącznik 5).
5 Autoreferat – A. Strachecka
5. PROBLEMATYKA BADAWCZA PO UZYSKANIU STOPNIA DOKTORA
5.1. GŁÓWNE OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE
Prace badawcze po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych można podzielić
na dwa obszary. Pierwszy, związany z biochemicznymi mechanizmami obronnymi
organizmu A. mellifera będący głównym kierunkiem moich zainteresowań i drugi, do
którego zaliczam pozostałe prace badawcze. Pierwszy obszar badawczy, zaowocował
cyklem publikacji, które łącznie zatytułowałam: „Wzbogacenie wiedzy o
biochemicznych barierach obronnych i epigenetycznej odpowiedzi Apis mellifera na
niektóre czynniki środowiska”, przedstawionym do oceny osiągnięć naukowych zgodnie
z art. 16, ust. 2 Ustawy z dnia 18 marca 2011 r. o zmianie ustawy – Prawo o szkolnictwie
wyższym, ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w
zakresie sztuki oraz o zmianie niektórych innych ustaw (Dz. U. z 2011 r. Nr 84, poz. 455).
5.1.1. Omówienie celu naukowego i wyników prac wymienionych jako „osiągnięcie
naukowe” wraz ze wskazaniem ich ewentualnego wykorzystania
Osiągnięcie naukowe stanowi cykl sześciu oryginalnych publikacji naukowych
opublikowanych w latach 2012-2015 w czasopismach znajdujących się w bazie Journal
Citation Reports (Zał. 1, IB, poz. 1-6). Sumaryczny impact factor (zgodny z rokiem
opublikowania) tych pozycji wynosi 6,295 a sumaryczna liczba punktów MNiSW to 110.
We wszystkich sześciu publikacjach jestem autorem pierwszym i korespondencyjnym.
a) Kierunki badań realizowane w ramach osiągniecia naukowego
Na wybór kierunków badań będących przedmiotem prac w ramach „osiągnięcia
naukowego” wpływ miały następujące wydarzenia: zmapowanie genomu pszczoły A.
mellifera, co umożliwiło pełniejszą interpretację zjawisk fizjologicznych; pojawienie się
światowego problemu określanego jako wymieranie albo nagła depopulacja rodzin
pszczelich (CCD, CDS), za które odpowiedzialnością obciążano cywilizacyjne czynniki
antropogeniczne i malejącą odporność A. mellifera na presję tak zmienianego środowiska.
W naukach biomedycznych pojawiły się próby wykorzystania pszczoły miodnej jako
organizmu modelowego do badań procesów starzenia i epigenetycznych, co stworzyło
potrzebę poszerzenia wiedzy o jej biochemii.
Podstawy do podjęcia badań stworzyły wyniki przedstawione w trzech pracach
mojego współautorstwa opublikowanych po uzyskaniu stopnia doktora. W pierwszej z
nich, która częściowo zawierała wyniki pracy doktorskiej, wykazałam (Zał. 1, II A, poz.
14), że promowany w krajach zachodnich, jako mało-szkodliwy „lek naturalny”, kwas
mrówkowy używany przeciw Varroa destructor jest przyczyną niszczenia
proteolitycznych barier ochronnych na powierzchni ciała pszczół. V. destructor są
najgroźniejszymi w skali całego świata pasożytami A. mellifera, które w razie braku
skutego przeciwdziałania powodują śmierć rodziny. Wykazałam, że aktywność obronnego
systemu proteolitycznego kutikuli zmniejsza się wraz z długością działania kwasu
6 Autoreferat – A. Strachecka
mrówkowego, ale nie w sposób prosty, lecz zależnie od stadium rozwojowego pszczoły i
sub-kasty. Osłabiając system proteolityczny okrywy ciała, kwas mrówkowy ułatwia
wnikanie innych patogenów. Między innymi tworzy on środowisko sprzyjające do rozwoju
grzybów (pH kwaśne), co potwierdziły testy z entomopatogenami nieswoistymi, np.
Candida albicans, Aspergillus niger. Patogeny są ważnym elementem środowiska, a
wyścig zbrojeń patogen-gospodarz, w tym jego aspekty biochemiczne, są jednym z
kluczowych zagadnień biologii. Człowiek, zwalczając patogeny ingeruje w ten wyścig w
znaczący sposób. Dlatego w drugiej pracy (Zał. 1, IIA, poz. 12), zdecydowałam się na
zbadanie wpływu związków powszechnie używanych przeciw V. destructor na wtórne
zakażenia pszczół miodnych innymi patogenami. Te biologicznie aktywne związki stały
się pospolitym elementem środowiska wewnątrz rodziny pszczelej w związku z próbami
przeciwdziałania zjawiskom wymierania i depopulacji rodzin pszczelich (colony collapse
disorder / colony depopulation syndrom). W tym przypadku, stosowaną na całym świecie
chemioterapię, zdecydowałam się potraktować jako specyficzny przejaw antropopresji.
Wykazałam, że u pszczół chemioterapia niszczy bariery obronne organizmu i sprzyja
zakażeniom; grzybami w przypadku kwasów organicznych oraz bakteriami w przypadku
amitrazu
{N,N'-(metyloiminodimetylideno)bis-2,4-ksylidyna
/
N,N-bis[(2,4dimetylofenylo)iminometylo] metyloamin}. Dodatkowo, w trzeciej pracy (Zał. 1, IIA poz.
13) udowodniłam, że wzrastająca aktywność metaloproteaz na powierzchni ciała pszczół
jest wskaźnikiem rosnącego zanieczyszczenia środowiska.
Wyniki tych prac skłoniły mnie do postawienia następujących pytań, na które próbowałam
odpowiedzieć w pracach określonych mianem osiągniecia naukowego:
- jakie inne, poza systemem proteolitycznym związki, znajdują się na powierzchni ciała
pszczół miodnych i czy ich poziom jest stały, czy zależy od takich czynników jak wiek
albo przynależność do grupy genetycznej (podgatunek/rasa)?
- czy antybiotyki działają w podobny sposób na organizmy pszczół jak akarycydy?
- jak, w odróżnieniu od związków działających supresyjnie/inhibująco, związki uważane
za biostymulatory będą wpływać na biochemiczne mechanizmy obronne i wskaźniki
fizjologiczne organizmów pszczół miodnych?
- co dzieje się wewnątrz organizmu pszczoły po podaniu niektórych biostymulatorów? Jak
zmienia się aktywność systemów odpowiedzialnych za biochemiczną odpowiedź i
biochemiczne mechanizmy obronne organizmu pszczół? Czy odpowiedź organizmu owada
jest porównywalna do lepiej poznanej odpowiedzi organizmu ssaka?
- czy biostymulatory, podobnie do związków szkodliwych, mogą wpłynąć na mechanizmy
wyciszania genów w drodze metylacji DNA u A. mellifera?
- skoro poziom globalnej metylacji DNA zmienia się w odpowiedzi na bodźce
środowiskowe a rodzina pszczela jest układem eusocjalnym, to jak zmienia się poziom
globalnej metylacji DNA u różnych stadiów preimaginalnych matek, trutni i robotnic A.
mellifera?
Postawienie tych pytań i chęć udzielenia na nie odpowiedzi doprowadziły do
sformułowania konkretnych zagadnień badawczych.
7 Autoreferat – A. Strachecka
b) Zagadnienia rozpatrywane w ramach „osiągnięcia naukowego”
1) Zdecydowałam się poszerzyć i dalej rozwijać prace nad związkami na kutikuli robotnic
A. mellifera. Poza dotychczasowymi badanymi (proteoliza), zainteresował mnie poziom
innych związków na powierzchni ciała robotnic, np. estrów, węglowodorów itp. Oprócz
systemu proteolitycznego mogą one stanowić składniki biochemicznego systemu
obronnego pszczelich organizmów.
2) Szczególną uwagę zwróciłam także na zmiany stężeń białek na kutikuli pod wpływem
antybiotyku.
3) Skoro czynniki antropogeniczne powodują spadek odporności pszczół miodnych, to w
takiej sytuacji lepiej jest stymulować własne bariery obronne organizmu niż leczyć
choroby wywołane ich osłabieniem. Nauki biomedyczne także zwracają się w stronę
biostymulatorów, szczególnie pochodzenia naturalnego. Dlatego zdecydowałam się na
rozpoczęcie zupełnie nowych prac nad fizjologicznymi skutkami podania substancji,
które działając protekcyjnie lub biostymulująco, mogą zwiększać biochemiczne bariery
obronne organizmu pszczół i tym samym przeciwdziałać destrukcyjnej presji
środowiskowej.
4) Postanowiłam wzbogacić o nowe treści wiedzę z zakresu fizjologii owadów, a w
szczególności o mechanizmach kształtowania ich odpowiedzi biochemicznej na różne
bodźce środowiskowe. Dlatego rozszerzyłam znacznie zakres moich prac na badania
kluczowych systemów biochemicznych związanych z odpornością/opornością i
procesami starzenia (np. system antyoksydacyjny), tym razem jednak nie tylko na
powierzchni ciała, ale przede wszystkim w hemolimfie pszczół. Badania hemolimfy
należy traktować jako zupełnie nowy (po uzyskaniu stopnia doktora) element moich
działań.
5) Interpretowanie wyników biochemicznych poszerzyłam dodatkowo o analizy ogólnej
metylacji pszczelego genomu, gdyż zmiany jej poziomu są uważane za jeden z
mechanizmów odpowiedzi organizmu na presję środowiskową.
c) W jakim zakresie najważniejsze wyniki poszczególnych prac wymienionych
jako „osiągnięcie naukowe” wzbogaciły wiedzę z zakresu fizjologii / biochemii
pszczoły miodnej?
Zał. 1, IB, poz. 5 - W kutikuli pszczół, jako pierwszej linii obronnej organizmu, zachodzi
wiele procesów biochemicznych, np. melanizacja, sklerotyzacja, chitynizacja, które
związane są z reakcjami zachodzącymi w hemolimfie. W większości przypadków
nośnikiem związków pomiędzy hemolimfą a kutikulą są lipoforyny związane z
węglowodorami. Na kutikuli znajdują się białka (w tym, przebadane i opisane przez mnie,
proteazy i inhibitory proteaz), lipidy, węglowodory, estry i fenole, które pełnią różne
funkcje, od feromonów aż po ochronę przed niekorzystnymi czynnikami. Autorzy
większości prac koncentrowali się na określeniu jednej grupy związków na kutikuli
pszczół, np. tylko na alkanach. Dlatego wzbogacającym istniejącą wiedzę było opisanie
procentowego udziału poszczególnych grup związków (line alkanes, branched alkanes,
methyl alkanes, alkenes, esters, phenols) w kontekście wpływów środowiskowych i
genetycznych. Co więcej, związki te badałam w dwu różnych grupach genetycznych na
8 Autoreferat – A. Strachecka
kutikulach robotnic 1-dniowych, potraktowanych tutaj jako osobniki bardzo młode, które
nie miały styczności ze środowiskiem zewnętrznym (poza-ulowym), oraz robotnic lotnych,
potraktowanych jako osobniki fizjologicznie stare, mające kontakt ze środowiskiem pozaulowym. Okazało się, że robotnice 1-dniowe, niezależnie od grupy genetycznej, miały
więcej alkenów w porównaniu z robotnicami lotnymi. Może to być jeden ze wskaźników
odpowiedzi organizmu na presję środowiskową. Wykazałam, że na kutikuli pszczół
znajduje się 17 typów alkanów (C17-C33), 13 alkenów (C21-C33), 21 estrów (C12-C32) i
fenole (C14). Ponadto, wg mojej wiedzy, jest to jedyna praca, która wykazuje, że pszczoły
zlokalizowane w tej samej pasiece, ale należące do różnych grup genetycznych
(podgatunek/rasa syntetyczna), różnią się poziomem i aktywnością związków na
powierzchni ciała (białka, estry, węglowodory, fenole). Przy okazji wykazałam, że
związkiem, który w przyszłości może być traktowany jako marker różnicujący linie
genetyczne czyste jest alken C33, który występuje tylko u robotnic kaukaskich. Moje
badania nad zmiennością związków na powierzchni ciała pszczół miodnych zasugerowały
mechanizm powodujący, że kutikule robotnic z różnych grup genetycznych mogą być w
różnym stopniu podatne na zakażenia patogenami. Koresponduje to z obserwacjami
terenowymi, dokonywanymi podczas powszechnego dziś transferu pszczół na nowe
terytoria, wskazującymi np. na różną podatność różnych podgatunków A. mellifera na
grzybice. Spostrzeżenia o genetycznej zmienności aktywności systemu proteolitycznego
kutikuli w odpowiedzi na presję środowiska, wnoszą nowe treści do wiedzy o roli
proteolizy powierzchniowej, jako nieswoistej bariery ochronnej. Jest to ważny przyczynek
do zrozumienia ewolucji systemów odporności pszczół miodnych i cenna wskazówka dla
działań hodowlanych u A. mellifera.
Rozwijając ww. badania wniosłam skromny wkład w rozwój metod analitycznych. Aby
pokazać spektrum różnych grup związków na kutikuli żywych pszczół opracowałam
metodę odpowiedniego ich zabezpieczania, tak aby nie naruszyć sondy chromatografu oraz
warunków niezbędnych do zobrazowania widm związków za pomocą chromatografii
gazowej ze spektrometrem mas GCQ. Metoda polega na umieszczeniu pszczół w fiolce z
siateczkowym, nie wykazujący widma ogranicznikiem, nad którym poprzez nakrętkę
wkłada się sondę chromatografu.
Zał. 1, IB, poz. 6 - Kluczowym dla medycyny jest pozyskiwanie nowych, skutecznych
antybiotyków, a poszerzanie wiedzy o ubocznych skutkach ich podawania jest ważne dla
nauk biomedycznych i weterynaryjnych. W kontekście tych skutków oraz powszechności
stosowania, antybiotyki mogą być traktowane jako wyjątkowo aktywny, antropogeniczny
czynnik środowiskowy. Takim szkodliwym, lecz użytecznym w medycynie antybiotykiem
jest amfoterycyna-B. Amfoterycyna-B jest organicznym związkiem chemicznym,
wytwarzanym przez bakterie z rodzaju Streptomyces. Zawiera pierścień makrocykliczny
zbudowany z fragmentu polienowego oraz polihydroksylowego, co umożliwia walkę z
zakażeniami grzybowymi, głównie przy AIDS i w transplantologii. Lek działa poprzez
interakcję z ergosterolami błon komórek gospodarza. Efektem jest zaburzenie integralności
błony komórkowej, co powoduje wypływ jonów potasowych, oraz innych składników
wewnątrzkomórkowych, oraz napływ składników zewnątrzkomórkowych, co skutkuje lizą
9 Autoreferat – A. Strachecka
komórki. Poza tym, u ssaków, amfoterycyna-B powoduje wzrost wydzielania cytokin, oraz
pobudza makrofagi do wytwarzania wolnych rodników. Skutkiem ubocznym jest
tworzenie przez nią agregatów, które odkładają się w tkankach miękkich i powodują wiele
zaburzeń. Amfoterycyna-B, przed przystąpieniem Polski do Unii Europejskiej (Dyrektywa
UE nr 2377/90), była wykorzystywana w pasiekach do zwalczania grzybicy
otorbielakowej i Nosema spp. Zważywszy na globalny problem z mikozami u ludzi i
pszczół oraz że w niektórych przypadkach pszczoły miodne są traktowane jako organizmy
modelowe, sprawdziłam działanie amfoterycyny-B na długość życia, poziom globalnej
metylacji DNA, stężenie białek na powierzchni ciała i tworzenie agregatów w ciele
robotnic A. mellifera. Wykazałam, że amfoterycyna-B skraca życie pszczół, jednocześnie
tworząc agregaty w jelicie grubym robotnic, podobnie jak to się dzieje w wątrobie
kręgowców. Nagromadzenie takich złogów jest bardzo szkodliwe dla organizmu i może
przyspieszać procesy starzenia. Bardzo niskie wartości poziomu metylacji genomu u
pszczół, którym podawano amfoterycyne-B wskazują, że amfoterycyna-B destabilizuje
układ metylowania genów, najprawdopodobniej poprzez zachwianie równowagi pomiędzy
metylacją / demetylacją aktywnych genów i junk DNA. Amfoterycyna powodowała też
rozregulowanie biochemicznych barier ochronnych na powierzchni ciała pszczół, na co
mogą wskazywać wysokie wartości stężeń białek. Wszystkie te wyniki istotnie wzbogacają
wiedzę o ubocznych, biologicznych skutkach pobierania antybiotyków przez organizm,
wskazując nie tylko na ich toksyczność/szkodliwość, ale także na powodowanie
niekorzystnych zmian w epigenetycznym systemie regulacji ekspresji genów. Novum tej
pracy jest również opracowanie techniki umożliwiającej wizualizację amfoterycyny w
odwłoku żywej pszczoły z zastosowaniem systemu Faxitron MX-20. Dotychczasowe
metody umożliwiały taką wizualizację dopiero po uśmierceniu owada. Metoda ta polega na
krótkim uśpieniu owada i prześwietleniu go wiązką promieni (X-ray). Dokładny opis tej
metody nie jest przedstawiony w omawianej pracy, gdyż będzie ona przedmiotem
przygotowywanego wniosku patentowego. Ponadto, byłam współ-pomysłodawcą metody
umożliwiającej wizualizację żywych (bez zniekształceń) tkanek, układów (w tym
przypadku przewodu pokarmowego), w której natychmiast po dekapitacji odwłoka
stosowano techniki podtrzymujące życie i normalne funkcjonowanie narządów/tkanek
(wykorzystywane również w transplantologii u ssaków), a następnie wykonywano zdjęcia,
pomiary itp. Metodę tą z powodzeniem zastosowałam w praktyce. Metoda ta również
będzie przedmiotem przygotowywanego wniosku patentowego. Niniejszych metod nie
omawiam szczegółowiej w autoreferacie ze względu na procedury patentowe. Uważam je
za mój istotny wkład do rozwoju metod analitycznych związanych z fizjologią pszczół.
Zał. 1, IB, poz. 1, 3 i 4 - W warunkach szkodliwej, obniżającej odporność, presji
środowiska ważną rolę odgrywają biostymulatory, a szczególnie poznanie mechanizmów
ich działania na poziomie biochemicznym. Do swoich badań wybrałam kofeinę, koenzym
Q10 i kurkuminę, które działają protekcyjnie i biostymulująco na ssaki. Kofeina jest
alkaloidem purynowym, który działa głównie jako antagonista receptorów adenozynowych
i przez to jest najbardziej popularnie stosowaną substancją o działaniu psychoaktywnym.
Kofeina stymuluje działanie ośrodkowego układu nerwowego oraz zwiększa metabolizm i
10 Autoreferat – A. Strachecka
jako taka jest używana zarówno w celach konsumpcyjnych oraz leczniczych. Koenzym
Q10 (ubichinon) jest chinonem, prowitaminą rozpuszczalną w lipidach, występującą
naturalnie w mitochondriach. Jest odpowiedzialny za przenoszenie elektronów w łańcuchu
oddechowym i tym samym uczestniczy w wytwarzaniu ATP. Koenzym Q10 jest
suplementowany głównie przy kardiomiopatiach, chorobach neurodegeneracyjnych i
związanych z deficytem CoQ10. Z kolei kurkumina jest fenolem, immunostymulantem i
antyoksydantem o szerokich właściwościach terapeutycznych, antynowotworowych i antymikrobiologicznych. Każdy z tych związków ma udowodnione działanie stymulujące na
organizm człowieka i od dawna były one wykorzystywane w medycynie ludowej do
zwalczania wielu chorób. Ponieważ, jak wcześniej wspomniałam, dużym,
ogólnoświatowym problemem jest obniżanie się odporności pszczół, postanowiłam
sprawdzić, jaki wpływ mają te substancje, podawane per os, na te charakterystyki
biochemiczne hemolimfy pszczół, które są powiązane z odpornością, opornością i
procesami starzenia. Postawiłam hipotezy, że 1) biostymulatory wpływają na mechanizmy
biochemicznej obronności/odporności organizmu pszczół miodnych, i tym samym
ograniczają rozwój patogenów, na przykładzie Nosema spp.; 2) biostymulatory wydłużają
życie pszczół; 3) biostymulatory wpływają na mechanizmy epigenetyczne u pszczół,
szczególnie na poziom globalnej metylacji DNA.
Badając mechanizmy oporności nieswoistej na kutikuli pszczół zaczęłam się
zastanawiać jak funkcjonuje system proteolityczny wewnątrz organizmu, np. w
hemolimfie pszczół. Czy jego aktywność, tak jak na powierzchni ciała, zmienia się także
wraz z wiekiem robotnic i pod wpływem czynników środowiskowych, np.
biostymulatorów. W literaturze przedstawiono działanie proteaz i ich inhibitorów na
aktywowanie/inhibowanie wielu procesów metabolicznych, np. aktywowanie zymogenów,
uwalnianie hormonów i fizjologicznie aktywnych białek, itp. Jednak literatura dotycząca
pszczół koncertowała się głównie na procesach zachodzących w przewodzie
pokarmowym, jadzie i relacjach dotyczących pasożyt-gospodarz (na przykładzie V.
destructor – pszczoły). Inhibitory proteaz serynowych oraz elementy układu
antyoksydacyjnego stymulują aktywowanie kaskady fenolooksydazy, która uczestniczy
przede wszystkim w procesach odpornościowych i morfogenetycznych. Ważne, że system
proteolityczny wspomaga działanie systemu antyoksydacyjnego, unieczynniającego wolne
rodniki. U ssaków, w wyniku procesów antyoksydacyjnych gromadzą się oksydacyjnie
uszkodzone białka tworzące bezużyteczne agregaty w komórkach. Enzymy proteolityczne
rozpoznają i degradują te uszkodzone białka, przez co zabezpieczają przed tworzeniem i
akumulacją proteinowych agregatów, łagodząc skutki stresu oksydacyjnego. Założyłam, że
podobne mechanizmy zachodzą w organizmach pszczół, i systemy proteolityczny i
antyoksydacyjny w ich hemolimfie współdziałają ze sobą. W przemianach białek w
organizmie uczestniczą biomarkery, tj. ALT, AST, ALP. ALT katalizuje odwracalną
reakcję przenoszenia grupy γ-aminowej L-alaniny na α-ketoglutaran z wytworzeniem
kwasu pirogronowego i L-glutaminianu. AST ułatwia przemianę asparaginianu i αketoglutaranu do szczawiooctanu i glutaminianu. ALP uczestniczy w katalizowaniu
defosforylacji różnych estrów fosforanowych, nukleotydów i białek. Enzymy te pośrednio
lub/i bezpośrednio uczestniczą w przemianach podczas syntezy ATP, przemianach
11 Autoreferat – A. Strachecka
węglowodanów i białek, a ponadto znane są jako markery różnych stanów fizjologicznych
i patologicznych u ssaków. W tamtym czasie była znana tylko jedna praca (Sapcaliu, A.,
Pavel, C., Savu, V., Căuia, E., Matei, M. and Rădoi, I. 2010. Biochemical and cytological investigations on
haemolymph of Apis mellifera carpathica bee in stressful conditions. Bulletin UASVM Animal Science and
Biotechnologies 67: 313-320), w której przedstawiono zmiany tych enzymów pod wpływem
czynnika stresogennego u pszczół. W związku z tym założyłam, że biomarkery są także
elementem systemu biochemicznej obrony organizmu pszczół i współdziałają z systemem
proteolitycznym i antyoksydacyjnym. Należy tutaj wspomnieć, iż w dotychczasowych
pracach z zakresu apidologii nie znalazłam próby połączenia poszczególnych tych
systemów w funkcjonalną całość i łącznego zbadania współzależności pomiędzy nimi.
Moje badania obrazujące aktywności/stężenia ALT, AST, ALP oraz systemów
proteolitycznego i antyoksydacyjnego są więc pierwszym etapem, który w przyszłości
umożliwi poznanie modelu funkcjonowania pełnego mechanizmu obrony biochemicznej
A. mellifera w połączeniu z innymi białkami, hormonami, itp.
Z moich badań wynika, iż kofeina (Zał. 1, I B, poz. 3), koenzym Q10 (Zał. 1, I B,
poz. 4) i kurkumina (Zał. 1, IB, poz. 1) wydłużają życie A. mellifera i ograniczają rozwój
Nosema spp. potraktowanej tu jako powszechny, specyficzny entomopatogen (grzyb)
wskaźnikowy. Wykazałam także, że kofeina, koenzym Q10 i kurkumina zwiększają
aktywność pszczelego systemu antyoksydacyjnego i proteolitycznego oraz
stężenie/aktywność biomarkerów enzymatycznych w nieoczekiwanie wysokim stopniu.
Cennym i poszerzającym wiedzę o fizjologii owadów spostrzeżeniem było stwierdzenie
„odwrotnych” mechanizmów aktywowania biomarkerów enzymatycznych (tj. AST, ALT,
ALP) u pszczół w porównaniu do ludzi. Pojawienie się czynnika chorobotwórczego u
człowieka powoduje wzrost aktywności tych biomarkerów, natomiast u pszczół jej spadek
(w tym przypadku model mechanizmu czeka na opracowanie). Z kolei kofeina, koenzym
Q10 i kurkumina obniżają aktywność AST, ALT, ALP u ludzi, a u pszczół ją podwyższają.
Wiedza o funkcjonowaniu tych mechanizmów właśnie w taki sposób, jest ważna podczas
interpretowania wyników doświadczeń na A. mellifera, ostatnio coraz częściej traktowanej
jako organizm modelowy w epigenetyce i gerontologii. Ponadto zaobserwowałam, że u
robotnic A. mellifera podobnie jak u ludzi, kurkumina i kofeina powodują obniżenie
poziomu globalnej metylacji DNA (Zał. 1, I B, poz. 1 i 3). Spostrzeżenie to, wnosząc nowe
treści do wiedzy o fizjologii procesów starzenia, jest cenne w kontekście porównywania
biochemicznych mechanizmów zmian geriatrycznych człowieka i pszczół miodnych.
Prowadząc wszystkie ww. badania wniosłam także swój skromny wkład w
doskonalenie metod analitycznych związanych z biochemią i fizjologią pszczół: 1)
zmodyfikowałam metodę pobierania hemolimfy od pszczół (przedstawiona w publikacjach
Zał. 1, IB, poz. 3 i 4). Ta zmodyfikowana metoda polega na pobieraniu hemolimfy do
schłodzonych kapilar typu „end to end” (bez antykoagulantu), których końce zamknięte są
0,6% NaCl (dla owadów). Takie kapilary umieszcza się w sterylnych probówkach typu
Eppendorf ze schłodzonym 0,6% NaCl, a następnie zamraża się je. Metoda ta umożliwia
transport próbek hemolimfy nawet na duże odległości, bez obawy ich utlenienia; 2)
zmodyfikowałam metody określania aktywności i stężeń elementów systemu
antyoksydacyjnego, proteolitycznego i markerów biochemicznych stricte do badań na
pszczołach; z małą ilością materiału biologicznego.
12 Autoreferat – A. Strachecka
Zał. 1, IB, poz. 2 – Prace przedstawione w Zał. 1, I B, poz. 1 i 3 oraz Zał. 1, IIA, poz. 8 i 21
były punktem wyjścia do pracy Zał. 1, IB, poz. 2. Skoro poziom metylacji DNA zmienia
się w odpowiedzi na bodźce środowiska, a rodzina pszczela jest superorganizmem o
strukturze kastowej, zaczęłam się zastanawiać nad wpływem diety i warunków rozwoju w
okresie preimaginalnym pszczół na poziom globalnej metylacji DNA u poszczególnych
kast płciowych. W literaturze jest przedstawiony epigenetyczny sposób regulacji genów u
robotnic i matek, i tylko w 3 i 4 dniu rozwoju, jako kluczowym okresie różnicującym
samice na płodne matki lub niepłodne robotnice. Szczególną uwagę zwracano ponadto na
wyciszanie genów w mózgu dorosłych matek i robotnic, pomijając inne tkanki. Moimi
badaniami uzupełniłam informacje o zmiany w poziomach globalnej metylacji DNA w 3 i
4 dniu rozwoju (larwy) każdej z trzech kast, również u dotąd nie badanych trutni. Novum
było określenie poziomu 5-metylocytozyny w DNA u przedpoczwarek, poczwarek i
świeżo wygryzionych matek, trutni i robotnic A. mellifera. Zupełnym zaskoczeniem okazał
się bardzo wysoki poziom 5-metylocytozyny u przedpoczwarek i poczwarek matek w
porównaniu z tymi samymi stadiami trutni i robotnic. Wytycza to kolejne kierunki badań,
w których powinno być wyjaśnione dlaczego świeżo wygryzione matki mają wyższy
globalny poziom metylacji DNA niż trutnie i robotnice. Wyniki moich badań sugerują, że
biorąc pod uwagę podobieństwa zmian epigenetycznych obserwowanych podczas
ontogenezy robotnic i trutni, robotnice nie koniecznie są ewolucyjnie starsze od matek, a
tak się powszechnie uważa. Wyjaśnienie tej kontrowersji może być jednym z kroków
umożliwiających lepsze zrozumienie ewolucji układów eusocjalnych.
d) Podsumowanie „głównego osiągnięcia naukowego”
Przedstawiony powyżej cykl publikacji, omawiany jako „główne osiągnięcie
naukowe” wniósł do nauk biologicznych następujące treści:
- określiłam procentowy udział poszczególnych grup związków (line alkanes, branched
alkanes, methyl alkanes, alkenes, esters, phenols) na kutikuli robotnic z różnych linii
genetycznych i wykazałam, że związkiem różnicującym te linie jest alken C33.
Wykazałam, że aktywność systemu proteolitycznego kutikuli zależy nie tylko od wpływu
środowiska, ale także od rodzaju grupy genetycznej i wieku pszczół miodnych. Wnosi to
nowe treści do wiedzy o roli proteolizy powierzchniowej, jako nieswoistej barierze
ochronnej. Jest to ważny przyczynek do zrozumienia ewolucji systemów biochemicznej
obrony pszczół, jako elementu ich odporności nieswoistej i cenna wskazówka dla działań
hodowlanych u A. mellifera;
- potwierdziłam, że czynniki antropogeniczne wpływają destrukcyjnie na organizm
pszczoły. Wykazałam, że amfoterycyna-B skraca życie pszczół, jednocześnie tworząc
agregaty w jelicie grubym robotnic, obniża poziom metylacji genomu i podwyższa stężenie
białek. Wyniki te wzbogacają wiedzę o ubocznych skutkach pobierania antybiotyków,
wskazując nie tylko na ich toksyczność/szkodliwość, ale co ważniejsze, także na
powodowanie niekorzystnych zmian w epigenetycznym systemie regulacji ekspresji
genów;
- wykazałam, że ważnymi, biochemicznymi elementami pszczelej odporności w
hemolimfie są: system proteolityczny i antyoksydacyjny oraz biomarkery. Stwierdziłam,
13 Autoreferat – A. Strachecka
że powinny być one analizowane razem aby dać pełniejszy obraz przemian
metabolicznych zachodzących w organizmie tych owadów pod wpływem różnych
bodźców środowiskowych;
- wykryłam istnienie „odwrotnych” mechanizmów aktywowania takich biomarkerów
enzymatycznych, jak AST, ALT, ALP u pszczół w porównaniu do ludzi. Wiedza o
funkcjonowaniu tych mechanizmów właśnie w taki sposób, jest ważna podczas
interpretowania wyników doświadczeń na A. mellifera, ostatnio coraz częściej traktowanej
jako organizm modelowy w epigenetyce i gerontologii;
- wykazałam, że biostymulatory tj. kofeina, koenzym Q10 i kurkumina aktywują
biochemiczne mechanizmy obrony organizmu poprzez zwiększenie aktywności systemu
antyoksydacyjnego i proteolitycznego oraz zmiany poziomu/aktywności biomarkerów
enzymatycznych. Wpływają też one na mechanizmy odpowiedzialne za regulacje
epigenetyczne. Te wszystkie zmiany wydłużają życie pszczół. Stosowanie tych
biostymulatorów może także ograniczać rozwój patogenów, co wykazałam na przykładzie,
zagrażającego światowej populacji pszczół miodnych, grzyba Nosema spp. Wszystko to
wnosi nowe treści do wiedzy o fizjologii owadów, szczególnie A. mellifera i ich procesach
starzenia. Dlatego wiedza ta jest cenna w kontekście porównywania biochemicznych
mechanizmów zmian geriatrycznych człowieka i pszczół miodnych. Ponadto, są to istotne
informacje dla pszczelarzy praktyków, którzy w przyszłości poprzez stosowanie
biostymulatorów, będą mogli wpłynąć na wzmocnienie biochemicznych mechanizmów
pszczelej odporności nieswoistej;
- poszerzyłam wiedzę z zakresu procesów epigenetycznych o opisanie zmian w poziomach
globalnej metylacji DNA w 3 i 4 dniu rozwoju (larwy) u wszystkich trzech kastach
pszczół, szczególnie trutni. Novum moich badań było określenie poziomu 5metylocytozyny w DNA u przedpoczwarek, poczwarek i świeżo wygryzionych matek,
trutni i robotnic A. mellifera.
Moje badania wymagały rozwinięcia lub udoskonalenia metod analitycznych. Za
twórczy wkład do metodyki badań entomologicznych uważam:
- opracowanie nowych metod: 1) przyżyciowej wizualizacji związków (na przykładzie
amfoterycyny-B) za pomocą systemu Faxitron MX-20; 2) wizualizacji żywych (bez
zniekształceń) tkanek, układów z zastosowaniem technik podtrzymujących ich życie i
normalne funkcjonowanie; 3) odpowiedniego przygotowywania żywych pszczół do
chromatografii gazowej ze spektrometrem mas GCQ;
- zmodyfikowanie metod: 1) pobierania hemolimfy; 2) określania aktywności i stężeń
elementów systemu antyoksydacyjnego, proteolitycznego i biomarkerów biochemicznych
stricte do badań na pszczołach; z małą ilością materiału biologicznego;
Chcę jednocześnie dodać, że rozszerzenie profilu badawczego zespołu, do którego
dołączyłam, o mechanizmy biochemicznej/fizjologicznej odpowiedzi owada na presję
środowiska, modyfikacja metod pobierania, przechowywania materiału i jego analizowania
pod względem biochemicznym, wraz z ukończonymi kursami i szkoleniami (Załącznik 5)
okazały się pomocne podczas tworzenia i rozwijania Zakładu Biologii Eksperymentalnej i
14 Autoreferat – A. Strachecka
Środowiskowej. Stanowi to mój skromny wkład organizacyjno-naukowy w rozwój
struktury Katedry i Wydziału, gdzie pracuję.
5.2. DODATKOWE OSIĄGNIĘCIA NAUKOWE
W dodatkowych badaniach, nie zakwalifikowanych do głównego osiągniecia
naukowego, ale również związanych z mechanizmami biochemicznej odporności i
fizjologią pszczół oraz ich pasożytów, zajmowałam się:
A) Genetyczną i biochemiczną charakterystyką roztoczy Varroa destructor opornych i
wrażliwych na tau-fluwalinat (Zał. 1, II A, poz. 1, 11, 17). Zadanie badawcze realizowane
przeze mnie było częścią projektu badawczego N N311 632138, którego byłam
wykonawcą. Omówię teraz zagadnienia, którymi osobiście zajmowałam się podczas
realizacji tego projektu (łącznie z projektowaniem protokołów doświadczalnych) i
najważniejsze wyniki:
- Wykazałam, że samice V. destructor z grupy opornej na tau-fluvalinat miały małe
stężenia białek na powierzchni swoich pancerzy i jednocześnie największe aktywności
proteaz asparaginowych w pH 3.4, serynowych w pH 7.0 i w pH 12.2 (Zał. 1, IIA, poz. 11).
Stwierdziłam na powierzchni pancerzy roztoczy opornych występowanie dodatkowych
proteaz o masach 116 i 120 kDa oraz inhibitorów proteaz o 42 kDa. Najprawdopodobniej,
jest to jedna z form ochrony ich pancerzy przed akarycydami.
- Samice oporne na tau-fluvalinat charakteryzowały się niskim poziomem globalnej
metylacji DNA w porównaniu z samicami z grupy kontrolnej oraz wrażliwej. Wykrycie tej
prawidłowości stwarza podstawę podania epigenetycznych przyczyn powstawania
oporności u V. destructor. Jest to novum pracy Zał. 1, II A, poz. 1, które wskazuje oprócz
znanych już 3 mechanizmów biochemiczno-genetycznych na czwarty nowy, z którego
wynika że akarycydy wpływają de novo na zaprogramowanie metylacji DNA podczas
rozwoju roztoczy. Informacje te wnoszą nowe treści do wiedzy o nabywaniu oporności na
chemioterapeutyki przez roztocza i mogą mieć charakter aplikacyjny oraz są przyczynkiem
do wiedzy o wyścigu zbrojeń patogen-gospodarz.
- Współopracowywałam nową, molekularną metodę indywidualizacji roztoczy V.
destructor opornych i nieopornych na akarycydy, bazującą na PCR-SSCP (Zał. 1, II A, poz.
1). Okazało się, że prążki na elektroforegramie PCR-SSCP były widoczne tylko dla genu
COI 320 bp (ponadto analizowano: COI 929 bp, COII-ATP6 775 bp, ATP6-COIII 818 bp,
i CytB 958 bp), dla którego oporne roztocza miały dwa dodatkowe prążki w porównaniu z
roztoczami wrażliwymi i z grupy kontrolnej. Dodatkowo potwierdzono tą tendencję
podczas sekwencjonowania – roztocza oporne miały 8% większą częstotliwość mutacji
sensownych w porównaniu z dwiema pozostałymi grupami.
B) Zachowywaniem się plemników przechowywanych w zbiorniczku nasiennym matki
oraz czynnikami wpływającymi na koagulację spermy (Zał. 1, II A, poz. 6, 24).
- Uczestniczyłam w badaniach, w których stosując techniki fluorescencyjnego znakowania
DNA plemników stwierdzono, że na skutek kontaktu plemników z płynem zbiorniczka
nasiennego matki pszczelej, plemniki układają się w kołowe skupiska. Wiąże się to z
15 Autoreferat – A. Strachecka
ważnym dla biologii rozrodu zagadnieniem „sperm competition”. Wyniki te, traktowane
jako wstępne, wskazują na konkurencję między plemnikami przechodzącymi do
zbiorniczka nasiennego. Ponadto określano wpływ rozcieńczalników i barwników na
zachowanie plemników; reinseminowano matki nasieniem uprzednio zdeponowanym w
zbiorniczkach nasiennych innych matek. Stwierdzono, że z jaj zapłodnionych przez
znakowane fluorescencyjne DNA plemników rozwijały się zdrowe robotnice, co wskazuje
na brak szkodliwego wpływu zastosowanego barwnika na ontogenetyczny rozwój pszczół.
Stwierdzenie to należy uznać za ważne dla metodyki badań nad plemnikami i
zapłodnieniem.
- W ramach tego zadania, byłam pomysłodawcą wykonania analiz aktywności systemu
proteolitycznego w spermie trutni. Wykonałam analizy biochemiczne mające na celu
określenie różnic w stężeniu białek oraz aktywności systemu proteolitycznego w spermie
pobranej od pojedynczych trutni, spermie zmieszanej od kilku trutni i w spermie
skoagulowanej (Zał. 1, IIA, poz. 6). Wykazałam, że skoagulowane nasienie charakteryzuje
się wysokim stężeniem białek, przy jednocześnie małej aktywności proteaz, których
optimum pH wynosiło 3.0; 7.0 i 12.0. Podczas mieszania spermy dochodzi do
denaturacji/inaktywacji proteaz w zakresie mas 70-120 kDa. Zagadnienie to czeka na
wyjaśnienie i stwarza nowy obszar badawczy dla embriologii i biologii rozrodu owadów.
C) Wybranymi zagadnieniami z behawioru A. mellifera. Ten obszar badawczy nie jest
głównym tematem moich zainteresowań, ale współuczestniczyłam w badaniach
realizowanych przez moich kolegów w zespole. W ramach tych prac realizowano
następujące zagadnienia:
a) Agresywność matek i robotnic. Analizowano jaki wpływ na zachowania robotnic
ma agresywna matka i odwrotnie (Zał. 1, II A, poz. 19).
b) Współdziałanie robotnic w testach polowych i klatkowych. Określano współpracę
pszczół Buckfast i kraińskich podczas pobierania i gromadzenia syropu [hoarding
behaviour] (Zał. 1, II A, poz. 9, 10, 22, 23; II D, poz. 5, 6).
c) Efekt CO2 na długowieczność pszczół (Zał. 1, II A, poz. 16). W badaniach
entomologicznych, szczególnie laboratoryjnych, używa się CO 2 do anastezji
owadów.
d) Zachowania behawioralne pszczół wychowywanych w małych komórkach (Zał. 1,
II A, poz. 3, 4).
D) Zmianami poziomu ogólnej metylacji genomu (zmiany epigenetyczne) u zwierząt.
Moje badania wykonywałam, oprócz pszczół, na ptactwie domowym (Zał. 1, II A, poz. 7).
Ponadto kontynuowałam, rozpoczęte jeszcze podczas studiów doktoranckich, badania
biochemiczne u drobiu (Zał. 1, IIA, poz. 5, 15; II D, poz. 1, 3, 4, 9, 10). Planowałam
protokoły doświadczalne i wykonywałam związane z nimi oznaczania biochemiczne
interpretując wyniki w świetle ogólno-biochemicznej wiedzy.
Na zakończenie omawiania moich osiągnięć naukowych pragnę nadmienić, że w
swoich badaniach wykorzystywałam obszerne bazy danych, charakteryzujące się bardzo
dużą liczebnością próbek (np. 4000 robotnic [Zał. 1, IB poz. 2]; 29 568 robotnic [Zał. 1,
1IA poz. 14]). Dlatego moje wyniki i poczynione na ich podstawie spostrzeżenia uważam
16 Autoreferat – A. Strachecka
za dobrze udokumentowane i w niedalekiej perspektywie, dające podstawy do stworzenia
dotąd nieopracowanych, norm referencyjnych dla pszczół. Wiedza ta jest przydatna dla
przedstawicieli nauk biomedycznych i weterynaryjnych o czym świadczy duże
zainteresowanie wynikami moich badań periodyku „Veterinary Medicine – Science and
Practice”. Rozpowszechnianie moich wyników przez to czasopismo (na prośbę redakcji),
traktuję jako wstęp do ich wykorzystania w praktyce. Warto dodać, że czasopismo nie ma
zbyt wysokiego IF, ale za to jest czytane nie tylko przez naukowców, ale przez rzesze
praktykujących weterynarzy i biologów oraz przez producentów leków.
5.3. PLANY NA PRZYSZŁOŚĆ
W najbliższym czasie moje badania naukowe nadal będą się skupiać na poszerzaniu
wiedzy i lepszym, kompleksowym zrozumieniu biochemicznych i epigenetycznych
mechanizmów odpowiedzialnych za pszczelą nieswoistą odporność. Tematami, którymi
zaczęłam się już zajmować i chciałabym je pogłębić są:
1)
Związane z procesem starzenia zmiany w kluczowych dla odporności systemach u
specjalnej grupy robotnic A. mellifera, – rebeliantek (rebel bees), w porównaniu z matkami
i robotnicami nie-rebeliantkami. W rozdz. 5.1.1. wspomniałam, że jak wskazują moje
wyniki, robotnice nie koniecznie są ewolucyjnie starsze niż matki. Zasugerowałam też, że
wyjaśnienie tej kontrowersji może umożliwić lepsze zrozumienie ewolucji układów
eusocjalnych. W roku 2013, podczas mojego stażu w Instytucie Nauk o Środowisku
Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie zapoznałam się z pracami nad nowoodkrytymi
tam „robotnicami rebeliantkami”. Prace te zmierzały do zmodyfikowania „reproductive
ground plan hyphothesis” (RGPH) opisanej po raz pierwszy w Nature przez Amdam i in.
(2006). Badania rebeliantek, jako potencjalnie pośredniego ogniwa pomiędzy robotnicami
i matkami mogą rzucić nowe światło na tą hipotezę. Moim zdaniem właśnie badania
systemów antyoksydacyjnych, regulacji epigenetycznych i innych biochemicznych
przyczyn szybszego starzenia się robotnic niż matek mogą być w tym przypadku
kluczowe. Moje wstępne badania i bibliografia dotycząca tego zagadnienia są na razie
pilotowe i fragmentaryczne (Zał. 1, IIK, poz. 9), ale projekt z NCN nr
2014/13/B/NZ8/04705 (Opus) w UJ, którego jestem głównym wykonawcą oraz projekt nr
2014/15/B/NZ9/00425 (Opus; Zał. 1, IIi) w UP Lublin, którego jestem kierownikiem
stwarzają szansę na istotne uzupełnienie wiedzy o miejscu rebeliantek w superorganizmie
rodziny pszczelej i tym samym, znaczące uzupełnienie wiedzy z zakresu biologii
ewolucyjnej owadów społecznych. Z punktu widzenia moich zainteresowań najistotniejsze
są mechanizmy biochemiczne. Badania są w toku, a na znaczące publikacje trzeba
poczekać.
2)
Zależne od wieku zmiany histologiczne i biochemiczne w ciele tłuszczowym oraz
gruczołach kieszeniowych u matek pszczelich i w gruczołach Nasonova u robotnic pszczół
miodnych. Opracowanie nowych metod i modyfikacja tych istniejących przedstawionych
w rozdz. 5.1.1. umożliwiły mi rozszerzenie badań na inne tkanki, tj. ciało tłuszczowe,
gruczoły. Najczęściej zmiany biochemiczne i histologiczne są ze sobą powiązane i
17 Autoreferat – A. Strachecka
zrozumienie tych powiazań może znacznie wzbogacić wiedze o starzeniu A. mellifera.
Chciałabym także uzyskać odpowiedź, w jaki sposób swoiste białka, w tym proteazy i ich
inhibitory, wydzielane są przez pancerz chitynowy na powierzchnię ciała pszczół A.
mellifera. Poznanie tego mechanizmu jest ważne dla poszerzenia wiedzy o fizjologii
biochemicznych mechanizmów obronnych owadów, a z drugiej strony, dla parazytologii
przy analizowaniu relacji gospodarz – patogen. Pierwsze wyniki zostały przedstawione na
konferencjach Zał. 1, IIK, poz. 1, 2, 11, 13, 14. I w tym przypadku duże nadzieje pokładam
w łącznym interpretowaniu badań histologicznych i biochemicznych. W tym kontekście
jest jeszcze wiele pytań, na które poszukuję odpowiedzi, dlatego na znaczące publikacje
trzeba poczekać.
3)
Zależne od płci i wieku zmiany histologiczne w ciele tłuszczowym i biochemiczne
w hemolimfie pszczół samotnic; u pszczoły Osmia rufa. Ze względu na ogólnoświatowy
spadek liczby zapylaczy, coraz częściej zwraca się uwagę na inne, niż A. mellifera, gatunki
pszczół. Są to owady, które większość swojego życia spędzają w formie diapauzy i
procesy fizjologiczne w tym okresie są najczęściej opisywane w literaturze. Okres stadium
imago, w którym owady zapylają, składają jaja, budują gniazda, itp. bywa pomijany przez
naukowców, głównie ze względu na trudności w schwytaniu owadów. A przecież okres ten
jest kluczowy dla przetrwania kolejnych pokoleń murarki. Dlatego, w dwóch ostatnich
latach łapałam samce i samice w różnym wieku, wykonywałam analizy histologiczne ciała
tłuszczowego, pobierałam hemolimfę i analizowałam ją pod względem biochemicznym.
Wyniki są obiecujące, część z nich przygotowuję do druku, a na pozostałej części próbek
będę wykonywać kolejne analizy. Chciałabym poznać mechanizmy odporności u murarki
(Osmia rufa), jako pszczoły samotnej i porównać je do tych u pszczoły miodnej, jako
gatunku o społecznym trybie życia. Liczę, że w ten sposób wzbogacę wiedzę o
biochemicznych mechanizmach u owadów samotnych versus socjalnych w aspekcie ich
ewolucji.
4)
Wpływ endopasożyta Nosema spp. na zmiany histologiczne i biochemiczne w ciele
tłuszczowym,
procesy
biochemiczne
w
hemolimfie
oraz
regulacje
epigenetyczne/genetyczne u różnych gatunków owadów społecznych. Nosemoza, w
rozumieniu choroby odnoszącej się do A. mellifera, wywoływana jest przez dwa gatunki
mikrosporydiów: N. apis i N. ceranae, ale znane są również N. bombi u trzmieli. Jak
pisałam w rozdz. 4 i 5, w ostatniej dekadzie nastąpił gwałtowny rozwój oraz
rozprzestrzenienie chorób pszczół i innych zapylaczy. Taka sytuacja wymaga
zdecydowanego zwiększenia intensywności badań, głównie pod kątem relacji gospodarz –
pasożyt. Pierwsza praca z tego zakresu wykonana na trzmielach ukazała się w tym roku
(Zał. 1 IIA, poz. 2), a na kolejne trzeba będzie jeszcze poczekać. Warto dodać, że praca ta,
tak jak wcześniej wspominane badania niskocząsteczkowego przełącznika
epigenetycznego (PG) umożliwiła mi współprace międzynarodową z ośrodkami w Rosji i
USA.
Moim priorytetem ostatnich dwu lat było pozyskanie projektu badawczego NCN, w
którym byłabym głównym pomysłodawcą i kierownikiem. Działania te uwieńczone
zostały sukcesem. Obecnie za priorytetowe uważam rozwijanie współpracy
18 Autoreferat – A. Strachecka
międzynarodowej, w tym staże zagraniczne. W chwili obecnej podjęłam współpracę z
ośrodkami na Ukrainie i w Rosji. Chciałabym także wznowić współpracę z prof.
Ryszardem Maleszką z Australian National University. Prowadziliśmy już wspólne
badania nad ekspresją genów i białek mózgu związanych z uczeniem się pszczół, ale
wstępne wyniki nie dały materiału na publikacje. Do tematu chciałabym jednak powrócić.
6. DZIAŁALNOŚĆ DYDAKTYCZNĄ I ORGANIZACYJNĄ przedstawiłam w Zał.1,
III.