Badania prenylowanych białek u roślin
Transkrypt
Badania prenylowanych białek u roślin
Badania prenylowanych białek u roślin Anna Leja Kierujący pracą dyplomową: dr inż. Edyta Łukowska-Chojnacka Opiekun naukowy: prof. dr hab. Ewa Świeżewska Niniejsza praca dotyczy badania reakcji prenylacji białek Rab. We wstępie wskazano rolę modyfikacji białek i nakreślono cel pracy, którym było zbadanie wpływu białka REP na aktywność geranylogeranylotransferazy-II u Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity). Jako metodę wybrano reakcję prenylacji białek Rab in vitro (prenylacja białka rekombinowanego) i in vivo (prenylacja białek endogennych). Zastosowano linie roślinne o niezmienionym genotypie, a także linie z insercją w genie REP oraz linię rewertanta z tym genem ponownie wprowadzonym na plazmidzie. Zastosowano substraty lipidowe oraz prekursor ich biosyntezy wyznakowane trytem. Pomiar radioaktywności rozdzielonych po reakcji białek pozwala na wnioskowanie o wydajności reakcji prenylacji. W krótkim wstępie teoretycznym omówiono najczęściej występujące modyfikacje lipidowe białek: S-acylację, N-mirystylację, prenylację i modyfikację glikozylofosfatydyloinozytolem. Przedstawiono charakterystykę białek Rab, omawiając ich funkcje u roślin, podział u A. thaliana, a także białka z nimi oddziałujące oraz mechanizm ich prenylacji. Szczególną uwagę zwrócono na badania dotyczące białka RabA2a, które było używane w doświadczeniach wykonanych w ramach niniejszej pracy. Przedstawiono także dotychczas uzyskaną wiedzę dotyczącą enzymatycznego kompleksu geranylogeranylotransferazy-II u A. thaliana. W kolejnym rozdziale omówiono wyniki doświadczeń wykonanych w ramach pracy badawczej. Scharakteryzowano używane linie roślinne przy pomocy szeregu reakcji PCR, potwierdzając obecność insercji w oczekiwanym genie oraz homozygotyczność linii insercyjnych. Potwierdzono także obecność genu REP wprowadzonego na plazmidzie do linii rewertanta. Stwierdzono transkrypcję genu REP w linii typu dzikiego oraz rewertanta. Wykryto ją także w jednej z linii insercyjnych. Dokonano pomyślnego klonowania białka RabA2a, co potwierdzono przy pomocy sekwencjonowania. Używany plazmid pozwolił na ekspresję białka w fuzji z transferazą S-glutationową. Białko fuzyjne uzyskano w wyniku nadekspresji w hodowli bakteryjnej i oczyszczono na złożu z glutationem. Stwierdzono częściowy rozpad białka fuzyjnego GST-RabA2a, jednak ze względu na problemy związane z oczyszczaniem produktów trawienia zdecydowano się używać preparatu zawierającego białko fuzyjne. Przeprowadzono reakcję prenylacji uzyskanego białka rekombinowanego RabA2a in vitro, z użyciem frakcji cytozolowych (supernatant po wirowaniu 105 000 G) stosowanych linii roślinnych jako źródłem geranylogeranylotransferazy-II i difosforanem geranylogeranylu wyznakowanym trytem jako substratem lipidowym. Wyniki reakcji nie były zgodne z oczekiwanymi. Nie zaobserwowano tendencji do zmniejszonej aktywności enzymu w linii inercyjnej, co może być jednak spowodowane specyfiką metody. Przygotowano preparat geranylogeraniolu wyznakowanego trytem jako jeden z substratów do znakowania metabolicznego in vivo. Dostępny preparat geranylogeraniolu oczyszczono, a następnie wyznakowano w dwuetapowej reakcji obejmującej utlenianie alkoholu do aldehydu i jego ponowną redukcję przy pomocy wyznakowanego trytem reduktora. Produkt reakcji oczyszczono i oznaczono jego aktywność. Następnie przeprowadzono znakowanie metaboliczne in vivo z jego użyciem. Jako drugi stosowano wyznakowany trytem preparat mewalonianu, prekursora biosyntezy związków izoprenoidowych. Badano prenylację endogennych białek Rab. Wyniki okazały się być niezadowalające w przypadku znakowania z użyciem mewalonianu, jednak należy tu wziąć po uwagę fakt, iż związek ten jest prekursorem syntezy wielu związków izoprenoidowych takich jak prenole, sterole, karotenoidy i inne. Możliwe więc, iż został spożytkowany przez roślinę do syntezy związków innych niż geranylogeraniol. Wyniki otrzymane dla znakowania metabolicznego in vivo z użyciem wyznakowanego trytem geranylogeraniolu zdają się być najbardziej obiecujące. Można zauważyć pewną tendencję do zmniejszonego włączania substratu lipidowego do białek Rab w linii insercyjnej SALK_140044, co może prowadzić do potwierdzenia wpływu białka REP na aktywność geranylogeranylotransferazy-II u Arabidopsis thaliana. Wymaga to jednak dopracowania metody i powtórzenia badań. Wyniki przeprowadzonych reakcji nasunęły przypuszczenia iż wstawka insercyjna w linii SALK_140044 może znajdować się poza obszarem kodującym, podobnie jak w linii SALK_130575. Wykonane pozycjonowanie wstawki oraz analizy Western blot pozwoliły na stwierdzenie iż wstawka insercyjna powoduje skrócenie transkryptu i powstanie hybrydowego, nieznacznie zmienionego białka REP. Można przypuszczać iż białko hybrydowe ma podobną aktywność lecz zmienione wymagania substratowe.