Ćwiczenie 3 Elementy syntezy i chromatografii luminoforów

Ćwiczenie 3
Elementy syntezy i chromatografii luminoforów organicznych.
Akrydyna należy do znanych luminoforów organicznych (rysunek poniżej).
N
Z powodu licznych zastosowań praktycznych, zagadnienia syntezy tego typu układu są
przedmiotem wielu badań.
Reakcje większości akrydyn na atomie azotu z elektrofilami są, ogólnie rzecz biorąc,
podobne do reakcji, którym ulega pirydyna i jej pochodne. Schemat najważniejszych tego
typu przemian w przypadku najprostszego azaanalogu benzenu przedstawiono poniżej.
Kwasy protonowe tworzą odpowiednie sole, kwasy Lewisa – związki koordynacyjne,
metale przejściowe – kompleksy, fluorowce- addukty, a halogenki alkilowe i acylowe oraz
aktywne estry alkilowe – czwartorzędowe sole. Aktywowane alkeny i alkiny dają
czwartorzędowe sole (reakcja Michaela), a wodorotlenki i nadkwasy organiczne utleniają
pirydyny do N-tlenków. Podstawniki elektronodonorowe, szczególnie w pozycji para,
aktywują atom azotu, zaś podstawniki elektronoakceptorowe mają wpływ przeciwny. Z kolei
objętościowe podstawniki w pozycjach orto osłaniają dostęp do pary elektronowej atomu
azotu i często utrudniają większość wspomnianych reakcji.
Związkami akrydyny o szczególnym znaczeniu praktycznym jest kwas akrydynylo-9karboksylowy oraz 9-akrydon. Estry aromatyczne tego kwasu są zdolne do wydajnej
chemiluminescencji w środowisku alkalicznym, bez konieczności stosowania katalizatora, w
związku z czym znalazły zastosowanie w ultraczułych technikach analitycznych (umożliwiają
wykrycie analitu na poziomie dochodzącym do 10-15 mola). Wydajność całkowita emisji
światła tego typu układów dochodzi do 7 %, co określa się mianem wydajnej
chemilumninescencji.
Metoda otrzymywania wspomnianych estrów aromatycznych polega na reakcji chlorku
kwasu akrydynylo-9-karboksylowego z odpowiednim fenolem w obecności N,N-dimetylo-4aminopirydyny jako katalizatora. Prawdopodobny mechanizm działania katalizatora
przedstawiono poniżej.
N(CH3)2
O
O
R C
+
Cl
N(CH3)2
N(CH3)2
+
N
O
H
- HCl
Ph
N
Cl
C
C
R
OPh
+
N
R
O
Reakcja przebiega wydajnie w temperaturze pokojowej w obecności czynnika
wiążącego chlorowodór, trietyloaminy.
Aby umożliwić rozpuszczanie w wodzie tego typu pochodnych, a także zwiększyć
wydajność procesu chemiluminescencji, estry tego typu poddaje się czwartorzędowaniu. Ze
względu na obecność dezaktywującej grupy estrowej w pozycji 9 rdzenia akrydyny,
konieczne jest użycie efektywnego czynnika alkilującego, np. trifuorometanosulfonianu
metylowego.
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest szybką, tanią i czułą techniką
diagnostyczną o ogromnym znaczeniu praktycznym we współczesnej syntezie organicznej.
Pozwala ona monitorować przebieg reakcji, określać wstępnie czystość związków oraz
dobierać układy rozpuszczalników stosowane następnie do preparatywnego oczyszczania
pochodnych metodami chromatografii cieczowej. Ujemną cechą chromatografii TLC jest
zależność rezultatów od bardzo wielu czynników, które nie zawsze można kontrolować (jest
ich około 25). Oto niektóre z nich:
- rodzaj fazy stacjonarnej,
- skład fazy ruchomej,
- stopień wysycenia parami rozpuszczalnika komory chromatograficznej,
- rozmiar ziaren i grubość warstwy fazy stacjonarnej,
- nierównomierności fazy stacjonarnej,
- wielkość sygnału startowego (stężenie i objętość próbki nanoszonej),
- temperatura,
- dodatki obecne w fazie stałej (np. wskaźniki fluorescencyjne)
- zanieczyszczenia obecne w fazie ruchomej,
- długość drogi rozdziału i inne.
W czasie rozdziału chromatograficznego tzw. prostego wielokrotnie powtarzane są
procesy adsorpcji i desorpcji zachodzące pomiędzy fazą ciekłą (zwykle mało lub średnio
polarną), a stałym podłożem o charakterze polarnym (typowo rolę tę pełni tlenek krzemu (IV)
lub tlenek glinu). Uproszczony mechanizm tego procesu chromatograficznego przedstawiono
poniżej.
Równowagi pojawiające się w trakcie procesu chromatograficznego. A: adsorpcja, G –
nośnik fazy stałej (zwykle szkło lub folia Al), M – faza ruchoma (rozpuszczalnik), ο powierzchnia fazy stacjonarnej.
Składnik
oznaczony
trójkątem
preferuje
przebywanie na powierzchni fazy stałej (tzn.
adsorpcję na powierzchni), gdyż jest bardziej
polarny.
Z kolei drugi składnik, oznaczony kółkiem,
przebywa chętniej w fazie ruchomej, ze względu na
swoją niższą polarność.
W trakcie napływania świeżej fazy ruchomej te
cząsteczki, które pozostały w rozpuszczalniku
przepływają dalej. Obsadzają one dostępne wolne
miejsca na powierzchni fazy stacjonarnej, która
jednak preferuje składnik bardziej polarny.
Innymi słowy – dla składnika bardziej polarnego
równowaga przesunięta jest w stronę adsorpcji, zaś
dla składnika mniej polarnego – w stronę
rozpuszczania.
Po wielu powtórkach takich procesów, substancje
ulegają mniej lub bardziej dokładnemu rozdzieleniu.
Cząsteczki substancji oznaczonej kółkami wędrują
szybciej, ze względu na swoją niższą polarność. Z
kolei cząsteczki substancji oznaczonej trójkątami
wędrują wolniej, gdyż jako bardziej polarne silniej
oddziałują z fazą stałą.
Poniżej podano najważniejsze parametry stosowane w chromatografii TLC.
współczynnik RF (współczynnik zatrzymania):
b droga subst.
RF = =
a droga rozp.
współczynnik RST (względny współczynnik zatrzymania):
b droga subst.
RST = =
a
droga std .
Sposób wyznaczania wartości RF i RST
Czoło rozpuszczalnika
Standard
Substancja
Substancja
Start
Start
Wartość RF
Wartość RST
Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest techniką o wiele bardziej kosztowną
niż TLC, ale ze względu na możliwości analityczne jest dziś nieodzownym elementem
syntezy organicznej. Pozwala ona na standaryzowanie wyników, określenie współczynników
zatrzymania (parametrów retencji), ilościowe określanie czystości związków a także, do
pewnego stopnia, na śledzenie mechanizmów reakcji. W połączeniu z detekcją
luminescencyjną czy metodami takimi jak spektrometria mas (LC-MS) stanowi ona dziś
jedno z najwartościowszych narzędzi badawczych.
Procesy fizyczne, jakie mają miejsce w kolumnie do chromatografii HPLC są podobne
do tych jakie zachodzą w chromatografii prostej (TLC). Zasadnicza różnica polega na tym, że
w chromatografii HPLC stosuje się zwykle tzw. ‘fazy odwrócone’, to znaczy że faza
stacjonarna jest niepolarna albo mało polarna, zaś faza ruchoma to układ rozpuszczalników o
wysokiej polarności. Zwykle jako fazę stacjonarną stosuje się modyfikowaną krzemionkę, to
jest taką, w której do wolnych grup hydroksylowych przyłączono długie łańcuchy alkilowe
(C8 – C18), zaś typowe fazy ruchome stosowane w tej technice to wszelkiego rodzaju
roztwory buforowe z domieszką rozpuszczalników organicznych takich jak metanol
acetonitryl czy kwas trifluorooctowy. W rezultacie w czasie rozdziału obowiązują odwrotne
relacje jak to ma miejsce w chromatografii prostej – substancja bardziej polarna pojawia się
pierwsza u szczytu kolumny, zaś mniej polarna – później. Podobnie relacje dotyczą
modyfikacji fazy ruchomej: zwiększenie stężenia składnika mniej polarnego (modyfikatora
organicznego) powoduje że rozdzielana substancja szybciej pojawia się u wylotu kolumny w
porównaniu z układem pierwotnym.
Najważniejsze parametry wykorzystywane w chromatografii HPLC.
Efektywność
kolumny Ilość płytek teoretycznych (N) i wysokość półki teoretycznej
chromatograficznej
(H):
Gdzie X oznacza dystans przebyty przez substancję w
kolumnie, a W jest szerokością pasma chromatograficznego.
Typowe wartości dla standardowych kolumn
chromatograficznych N = 10,000-15,000; H = 6-10 µm.
Efektywność a selektywność
rozdziału
chromatograficznego.
Górny rysunek: niska selektywność, wysoka efektywność.
Dolny rysunek: wysoka selektywność, niska efektywność.
Rozdzielczość
chromatograficzna (RS)
Sposób wyznaczania:
(tR),
czas tR (czas retencji) to czas po którym badana substancja
przechodzi przez kolumnę i pojawia się w detektorze.
tO (czas martwy) to czas po którym substancja nie
oddziałująca ze fazą stałą (niesorbująca, np. D2O) przechodzi
przez kolumnę i pojawia się w detektorze.
Współczynnik retencji
(pojemnościowy) (k’)
Współczynnik retencji (k’) jest to iloraz zredukowanego
czasu retencji (tR−tO) i czasu retencji substancji niesorbującej
(tO); wyznacza się go z chromatogramu.
t −t
k'= R O
tO
Czas retencji
martwy (tO)
Metoda HPLC może wspomagać badanie złożonych korelacji typu budowa – aktywność
dla wielu związków organicznych.
Po wyznaczeniu wartości k’ dla danej substancji, a następnie obliczeniu wartości log k’
można sporządzić zależność ostatniego parametru od zawartości modyfikatora organicznego
w fazie ciekłej, która dla wielu układów ma w przybliżeniu charakter liniowy. Prostą tego
typu można wyrazić równaniem: log k’ = −s×ρ% + log kw, gdzie s to współczynnik
kierunkowy prostej, ρ% - zawartość modyfikatora organicznego w fazie ciekłej (zmienna x),
zaś log kw to wyraz wolny, który jest względną miarą hydrofobowości badanego związku.
(hydrofobowość to, ogólnie rzecz biorąc, tendencja do preferowania środowisk niewodnych –
niepolarnych, będąca wypadkową wielu cech substancji i zależna również od środowiska).
Wartości log kw dla wielu pochodnych korelują z wartościami współczynników podziału
badanych substancji w układzie oktanol-woda (log P), które można określić eksperymentalnie
lub teoretycznie. Obydwa parametry mają duże znaczenie w tzw. testach korelacyjnych typu
QSAR wykorzystywanych w projektowaniu leków.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie z elementami nowoczesnej syntezy organicznej. Obejmuje
ono:
1. Przeprowadzenie ostatniego etapu syntezy związku luminezującego (estru
akrydyniowego lub pochodnej 9-akrydonu), a następnie jego izolację.
2. Wykonanie chromatogramu TLC w celu określenia stopnia przemiany; ewentualne
oczyszczenie produktu na płycie PTLC.
3. Wykonanie badań produktu metodą HPLC i określenie:
czystości i czasu retencji (RT) połączenia w danym układzie;
wpływu obecności podstawników na czas retencji dla zadanej grupy luminoforów;
wpływu ilości modyfikatora organicznego na czas retencji luminofora.
4. Wywołanie reakcji chemiluminescencji i wstępne określenie tożsamości produktów
reakcji metodą chromatografii HPLC
analiza mieszaniny poreakcyjnej;
zarejestrowanie chromatogramów dla zadanych wzorców.
Wykonanie ćwiczenia
Synteza estru akrydyniowego
Estry arylowe kwasu akrydynylo-9-karboksylowego rozpuścić w 1-2 cm3 suchego
dichlorometanu. Do roztworów dodać ok. 5-10 mg 2,6-di-t-butylopirydyny osadzonej na
nośniku polimerycznym. Następnie, mieszając, wprowadzić ok. 5-krotny nadmiar molowy
estru metylowego kwasu trifluorometanosulfonowego (CF3OSO2CH3) (uwaga, substancja
toksyczna!) i kontynuować reakcję przez 1 godz.. Roztwór przefiltrować przez filtr
strzykawkowy (PTFE) i do przesączu dodać nadmiar (ok. 10-krotny) eteru etylowego. Żółty
produkt,
trifluorometanosulfonian
estru
arylowego
kwasu
9-karboksy-10metyloakrydyniowego odsączyć, osuszyć i zważyć. Zachować do dalszych badań.
Chromatografia TLC
Sporządzić chromatogram TLC otrzymanej soli akrydynowej przez rozpuszczenie
próbki związku w niewielkiej ilości alkoholu etylowego i naniesienie za pomocą kapilary
kropli roztworu na start płytki TLC pokrytej żelem krzemionkowym (SiO2). Obok nanieśc w
analogiczny sposób próbkę substratu (odpowiedniej zasady). Po wysuszeniu, rozwijać płytkę
w małej, kondycjonowanej komorze chromatograficznej zawierającej układ chloroform/kwas
trifluorooctowy (CHCl3/TFA) = 40/1 obj./obj. Po zakończeniu procesu płytkę wysuszyć i
obejrzeć pod lampą UV (rtęciową). Zaznaczyć ołówkiem sygnały i zachować płytkę do
dalszych badań.
Chromatografia HPLC
•
Zarejestrować, stosując metodę HPLC w ‘odwróconych fazach’, czasy retencji oraz
czystość (% powierzchni sygnału) dla otrzymanej soli (3 nastrzyki), stosując jako fazę
ruchomą układ acetonitryl / woda (60 / 40 % obj.) z dodatkiem 2 mM fosforanów (NaH2PO4
+ Na2HPO4) o pH końcowym = 3.5. Jako fazę stacjonarną zastosować modyfikowaną
hydrofobowo krzemionkę (kolumna typu C-18 lub C-OPh (fenoksylowa)).
•
Powtórzyć analizy jak wyżej, stosując układy ciekłe o zmniejszającej się zawartości
modyfikatora organicznego (acetonitryl / woda): 50/50; 30/70; 10/90.
Szczegóły dot. przygotowania do pracy i obsługi zestawu chromatograficznego HPLC firmy
Waters zostaną podane przez prowadzącego.
Wywołanie chemiluminescencji i analiza produktów reakcji
Wywołać reakcję CL we fiolce o pojemności 1-3 ml, stosując następujące ilości
odczynników:
–
roztwór soli akrydynowej w acetonitrylu (‘stock solution’; c = 5×10-3 M) (20 µL)
–
roztwór 0.06 % H2O2 w 0.01 M HNO3 (100 µL)
–
roztwór 0.2 M NaOH w wodzie (100 µL)
–
1 kropla stężonego kwasu ortofosforowego (H3PO4). pH końcowe powinno wynosić =
3.5.
Zaobserwować zjawisko chemiluminescencji.
Po całkowitym zakończeniu reakcji (2 min.) pobrać próbkę mieszaniny poreakcyjnej i
wykonać 2-3 próby w tym samym układzie chromatograficznym, w którym wykonywano
analizy soli akrydyniowej. Na końcu zarejestrować chromatogramy substancji wzorcowych:
10-metylo-9-akrydonu, kwasu 9-karboksy-10-metyloakrydyniowego oraz odpowiedniego
fenolu.
Opracowanie wyników
1. Napisać schemat przemian (wzory strukturalne) prowadzących do otrzymania
trifluorometanosulfonianu
estru
fenylowego
kwasu
9-karboksy10-metyloakrydyniowego wychodząc z kwasu akrydynylo-9-karboksylowego. Obliczyć
wydajność reakcji tworzenia soli akrydyniowej.
2. Wyznaczyć współczynniki RF substratu (zasady) i produktu (soli) na płytce TLC.
3. Na podstawie chromatografów HPLC podać uśrednione wartości czasu retencji (RT)
oraz czystości (% powierzchni sygnału) dla produktu oraz substratu. Wyznaczyć
wartości parametru retencji (k’) dla soli akrydynowej przy różnych zawartościach
modyfikatora organicznego (ρ%), a następnie obliczyć wartości log k’. Sporządzić
wykres typu: log k’ = f(ρ%) i dodać liniową funkcję trendu, podać jej parametry i
współczynnik korelacji.
4. Dokonać analizy chromatogramu HPLC mieszaniny poreakcyjnej oraz wzorców; podać
skład mieszaniny poreakcyjnej oraz oszacować zawartość procentową każdego z
produktów.
5. Przeprowadzić dyskusję otrzymanych wyników:
- czy synteza soli akrydyniowej może być uznana za wydajną i dlaczego wymaga
stosowania drastycznego czynnika metylującego,
- wytłumaczyć wartości współczynników RF dla substratu i produktu otrzymane
metodą TLC.
- wytłumaczyć wartości czasów retencji (RT) dla badanych związków otrzymane
metodą HPLC. Ocenić, czy otrzymany produkt można uznać za czysty chemicznie
(> 98%).
- skomentować zależność log k’ = f (ρ%). Podać wartość parametru hydrofobowości
log kw’.
- przedyskutować pochodzenie składników w mieszaninie poreakcyjnej. Na podstawie
literatury wyjaśnić ew. pojawienie się sygnału od kwasu 9-karboksy-10metyloakrydyniowego.
Literatura:
1.
2.
3.
4.
J. Młochowski, „Chemia związków heterocyklicznych”, PWN, Warszawa 1994.
J.A. Joule, G.F. Smith, „Chemia związków heterocyklicznych” PWN, Warszawa 1984.
A. Albert, „The Acridines”, Edward Arnold Publ. LTD, London 1966.
Praca zbiorowa (red. J.J. Kirkland), “Współczesna chromatografia cieczowa”, PWN Warszawa 1976.