3. Hydroliza enzymatyczna peptydu i białka

3. Hydroliza enzymatyczna peptydu i białka
1. Hydroliza enzymatyczna peptydu i białka
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. Bufor Tris HCl o pH 8,3
2. Roztwór trypsyny o stężeniu 1mg/mL w 0,1 M roztworze HCl z dodatkiem 20 mM CaCl2
3. Roztwór chymotrypsyny o stężeniu 1mg/mL w 0,1 M roztworze HCl z dodatkiem 20 mM CaCl2
4. 30% kwas octowy
5. 3 mg badanego peptydu
6. Płytki chromatograficzne (2020 cm) pokryte 0,25 mm warstw żelu krzemionkowego
7. Komora chromatograficzna do chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
8. Kapilary
9. 1% roztwór ninhydryny w etanolu
10. Układ rozwijający BAW (n-butanol : kwas octowy : woda) o następującym składzie 1 : 1 : 1;
v/v/v
11. Probówki zwykłe szklane
12. Łaźnia wodna
Wykonanie doświadczenia:
W dwóch probówkach umieścić po 100 μL roztworu peptydu (1mg/mL) i inkubować w
temperaturze pokojowej w 2 mL buforu Tris HCl o pH 8,3 z dodatkiem 100 μL roztworu trypsyny
(probówka 1) i 100 μL roztworu chymotrypsyny (próbówka 2). Po 30 minutach inkubacji
zakończyć reakcję, dodając do probówek po 100 μL 30% roztworu kwasu octowego. Następnie
wykonać analizę metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) nanosząc na płytkę TLC
roztwory z probówki 1 i 2, a także jako odnośniki roztwory trypsyny, chymotrypsyny oraz peptydu.
Chromatogram wywołać stosując 1% roztwór ninhydryny w etanolu. Określić podatność
analizowanego peptydu na proteolizę. Na podstawie informacji o sekwencji aminokwasowej oraz
topologii mostków disulfidowych (jeśli będą występowały w analizowanym peptydzie)
zaproponować miejsca hydrolizy. W ten sam sposób eksperyment powtórzyć dla białka.
2. Analiza produktów trawienia białka metodą elektroforezy na żelu agarozowym
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. Bufor TBE (Tris/kwas borowy/EDTA) – roztwór podstawowy 10-krotnie stężony o składzie: 108
g Tris, 55 g kwasu borowego oraz 3,7 g EDTA w 1000 mL wodnego roztworu
2. Bufor ładujący: 50% roztwór gliceryny w buforze TBE z dodatkiem błękitu bromofenylowego
3. Wirówka
4. Żel agarozowy 0,8%
5. Łaźnia wodna
6. Kolby płaskodenne i okrągłodenne
7. Cylindry miarowe
8. Zlewki
9. Agaroza
10. Aparat do elektroforezy agarozowej.
11. Transluminator lub zwykła lampa UV
12. Roztwór Coomasie Blue
2a. Przygotowanie żelu
Przygotować 2 L rozcieńczonego buforu TBE biorąc 1 część stężonego roztworu i 9 części wody.
Następnie naważyć 0,8 g agarozy i umieścić w kolbie płaskodennej zawierającej 100 mL uprzednio
przygotowanego buforu. Całość doprowadzić do wrzenia i odczekać (2-3 minuty), aż cały roztwór
będzie klarowny. Całość starannie wymieszać. Zmontować pod wyciągiem zestaw do wylewania
żelu agarozowego i do poprawnie zamontowanego zestawu (uwaga: sprawdzić szczelność!) wylać
roztwór agarozy. Należy pamiętać, aby w zestawie znajdował się grzebień do tworzenia studzienek
w żelu. Po 20 minutach przenieść żel do aparatu do elektroforezy agarozowej, zalać żel uprzednio
przygotowanym rozcieńczonym buforem TBE i ostrożnie wyjąć grzebień z żelu.
2b. Nanoszenie próbki na żel
W 4 probówkach Eppendorfa umieścić kolejno 20, 40, 60 i 100 µL roztworu otrzymanego w
wyniku trawienia białka, w kolejnych 2 probówkach Eppendorfa umieścić: 50 µL białka
nietrawionego oraz 50 µL enzymu. Do każdej z probówek dodać odpowiednią ilość wody tak aby
końcowa objętość roztworu nie przekraczała 100 µL następnie do każdej z nich dodać 25 µL buforu
ładującego. Następnie zachowując ostrożność, delikatnie nanieść próbkę do studzienki za pomocą
pipety automatycznej. Należy pamiętać o tym, że podczas pracy z białkami trzeba pracować w
rękawiczkach jednorazowych, a szkło powinno być czyste (najlepiej przemyte bezpośrednio przed
użyciem etanolem i wysuszone).
3. Elektroforeza
Uwaga:
Obsługa aparatu do elektroforezy agarozowej należy do prowadzącego! Ze względu na ryzyko
porażenia prądem elektrycznym należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy w
pobliżu tego urządzenia.
Po naniesieniu próbek podłączyć elektrody do zasilacza i nastawić zasilacz na napięcie 80-100 V.
Rozdział prowadzić 120 minut. Po tym czasie od aparatu odłączyć elektrody i ostrożnie wyjąć żel.
Zanurzyć żel w roztworze Coomasie Blue. Używając transluminatora zaobserwować
rozmieszczenie w żelu pojawiających się plamek pochodzących od produktów hydrolizy białka.
Sprawozdanie z ćwiczenia powinno zawierać: opis mechanizmu działania i specyficzności
zastosowanych enzymów proteolitycznych, na podstawie analizy hydrolizy peptydu (TLC) i białka
(elektroforeza) ocenić podatność obu związków na proteolizę. Wskazać na chromatogramie i
elektroforegramie miejsca przypuszczalnie odpowiadające sekwencjom powstałych fragmentów.