Coraz powszechniejsze występowanie szczepów gronkowców

Nr wniosku: 248813, nr raportu: 19631. Kierownik (z rap.): mgr inż. Magdalena Marta Zalewska
Coraz powszechniejsze występowanie szczepów gronkowców opornych na działanie
znanych klas antybiotyków stanowi silny impuls do poszukiwania alternatywnych sposobów
leczenia infekcji powodowanych przez bakterie tego rodzaju. Jako nowe potencjalne źródła
środków o aktywności gronkowcobójczej, innych od powszechnie stosowanych antybiotyków,
wskazuje się substancje pochodzenia naturalnego, a w szczególności bakteriocyny. Bakteriocyny są
to peptydy lub małe białka syntezowane przez rybosomy, wykazujące aktywność bakteriobójczą lub
bakteriostatyczną, wytwarzane przez bakterie w celu zwalczania innych bakterii, które mogą
należeć do tego samego lub pokrewnego gatunku. Celem prowadzonych badań było poszukiwanie
nowych, innych od powszechnie stosowanych antybiotyków, środków o aktywności
gronkowcobójczej.
W trakcie prowadzonych prac zidentyfikowano potencjalną bakteriocynę o aktywności
gronkowcobójczej produkowaną przez szczep Staphylococcus xylosus.Dokonano optymalizacji
warunków wydajnej produkcji peptydu w podłożu płynnym (podłoże TSB, inkubacja przez okres
24h w temp. 37°C). W czasie badań wyznaczono również zależność wydajności produkcji
potencjalnej bakteriocyny od kinetyki wzrostu szczepu producenckiego. Największą produkcję
peptydu zauważono w późnym etapie fazy wzrostu logarytmicznego oraz na początku fazy
stacjonarnej. Następnie sprawdzono zakres jego aktywności względem szczepów bakteryjnych
należących do kolekcji Katedry oraz wybranych szczepów muzealnych. Potencjalna bakteriocyna
wykazała aktywność względem szczepów izolowanych od bydła chorego na mastitis (S. aureus,
S. epidermidis and S. xylosus) oraz szczepów muzealnych patogenów żywności (Listeria
monocytogenes, Micrococcus luteus). Interesująca jest również stabilność termiczna
zidentyfikowanego peptydu. Zachowuje on całkowitą stabilność w zakresie temperatur od 4°C do
80°C. Zakres aktywności badanego peptydu oraz jego termostabilność sugerują, że jednym
z potencjalnych obszarów jego zastosowania mógłby być przemysł żywieniowy.
Dodatkowo podjęto się także ustalenia procedury oczyszczania najodpowiedniejszej dla
nowo zidentyfikowanego białka. Zaproponowano trójstopniową procedurę: 1) frakcjonowane
strącanie peptydu siarczanem amonu, 2) chromatografię oddziaływań hydrofobowych (HIC), 3) RPHPLC oraz FPLC (filtracja żelowa). W wyniku przeprowadzenia frakcjonowanego stracania
siarczanem amonu oraz metody HIC udało się otrzymać częściowo oczyszczony, aktywny
mikrobiologicznie, preparat peptydu o stopniu czystości zbliżonym do preparatu homogennego. Po
zastosowaniu oczyszczania z wykorzystaniem wysokosprawnych technik chromatograficznych
preparat stracił aktywność mikrobiologiczną. Ponadto przeprowadzono charakterystykę
otrzymanych na różnych etapach oczyszczania preparatów z zastosowaniem elektroforezy w żelu
poliakrylamidowym oraz MALDI-TOF MS/MS. Udało się w przybliżeniu wyznaczyć masę
zidentyfikowanego peptydu (4,11 ± 0,3 kDa - analiza elektroforetyczna; najprawdopodobniej
4,461kDa - MS MALDI-TOF). Dodatkowo informacje dostarczone poprzez analizę MALDI-TOF
pozwalają sugerować, że w strukturze zidentyfikowanego peptydu występuje inny niebiałkowy
element struktury (podstawnik(i) cukrowy(e) lub małocząsteczkowy ligand (np. jon metalu)).
Ponadto poznano także sekwencję N-końca peptydu. Na tej postawie dokonano analizy gnomu
szczepu producenckiego, niestety nie udało się zidentyfikować potencjalnego genu kodującego
bakteriocynę. Może to sugerować, że peptyd powstaje na drodze syntezy poza rybosomalnej.
Część uzyskanych danych wskazuje, że badana substancja jest bakteriocyną. Przede
wszystkim jest ona wrażliwa na działanie enzymów proteolitycznych, produkowana jest w późnej
fazie logarytmicznego wzrostu lub na początku fazy stacjonarnej szczepu producenckiego,
wykazuje charakter silnie hydrofobowy oraz jest aktywna względem szczepów blisko
spokrewnionych ze szczepem producenckim. Z drugiej jednak strony, przypuszczalny pozarybosomalny charakter biosyntezy tej substancji sugeruje, że może ona nie być bakteriocyną, ale np.
antybiotykiem peptydowym. Dokładne wyjaśnienie tej wątpliwości wymaga przeprowadzenia
dodatkowych badań, które będą prowadzone w Katedrze.