Jeszcze głębsze sekwencjonowanie, czyli SMS po NGS

Jeszcze głębsze sekwencjonowanie,
czyli SMS po NGS
Wielu z nas jest już całkiem osłuchanych z technologiami „głębokiego
sekwencjonowania” (ang. Next Generation Sequencing,, NGS). W Polsce
na palcach jednej ręki można policzyć szczęśliwców, którzy mogą się
pochwalić posiadaniem tej technologii, ale Chiny i USA w każdej
sekundzie generują gigabajty danych genomowych z eksperymentów w
które zaangażowane są sekwenatory II generacji. Wydaje się, że
technologia sekwencjonowania dopiero raczkuje. Czy jesteśmy jednak w
stanie przewidzieć dokąd nas zaprowadzi? Pewne pomysły rodem z
najdziwniejszych opowiadań science fiction już się ziściły. Bo kto by
jeszcze niedawno temu pomyślał, że można będzie z powodzeniem
odczytywać sygnał od pojedynczej cząsteczki polimerazy?
Przełom
Przez blisko 30 lat sekwencjonowanie oparte było na tak zwanej metodzie
Sangera. W skrócie, pojedyncza, niewielka, homogenna matryca (plazmid lub
produkt PCR) była amplifikowana podobnie jak w tradycyjnej reakcji PCR ale z
dodatkiem specjalnie znakowanych dideoksynukleotydów, które kończył reakcję
elongacji pojedynczej cząsteczki na pewnym etapie. Metoda ta, jak bardzo
innowacyjna nie była, była ślepą uliczką ewolucji techniki sekwencjonowania.
Nowe technologie najpierw zostały wymyślone koncepcyjnie, by doczekać dopiero
po kilku latach realizacji, gdy inżynieria materiałowa poszła do przodu, dając
teoretykom narzędzia do wprowadzenia idei w życie. Zasada we wszystkich
systemach Next-Gen (454 Roche’a, Solexa Illuminy, SOLiD Aplery) jest taka sama,
zobrazuję ją przy pomocy SOLiD, która wydaje się być najłatwiejsza do
wyobrażenia: DNA jest „kruszony” na krótkie fragmenty, w oparciu o które
tworzona jest biblioteka poprzez dołączenie adaptorów.następnie DNA
wprowadzane jest do specjalnej emulsji koloidowej. Okrągłe cząstki polimeru w
otoczce z fazy wodnej (bufor), są zawieszone we frakcji lipofilnej tworząc
„mikrośrodowiska” dla pojedynczych reakcji amplifikacji. Każda cząstka polimeru
jest opłaszczona oligonukleotydami, do których cumuje fragment DNA. Jest on
amplifikowany w swojej mikrosferze, nici potomne znów przyłączają się do tej
samej sfery ale w innym miejscu i tak postępuje amplifikacja. To, co się dzieje z
takimi „włochatymi kulami” podczas odczytu sygnału, wygląda inaczej w
przypadku każdego z systemów, dochodzi jednak każdorazowo do emisji
fluorescencji, która jest rejestrowana osobno dla każdej z „kul”, dając w efekcie
dziesiątki tysięcy pojedynczych odczytów, zapisywanych w pamięci
superwydajnych komputerów w MB/sekundę czy nawet w GB/sekundę!
W przypadku innego podejścia, stosowanego np. w metodzie Solexa amplifikacja
przebiega odmiennie, w fazie stałej a nie płynnej i przy użyciu innego sposobu
cumowania bibliotek DNA. Po szczegóły odsyłam do bardzo dobrych opracowań
na seqanswes.com: [1] i [2]
Idzie nowe
II generacja sekwencjonowania ma jednak znaczące ograniczenia. Ponieważ
odczytywane są niewielkie fragmenty, nie ma możliwości sekwencjonowania
repetytywnych fragmentów genomu, a więc np. mini i mikrosatelitów, sekwencji
centromerowych i telomerowych itd. Po prostu montowanie w kontigi kawałków
powtarzających się ciągów kilku nukleotydów jest niewykonalne. Receptą na ten
mankament może być zastosowanie całkiem nowego podejścia, które przede
wszystkim musi zostać opracowane w skali „nano”. Podejście takie nazwano
„SMS”, czyli Single Molecule Sequencing.
W zasadzie niewiele zmienia się w samej idei (oprócz, rzecz jasna, skali!).
Odpowiednia faza stacjonarna wiąże pojedyncze cząsteczki kwasu nukleinowego i
odczytuje sygnały pojedynczych błysków świetlnych lub zmian elektrycznych
generowanych przy dołączaniu przez polimerazę pojedynczych nukleotydów.
Pierwszym z systemów SMS (aczkolwiek zarzuconym wg mojej wiedzy) był
Helicos, kolejne dwa, PacBio i IonTorrent są wciąż dopracowywane i„mają przed
sobą przyszłość. PacBio operuje na pojedynczych cząsteczkach immobilizowanej
polimerazy i ma ogromny zakres odczytu, nawet 16tys nukleotydów w pojedynczej
reakcji. Problemem jest natomiast niedoskonałość odczytu i niestabilność
polimerazy poddanej bardzo dużym stresom energetyczny związanym ze
wzbudzaniem fluorescencji światłem lasera. Za to IonTorrent zamiast
fluorescencji odczytuje zmiany pH- każdy dołek fazy stacjonarnej to mini-pHmetr,
który odnotowywuje lokalne zmiany pH powstające podczas emisji protonu z
przyłączanego nukleotydu! Moim zdaniem to rozwiązanie oferuje największe
możliwości i w przyszłości ma szansę zostać zdobywcą genomowej nagrody X.
Genomowa Nagroda X
Wielu pretendentów, wiele genialnych technologii...
Źródło:
Forum SeqAnswers.
Marzena Pieronkiewicz
Data publikacji: 06.12.2011r.