BADANIE ZDOLNOŚCI TWORZENIA BIOFI

FAKULTET - FIZJOLOGIA BAKTERII
Koordynator - dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
ĆWICZENIE: BADANIE ZDOLNOŚCI TWORZENIA BIOFILMU (na podstawie:
Stepanović i wsp., 2004; Harvey i wsp., 2007)
Autor i główny prowadzący dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
Asysta: mgr Marta Piotrowska, mgr Rafał Ostrowski
Wstęp teoretyczny - wykład dr hab. M. Popowskiej, prof. UW
Do badania zdolność tworzenia przez bakterie biofilmu wykorzystuje się polipropylenowe 96dołkowe płytki titracyjne. Dla każdego szczepu należy przygotować oddzielne płytki, zawierające w
poszczególnych dołkach płynne podłoże LB (po 200 µl) lub podłoże LB z dodatkiem określonego
detergentu powierzchniowo-czynnego w różnych stężeniach 1 i 10% lub 1 i 10 mM (Triton X-100,
EDTA). Do każdego dołka z podłożem wprowadza się po 20 µl lub 30 µl nocnych hodowli
poszczególnych szczepów bakterii, stanowiących inokulum. Przygotowane w ten sposób płytki,
zabezpieczone przed parowaniem (przykryte i owinięte parafilmem) należy inkubować w temp. 30 °C lub
37 °C, w zależności od badanego szczepu bakterii.
Po upływie wyznaczonego czasu inkubacji płytki trzykrotnie należy przepłukać sterylną wodą
destylowaną, w celu usunięcia bakterii wolnopływających. Następnie do każdego wgłębienia należy
dodać po 200 µl metanolu i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym usunąć alkohol i
dokładnie wysuszyć płytki. W celu zabarwienia zaadherowanych komórek bakterii, do dołków dodać po
200 µl roztworu fioletu krystalicznego. Po 15-minutowej inkubacji barwnik należy wypłukać bieżącą
wodą z kranu, a płytki pozostawić do wyschnięcia. Następnie do wysuszonych dołków dodać po 200 µl
33% kwasu octowego.
W tak przygotowanych płytkach mierzono absorbancję roztworu, odpowiadającą gęstości
komórek zadherowanych do podłoża w poszczególnych dołkach. Pomiary prowadzono przy fali o
długości 570 nm, w aparacie „µQant” firmy Bio-Tek Instruments. Kontrolę negatywną doświadczenia
stanowiło niezaszczepione podłoże LB.
Przygotować:
1. hodowle nocne Escherichia coli oraz Bacillus subtilis
2. podłoże płynne LB
3. płytki titracyjne
4. metanol
5. fiolet krystaliczny
6. kwas octowy 33%
7. ręczniki papierowe
8. 100 mM roztwór EDTA
9. 100% Triton X-100
Wyniki należy wpisać w tabele i przedstawić za pomocą wykresów.
WZÓR PŁYTKI TITRACYJNEJ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Literatura uzupełniająca:
1. Wykłady z Fizjologii Bakterii. Popowska M.
2. Stepanović, S., Ćirković, L., Ranin, L., Švabić – Vlahović, M., 2004. Biofilm formation by
Salmonella spp. And Listeria monocytogenes on plastic surface. Lett. Appl. Microbiol.
38(5):428 – 432.
3. Harvey, J., Keenan, K.P., Gilmour, A., 2007. Assessing biofilm formation by Listeria
monocytogenes strains. Food Microbiol. 24(4):380 – 392.