jagiellonian university
Transkrypt
jagiellonian university
Prof. dr hab. Marian H. Lewandowski Zakład Neurofizjologii i Chronobiologii Katedra Fizjologii Zwierząt Instytut Zoologii Uniwersytet Jagielloński Gronostajowa 9, 30-387 Kraków : (+12) 664-53-73 E-mail: [email protected] OCENA rozprawy doktorskiej Pana magistra inżyniera Marcina DĄBROWSKIEGO pt. "Wpływ substancji neuroaktywnych na wybrane białka błonowe” Układ nerwowy w swojej podstawowej strukturze (ogólnej budowie komórki nerwowej), jak i funkcji (generowaniu potencjału czynnościowego), wydaje się niesłychanie prosty. Jego skomplikowanie zaczyna się na styku wzajemnej neuronalnej komunikacji, czy też wpływie różnych substancji na jego aktywność. Do zrozumienia mechanizmu tych wzajemnych oddziaływań konieczna jest znajomość budowy błony neuronalnej, głównie jednak specyficznego rodzaju białek błonowych, budujących kanały jonowe, w tym szczególnie tego najważniejszego przepuszczalnego dla jonów sodu, którego aktywność regulowana jest zmiennym napięciem elektrycznym błony. Przedstawiona do recenzji praca bada mechanizm wpływu trzech substancji neuroaktywnych (alfa toksyny z jadu skorpionów oraz dwu pyretroidów: permetryny i deltametryny) na aktywność napięciowo zależnych kanałów sodowych aksonu olbrzymiego karaczana amerykańskiego Periplaneta americana. Wprawdzie literatura przedmiotu bogata jest w doniesienia dotyczące badanego tematu, to jednak ciągle nie do końca jest ona wystarczająca do opracowania skutecznych metod stosowania insektycydów, czy też wykorzystania otrzymanych wyników w szeroko pojętej farmakoterapii. Praca doktorska Pana mgr Dąbrowskiego nie wykorzystuje jednak, jak można by przypuszczać, tylko narzędzi klasycznej elektrofizjologii. Autor uważa i słusznie, że do pełnego zrozumienia mechanizmów zachodzących na poziomie badanego białka, konieczne jest wprowadzenie nowych metod: komputerowej symulacji białek, ale także dla obrazowania wzajemnych oddziaływań kanał-toksyna, techniką mikroskopii sił atomowych. Taki wachlarz metodyczny pozwala lepiej zrozumieć dynamikę molekularną i mechanizmy powiązania badanej substancji na poziomie analizowanego kanału jonowego. Podkreślam ten nowatorski element metodyczny, jako bardzo ważny w tej pracy, bowiem ciągle zbyt nieśmiało wprowadzany jest on do badań przez większość rodzimych neuronaukowców. A szkoda, gdyż podejście modelowe, szczególnie w oparciu o wyniki eksperymentalne, może być ich cennym uzupełnieniem. Piszę to z pełną odpowiedzialnością i nieukrywaną zazdrością, doskonale bowiem zdaję sobie sprawę, jak ważne, a bardzo często konieczne są niekonwencjonalne narzędzia matematyczne fizyczne (modelowe) przy analizie wyników aktywności neuronalnej, szczególnie jeśli opisuje ona tak skomplikowane wzajemne powiązania, jak te będące przedmiotem pracy doktorskiej Pana mgr Dąbrowskiego. Autor postawił sobie, bardzo jasno sprecyzowane cele pracy. W pierwszym i drugim, wykorzystuje duże doświadczenie elektrofizjologiczne jednego z promotorów pracy (prof. Stankiewicz), postanawia zbadać wpływ alfa toksyny z jadu skorpiona na aktywność bioelektryczną neuronu karaczana, przy podawanym zmiennym napięciu. Zamierza także określić wzajemną zależność alfa toksyny i powszechnie stosowanego insektycydu (pyretroidu) na badaną aktywność neuronalną. W kolejnych zadaniach, wykorzystuje doświadczenie drugiego promotora (prof. Nowaka), i buduje na poziomie aminokwasów, model molekularnego oddziaływania badanej toksyny z kanałem sodowym, badając wpływ występowania i kierunku pola elektrycznego na dynamikę tych oddziaływań, aby w końcu przy wykorzystaniu mikroskopii sił atomowych zobrazować zmiany żywego neuronu pod wpływem stosowanych neurotoksyn. Przedmiot podjętych badań jest zatem ważny i aktualny, a postawione cele są bardzo jasne, ambitne, ale i bardzo trudne. Autor bowiem, co warto podkreślić, w swojej pracy poszukuje najlepsze (optymalne) dopasowanie tworzonych modeli do wyników otrzymanych w realnym eksperymencie elektrofizjologicznym. Takie podejście, wymaga sporo czasu, wytrwałości i odporności na niepowodzenia, które towarzyszą tego typu analizom. Praca nie ma typowego układu rozprawy doktorskiej, choć nie jest to zarzut. Rozpoczyna ją dobrze napisane zwięzłe streszczenie z głównymi wnioskami i słowami kluczowymi. Obszerny wstęp wprowadza czytającego w badane zagadnienia, szczególnie stosowną metodykę, którą autor opisuje w oparciu o dobrze dobraną literaturę. Liczne schematy i ryciny, pozwalają lepiej zrozumieć, szczególnie nie przez fizyka, stosowane narzędzia metodyczne. Autor wyjaśnia zasadność podjęcia tematu, wskazuje na jego złożoność, która stała się inspiracją do dodatkowego metodycznego podejścia w celu 2 lepszej interpretacji i pełniejszego wyjaśnia wcześniej uzyskanych i własnych wyników badań elektrofizjologicznych. Wstęp kończą jasno sformułowane, jak wyżej, cele pracy. Kolejne rozdziały to pełne opisy stosowanych metod do realizacji wcześniej postawionych celów badawczych, przedstawienie otrzymanych wyników, ich dyskusja oraz wypływające z nich wnioski. Taki układ właśnie nazywam nietypowym. Stosowana metodyka badawcza w zakresie badań elektrofizjologicznych nie budzi moich zastrzeżeń. Jest ona powszechnie stosowana, a grupa badawcza prof. Stankiewicz należy do jedynej w Polsce, która z dużym naukowym powodzeniem, kontynuuje Toruńskie tradycje elektrofizjologii bezkręgowców. Pan mgr Dąbrowski w logicznie zaplanowanych, a następnie konsekwentnie realizowanych poszczególnych etapach badań elektrofizjologicznych wykazał, że efekt działania testowanej toksyny skorpiona na neurony karaczana jest napięciowo zależny. Zwiększanie częstotliwości stymulacji aksonu powodowało zmniejszenie efektu działania toksyny. Autor tłumaczy to zjawisko częstą aktywacją (ruchem) czujnika napięciowego kanału sodowego. Ruch ten mógł skutecznie ograniczać wiązanie się toksyny z odpowiednim dla niej receptorem w kanale sodowym, którego lokalizacja jest blisko „czujnika”, czyli segmentu S4, co w konsekwencji mogło ograniczać wiązanie toksyny z miejscem receptorowym i jej zmiejszone działanie. Na tym etapie badań autor zauważył jednak, ciekawe zjawisko rytmicznych oscylacji czasu trwania potencjału czynnościowego. Ciekaw jestem, jaki mechanizm jonowy może temu towarzyszyć oraz czy autor znajduje, jakieś fizjologiczne wytłumaczenie (znaczenie) tych rytmicznych oscylacji? Kolejny etap badań elektrofizjologicznych miał na celu sprawdzenie wzajemnej funkcjonalnej zależności działania permetryny od alfa toksyny. Po testowym znalezieniu efektywnego stężenia toksyny skorpiona, autor w jednoznaczny sposób wykazał, że wzmaga ona, nawet dwukrotnie, działanie powszechnie stosowanego insektycydu, jakim jest permetryna. Efekt ten nie jest jednak wynikiem kumulacji stężeń obu związków, bowiem samo podanie alfa toksyny w testowanym stężeniu, nie miało wpływu na depolaryzację badanego aksonu. Mechanizm zwiększonego powinowactwa permetryny do kanału sodowych w obecności alfa toksyny, autor tłumaczy wzajemnym pozytywnym allosterycznym oddziaływaniem dwu miejsc receptorowych (3 i 7) badanych neurotoksyn. Kolejny cykl badań dotyczy drugiego etapu pracy doktorskiej, modelowania oddziaływań neurotoksyn z kanałem sodowym i badania zmiany morfologii błony komórkowej neuronu po podaniu neurotoksyn, metodą mikroskopii sił atomowych. Autorowi udało się zbudować 3 model domeny IV napięciowo zależnego kanału sodowego i cały kanał sodowy, który zdaniem doktoranta, może być wykorzystywany do symulacji wpływu oddziaływań badanych substancji z kanałem. Stworzony przez autora model kanału pozwolił określić zmianę jego dynamiki pod wpływem pola elektrycznego, która objawiała się zmianą charakteru i siły powiązania toksyny z kanałem. Słowem, stworzony z dużym sukcesem przez autora model kanału otwiera zupełnie nowe możliwości badania jego kinetyki w powiązaniu z wpływem na jego aktywność różnych peptydów. Wyniki ostatniego etapu zaplanowanych badań należy potraktować pilotażowo, jako dobry „zaczyn” do dalszych prób ulepszania metody obrazowania powierzchni żywego neuronu. Sam autor w sposób krytyczny, a zatem naukowo, bardzo dojrzały, ocenia ich rezultaty. Wprawdzie udało się uzyskać, jak sam to określa „unikatowy obraz żywego neuronu”, lecz otoczonego osłonką mielinową komórek Schwanna, które niestety i na cale szczęście dla fizjologii neuronu, maskują (izolują) samą błonę neuronu. Wprawdzie po podaniu alfa toksyny nie obserwowano żadnych morfologicznych różnic, to jednak permetryna powodowała silne zmiany obszaru neuronu, badanego siłami mikroskopii atomowej. Efekt ten, jak krytycznie ocenia autor nie koniecznie jednak, musi być związany z wpływem samej permytryny, ale związków towarzyszących stosowanej metodzie. Prezentowane przez autora wyniki badań, oprócz części opisowej, zawierają także bogatą dokumentację graficzną, dodatkowo ilustrującą i potwierdzającą otrzymane rezultaty, które autor w sposób ostrożny dyskutuje w oparciu o bogatą i dobrze dobraną literaturę. W podsumowaniu, chciałbym wyraźnie podkreślić, że autor wynikami swojej pracy, stosując konsekwentnie precyzyjne i skomplikowane metodycznie procedury, osiągnął zamierzone cele. Doktorat Pana Dąbrowskiego to pionierskie, bardzo obszerne, solidne i cenne opracowanie, uzupełniające dotychczasowe wyniki, otrzymane w klasycznych eksperymentach elektrofizjologicznym, dotyczące błonowych mechanizmów na poziomie pojedynczych kanałów jonowych, wzajemnych interakcji neurotoksyna - kanał. Z obowiązku recenzenta zmuszony jestem, także wskazać pewne uchybienia pracy, które nie dotyczą jej części merytorycznej, a jedynie formy edytorskiej. Nie będę ich wymieniał w szczegółach, proponuję jednak, aby autor z uwagą raz jeszcze ją przeczytał i sam je z pewnością dostrzeże. Zwracam uwagę na brak konsekwencji w cytowaniu prac w tekście, raz autor stosuje kryterium daty ukazania się publikacji (od najstarszej do 4 najnowszej), a innym razem kryterium alfabetyczne. Brakuje w spisie literatury pracy promotora (W. Nowak, 2014) na którą autor powołuje się str.30 i 33. Nie ma powodu także umieszczać inicjałów imion autorów przy ich nazwiskach. Niektóre figury są mało czytelne (Rys. 1.3.4), a na kilku brakuje pełnego opisu np. skali (Rys.1.2.2), zaznaczenia koloru (Rys.1.2.8). Jest też sporo literówek, również przy nazwiskach (str.38 Bielkmar czy Bjelkmar?), niezręczności językowych np. co oznacza, że cyt. „Kompleks był udokładniony…” str. 40. Lepiej mówić o miejscach niż „residuach” Rys. 1.3.8. Nie ma też konsekwencji w pisaniu angielskich określeń, raz i tak powinno być, autor pisze je kursywą, a innym razem liternictwem prostym. Nie ma „modów” drgań, tylko są moduły str.50. Te drobne uwagi, w żaden sposób oczywiście nie wpływają, na bardzo wysoką wartość merytoryczną recenzowanej pracy. Uważam zatem, że rozprawa doktorska spełnia wymogi określone w art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 z późn. zm.). Stanowi ona oryginalne rozwiązanie przez autora problemu naukowego i wskazuje na Jego ogólną wiedzę teoretyczną w dyscyplinie naukowej, której dotyczy recenzowana praca, a także umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Zwracam się zatem do Rady Naukowej Instytutu Fizyki Uniwersytetu Mikołaja Kopernika o dopuszczenie Pana mgr inż. Marcina Dąbrowskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Prof. dr hab. Marian H. Lewandowski Kraków dnia 04. listopda 2015. 5