Pobierz opis

Jowita Samanta Niczyporuk
[email protected]
Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut badawczy w Puławach
Zakład Chorób Wirusowych Drobiu
Charakterystyka molekularna krajowych szczepów adenowirusów występujących u kur
oraz ich wpływ na skuteczność szczepień przeciwko chorobie Mareka
Intensywna, wielkotowarowa produkcja drobiarska obecnie jest prowadzona w całym
kraju w tym na terenie woj. lubelskiego. Znaczne zagęszczenie ptaków na ograniczonej
powierzchni stwarza możliwość zagrożenia epidemiologicznego, czego konsekwencją są
straty ekonomiczne. Największe niebezpieczeństwo stanowią choroby o etiologii wirusowej,
które mogą być przyczyną choroby lub zakażeń towarzyszących. Do takich czynników należą
adenowirusy ptasie.
Adenowirusy ptasie są wirusami należącymi do rodziny Adenoviridae rodzaju
aviadenovirus. Ze względu na ich właściwości antygenowe zostały podzielone na trzy grupy.
Grupa I składa się z 5 gatunków (A-E) zawierających łącznie 12 serotypów występujących u
ptaków, której przedstawicielem jest wirus odpowiedzialny za wywoływanie wtrętowego
zapalenia wątroby u kurcząt (IBH - inclusion body hepatitis). Do grupy II należą wirusy
odpowiedzialne za krwotoczne zapalenie jelit indyków (HE - haemorhagic enteritis), chorobę
marmurkowatej śledziony bażantów (MSB - marble spleen disease) i syndrom puchliny
osierdzia (HHS - hydropericardium, hepatitis syndrome). Do grupy III należy wirus będący
czynnikiem etiologicznym syndromu spadku nieśności kur (EDS 76 - egg drop syndrome).
W ostatnich latach problem zakażeń adenowirusowych u drobiu zaczął narastać dlatego
stał się tematem wielu debat naukowych. Infekcje adenowirusowe mogą być zarówno
infekcjami asymptomatycznymi, czynnikiem wikłającym inne schorzenia u ptaków lub też
wywoływać je samodzielnie jako czynnik chorobotwórczy. Ponadto adenowirusy mogą być
czynnikiem immunosupresyjnym i wpływać na skuteczność szczepień. Dlatego też obraz
chorobowy nie jest jednoznaczny. Większość szczepów adenowirusów należących do grupy I
oraz II można bezpośrednio powiązać z daną jednostką chorobową, jak w przypadku serotypu
1 adenowirusów ptasich (FAdV-1) powodującego zapalenie oskrzeli u przepiórek. Atrofia
torby Fabrycjusza grasicy i śledziony pojawia się w przypadku zakażeń serotypem 1, 4 oraz 8,
jak również nieoznaczonymi serotypowo adenowirusami. Wirulentne adenowirusy wykazują
1
tropizm do limfocytów powodując wywołanie odpowiedzi komórkowej oraz humoralnej.
Natomiast w przypadku pozostałych adenowirusów z grupy I nadal nie udało się wykazać ich
właściwości chorobotwórczych.
W związku z tym, że prowadzone dotychczas prace badawcze w kierunku
adenowirusowych zakażeń drobiu nie są pełne, problem ten jest wciąż aktualny a praca nad
tymi wirusami będzie miała znaczący wkład w rozwój tego tematu.
Wirus choroby Mareka należący do rodziny Herpesviridae, rodzaju Mardivirus wywołuje
nowotworową chorobę drobiu. Szczepienia przeciwko tej chorobie wykonuje się najczęściej u
jednodniowych piskląt tuż po wylęgu lub u 18-dniowych zarodków (in ovo). Ostatnio
stwierdzone przypadki obniżenia skuteczności szczepień i występowania zachorowań u
szczepionych ptaków mogą być spowodowane przez dodatkowy czynnik obniżający
skuteczność szczepień na przykład zakażenie adenowirusami ptasimi.
Celem przeprowadzonych badań będzie analiza molekularna krajowych szczepów
adenowirusów
izolowanych
od
kur
oraz
przeprowadzenie
analizy
geograficznej
występowania tych wirusów na terenie Polski ze szczególnym uwzględnieniem woj.
lubelskiego. Ponadto zostanie określona korelacja zmienności badanego fragmentu genomu
adenowirusów z ich chorobotwórczością oraz właściwościami antygenowymi. Badanie
struktury fragmentu DNA pozwoli także zwiększyć możliwości diagnostyczne badań.
Opracowane nowoczesne, czułe, skuteczne i szybkie metody wykrywania zakażeń tymi
wirusami pozwolą na ich pełną charakteryzację.
Planowana analiza pozwoli na opracowanie metod identyfikacji adenowirusów
skupionych na szczepach występujących w Polsce oraz na terenie woj. lubelskiego. Praca
dostarczy nowych danych na temat budowy poszczególnych szczepów adenowirusów oraz
genu hexon, który jako jedyny gen adenowirusów został najlepiej poznany. Opracowanie
wykrywania i różnicowania szczepów adenowirusów metodą własną pozwoli na wdrożenie
jej jako procedury badawczej w zakładzie Chorób Wirusowych Drobiu do rutynowej
diagnostyki tych wirusów. Zaplanowane badania pozwolą na określenie występowania
interakcji pomiędzy szczepami szczepionkowymi wirusa choroby Mareka i adenowirusami
ptasimi oraz wyjaśnią czy zakażenie adenowirusami ma wpływ na szczepienia przeciwko
chorobie Mareka u kurcząt.
Nowoczesne techniki badawcze oparte na metodach biologii molekularnej: PCR, Nested –
PCR oraz Real – Time PCR umożliwią przeprowadzenie analizy molekularnej krajowych
szczepów adenowirusów izolowanych od kur oraz określenie występowania poszczególnych
2
serotypów w różnych regionach Polski oraz w woj. lubelskim. Należy podkreślić fakt, że są to
pierwsze i jedyne tego typu badania przeprowadzane w Polsce.
Układ planowanych badań
1. Zebranie kolekcji szczepów adenowirusów pobranych od kur z terenu całego kraju.
2. Izolacja materiału genetycznego zgromadzonych szczepów adenowirusów.
3. Wybór sekwencji docelowej dla PCR (optymalna sekwencja- zawierająca fragmenty
konserwatywne umożliwiające dostosowanie pary starterów dla wszystkich szczepów
oraz fragmenty zmienne umożliwiające identyfikację poszczególnych szczepów
metodami genotypowania).
4. Opracowanie PCR i nested – PCR dla adenowirusów.
5. Sekwencjonowanie produktów reakcji oraz analiza wyników w celu określenia
przynależności szczepów do określonych serotypów poprzez porównanie do
sekwencji szczepów referencyjnych dostępnych w bazie danych GeneBank.
6. Wykonanie
analizy
serologicznej
kolekcji
adenowirusów
metodą
(AGID)
immunodyfuzji w żelu agarowym.
7. Analiza geograficznego rozmieszczenia serotypów adenowirusów występujących u
kur na terenie Polski.
8. Analiza i porównanie wyników PCR, sekwencjonowania oraz analiz serologicznych.
Określenie korelacji pomiędzy wynikami różnych metod. Na podstawie uzyskanych
wyników dobór najlepszej metody do szybkiej identyfikacji adenowirusów ptasich.
9. Opracowanie Real-time PCR.
10. Badanie interakcji pomiędzy wybranymi szczepami adenowirusowymi a szczepami
szczepionkowymi CVI988 Rispens i HVT wirusa choroby Mareka w warunkach in
vitro i in vivo.
Realizowane w pracy doktorskiej badania pozwolą na ocenę występowania zakażeń
adenowirusami u drobiu na terenie Polski i zagrożenia epizootycznego w woj. lubelskim.
Ponadto charakterystyka różnych serotypów adenowirusów na poziomie różnic w ich
genomie
wniesie
istotne
informacje
pozwalające
na
poznanie
ich
właściwości
chorobotwórczych. Opracowane metody diagnostyczne oparte na najnowszych technikach
pozwolą na wczesną i szybką diagnostykę zakażeń adenowirusami oraz podjęcie kroków w
celu obniżenia strat nimi spowodowanych. Badania te pozwolą na analizę filogenetyczną
szczepów występujących u drobiu i umożliwią ustalenie ich pochodzenia i pokrewieństwa z
3
innymi szczepami adenowirusów występującymi na terenie kraju i Unii Europejskiej, a być
może także pozwolą na wyjaśnienie podstaw genetycznie zróżnicowanej chorobotwórczości
adenowirusów dla ptaków.
4