Próba biała

IDENTYFIKACJA CUKRÓW PROSTYCH I ZŁOŻONYCH
REAKCJAMI KOLORYMETRYCZNYMI
HYDROLIZA SACHAROZY
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z charakterystycznymi barwnymi reakcjami
węglowodanów oraz ich identyfikacje w otrzymanych zestawach jednoi dwuskładnikowych zgodnie z dołączonym schematem. Dodatkowym celem jest
przeprowadzenie enzymatycznej reakcji hydrolizy sacharozy.
Materiał badany:
Mieszaniny węglowodanów, 1- i 2-składnikowe
Szkło i sprzet laboratoryjny:
Zestaw probówek
Pipety automatyczne
Pipety Pasteura
Statyw na probówki
Łaźnia wodna
1. Analiza jakościowa mieszanin węglowodanów
Próba Molisha
Zasada metody
W obecności stężonych kwasów t.j. siarkowy(VI) lub solny w temperaturze
pokojowej cukry ulegają odwodnieniu tworząc furfurylowe pochodne. Odwodnienie
pentoz prowadzi do przekształcenia ich w furfural (1), natomiast heksoz
w 5-hydroksymetylenofurfural (2).
OH H H
HC
C
HC
C
OH
H+
OH
OH
HC
H
HC
C
OH
HC
C
3 H2O
O
(1)
C
H
O
furfural
OH H H2C
C
CH
O
pentoza
HC
HC
H+
OH
OH
HC
H
heksoza
H2C
OH
HC
C
HC
C
OH
O
3 H2O
O
1
C
H
O
5 - hydroksymetylenofurfural
(2)
Odwodnieniu najłatwiej ulegają pentozy, wśród heksoz natomiast ketozy. Disacharydy
reagują znacznie wolniej niż monosacharydy aczkolwiek znacznie szybciej niż
polisacharydy. Powstałe pochodne furfurylowe kondensują z różnymi fenolami,
chinonami lub aminami aromatycznymi (naftolem, tymolem, rezorcyną) tworząc barwne
produkty wykorzystywane do wykrywania cukrów. W przypadku reakcji Molisha
z -naftolem wynikiem kondensacji jest produkt o barwie fioletowej (3).
O
OH
C
H
H+
+
2
O
O
R
OH
(3)
O
R: -H, -CH 2OH
-naftol
C
- H2 O
R
pochodna cukru
produkt kondensacji
ciemnofioletowy
Próba Molisha jest najbardziej ogólną reakcją na węglowodany. Ujemny jej wynik
pozwala jedynie wykluczyć obecność cukrowca, dodatni zaś nie jest wystarczjący do
stwierdzenia jego obecności, ze względu na jej małą specyficzność, gdyż w jej wyniku
barwny produkt dają również aldehydy, aceton, kwas szczawiowy, mrówkowy lub
cytrynowy.
Odczynniki:
10% etanolowy roztwór -naftolu
Stężony H2SO4
Wykonanie:
Do 1 ml badanego roztworu cukru dodać 2 krople 10% etanolowego roztworu -naftolu
i dokładnie wymieszać. Następnie lekko przechylić probówkę, powoli i bardzo ostrożnie
po ściankach wprowadzić około 1ml stężonego H2SO4, tak aby nie zamieszać obydwu
roztworów. Powstający na granicy warstw czerwonofioletowy pierścień świadczy
o dodatnim wyniku próby.
Próba Lugola – wykrywanie polisacharydów
Zasada metody
Polisacharydy w odróżnieniu od oligo- i monosacharydów tworzą z jodem barwne
kompleksy, co pozwala na ich jednoznaczne odróżnienie, gdyż kompleksy z jodem mogą
tworzyć tylko cząsteczki odpowiednio duże i o uporządkowanej strukturze. Roztwory
skrobi oraz innych polisacharydów pod wpływem wodnego roztworu jodu przyjmują
intensywnie niebiesko-granatowe barwy. W wyniku tej reakcji następuje adsorpcja
2
kanałowa jodu przez polisacharydy, który wnikając do kanału utworzonego przez
helikalnie skręcone łańcuchy węglowodanów jest przetrzymywany przez tlen przy
pierwszym i czwartym atomie węgla każdej cząsteczki glukozy (Rys.1.). Jedna
cząsteczka jodu przypada na sześć reszt glukozylowych, czyli na jeden skręt helisy.
Oddziaływanie jednostek
polisacharydu z cząsteczkami jodu ma charakter
niekowalencyjny, opierajacy się głównie na siłach Van der Waalsa i wiązaniach typu
przeniesienia ładunku (charge transfer). Wzdłuż wytworzonego w ten sposób łańcucha
drobin jodu przemieszczają sie elektrony, efektem tej delokalizacji elektronowej jest silne
pochłanianie światła przez układ. Obserwowana barwa zależy od budowy i stopnia
rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza z jodem daje zabarwienie intensywnie
niebieskie. Barwa kompleksów jodu z polisacharydami o krótszych łańcuchach zmienia
sie na fioletowoczerwoną (amyloza) i czerwoną (dekstryny). Glikogen daje kompleks
o barwie czerwonej. Ogrzewanie powoduje rozkręcenie się helisy, jod zostaje uwolniony
co jest przyczyną zaniku zabarwienia.
Rys. 1. Kompleks skrobi z jodem (Garrett i Grischam 1999, Koolman i Röhm 2005)
Odczynniki:
Roztwór I2 w KI - płyn Lugola (2g KI rozpuszczono w 5 ml H2O, w tym roztworze
rozpuszczono 1g jodu i uzupełniono wodą do 300 ml. Przed użyciem rozcieńczono
150 razy)
Wykonanie:
Do 1 ml badanego roztworu dodać trzy krople roztworu jodu (I2) w jodku potasu (KI).
W obecności skrobi powstaje ciemnoniebieskie zabarwienie. Następnie próbkę, w której
zaobserwowano niebieską barwę, ogrzać do wrzenia na łaźni wodnej, zaobserwować czy
zabarwienie znika, po czym próbkę schłodzic pod bieżącą wodą i zaobserwować czy
zabarwienie powraca.
Próba Biala
Zasada metody:
Pentozy podczas ogrzewania ze stężonym kwasem solnym ulegają odwodnieniu
przekształcając się w furfural, który w reakcji z orcyną i w obecności jonów żelaza(III)
tworzy kompleks o barwie zielononiebieskiej (4). Heksozy natomiast przekształcając się
w hydroksymetylofurfural w tych samych warunkach reaguję znacznie słabiej dając
kompleks o barwie zielonobrązowej.
3
O
HO
OH
O
O
+
H
+
2
HO
C H
O
C
- 2 H2O
CH3
R
CH3
R: -H, -CH 2OH
CH3
(4)
R
pochodna cukru
orcyna
O
produkt kondensacji
zielononiebieski
Odczynniki:
Odczynnik Biala: 0,2% roztwór orcyny w 20% roztworze HCl
1% roztwór FeCl3 w H2O
Wykonanie:
Do probówki wprowadzić 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% roztworze HCl a następnie
dodać 1 krople 1% FeCl3 i 0,5 ml badanej próbki. Całość wymieszać i ogrzewać we
wrzącej łaźni wodnej przez 5 min.
Reakcja Seliwanowa
Zasada metody:
Reakcja Seliwanowa jest wykorzystywana do odróżnienia ketoz od aldoz na zasadzie
różnicy w szybkości odwadniania tych cukrów. Ketozy ogrzewane w 12% HCl
w temperaturze 100oC w ciągu 30 sekund ulegają odwodnieniu do
5-hydroksymetylofuranu. W tych warunkach aldozy nie ulegaja odwodnieniu co pozwala
na ich zróżnicowanie od heksoz. Powstały 5-hydroksymetylenofurfural kondensuje
z rezorcyną tworząc kompleks o barwie czerwonowiśniowej (5).
! Użycie kwasu bardziej stężonego jak również wydłużenie czasu ogrzewania lub
podwyższenie temperatury może sprawić iż reakcji tej ulegną również aldozy.
! Próba ta daje również wynik pozytywny w przypadku wielocukrów zawierajacych
ketozy.
O
HO
O
H
O
C
- 3 H2O
R
O
R: -H, -CH 2OH
rezorcyna
O
+
+
2
HO
C H
OH
R
pochodna cukru
produkt kondensacji
czerwonowisniowy
Odczynniki:
Odczynnik Seliwanowa: 2% roztwór rezorcyny w etanolu
12% HCl
4
(5)
Wykonanie:
Do 0,5 ml badanego roztworu cukru dodać 1 ml 12% roztworu HCl oraz kroplę 2%
roztworu rezorcyny w etanolu. Po wymieszaniu zawartości probówki wstawić do wrzącej
łaźni wodnej na około 30 sekund, a następnie szybko oziębić w strumieniu zimnej wody.
Reakcja Wohlkego
Zasada metody:
Podczas ogrzewania roztworów dwucukrów redukujących (laktoza, maltoza) z
amoniakiem w obecności KOH powstaje czerwone zabarwienie. Cukry proste natomiast
tych samych warunkach tworzą żółto-brązowy produkt.
Odczynniki:
stężony roztwór amoniaku
3% roztwór KOH w H2O
Wykonanie:
Do 1 ml badanej próbki dodać 1 ml stężonego roztworu amoniaku i 3 krople 3% KOH.
Wstawić do łaźni wodnej na kilka minut i obserwować powstałe zabarwienie.
Próba Barfoeda
Zasada metody:
Reakcja ta pozwala na odróżnienie mono- i disacharydów, gdyż wzrost stężenia jonów
wodorowych powoduje zmniejszenie zdolności redukcyjnych węglowodanów.
W środowisku lekko kwaśnym przy niskim stężeniu cukrów i krótkim czasie ogrzewania
monosacharydy
wykazuja
właściwości
redukujące,
natomiast
disacharydy
w których wolna grupa karbonylowa jest mało reaktywna dają wynik pozytywny po
dłuższym ogrzewaniu, kiedy ulegają hydrolizie i
zostaje rozerwane wiązanie
glikozydowe.
Odczynniki:
odczynnik Barfoeda: 24 g octanu miedzi(II) rozpuszczono w 450 ml gorącej wody.
Dodano 25 ml 8,5% roztworu kwasu mlekowego. Po rozpuszczeniu soli odczynnik
oziębiono i uzupełniono w kolbie miarowej do objętości 500 ml.
5
Wykonanie:
Do 0,5 ml badanej próbki dodać 1 ml odczynnika Barfoeda i ogrzewać we wrzącej łaźni
wodnej przez 3 minuty. Jeśli po tym czasie nie wytrącił się osad probówkę ponownie
umieścić w łaźni wodnej i ogrzewać 10 minut. Pojawienie się czerwonego ceglastego
osadu Cu2O w próbce po ok. 3 min. ogrzewania potwierdza obecność monosacharydów,
jeśli osad pojawi się po kilkunastu minutach potwierdza to obecność disacharydu.
Próba Tollensa
Odczynnik Tollensa otrzymuje się dodając wody amoniakalnej do roztworu azotanu(V)
srebra (6). Powstający brunatny osad tlenku srebra rozpuszcza się w nadmiarze amoniaku.
Powstaje jon kompleksowy diaminasrebra(I) [Ag(NH3)2]+ (7). Wprowadzenie do
odczynnika Tollensa cukru o właściwościach redukujących (z aktywną grupą
aldehydową) powoduje redukcję jonów srebra(I) do metalicznego srebra tworzącego
„lustro srebrowe” (8).
2 AgNO 3
Ag 2O
+
+
+
NH3
4 NH3
+
Ag 2O
H2O
H2O
+
2 [Ag(NH 3)2]
O
(6)
2 NH 4NO 3
+
+
-
(7)
2 OH
O
C
H
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
+
2 [Ag(NH 3)2]
+
CH2 OH
C
OH
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
+
2 Ag
+
4 NH3
(8)
CH2 OH
Odczynniki:
5% roztwór azotanu(V) srebra
10% roztwór amoniaku
Wykonanie:
Do probówki odmierzyć 1 ml 5% roztworu azotanu(V) srebra AgNO3, następnie
dodawać po kropli 10% roztworu amoniaku do momentu, aż powstający osad AgOH
rozpuści się w nadmiarze amoniaku. Dodać 1ml badanego roztworu cukru i dokładnie
wymieszać po czym wstawić do łaźni wodnej i obserwować wynik reakcji.
6
2. Enzymatyczna hydroliza sacharozy
Sacharoza jest disacharydem złożonym z dwóch reszt monosacharydów połączonych ze
sobą wiazaniem -1,2-glikozydowym. Sacharoza zbudowana jest z reszty glukozy ( -Dglukopiranozy) oraz fruktozy ( -D-fruktofuranozy) (9).
CH2OH
O H HO H2C
H
1
OH H
HO
2
O
(9)
H HO
CH2 OH
O
H
H
OH
OH H
sacharoza
-D-glukopiranozylo-(1
2)-
- D-fruktofuranoza
W środowisku kwaśnym jak również pod wpływem enzymu zwanego inwertazą
sacharoza bardzo łatwo ulega hydrolizie do fruktozy i glukozy (10).
C12H22O11
+
H2O
HCl, enzymy
C6H12O6
sacharoza
glukoza
+
C6H12O6
(10)
fruktoza
Drożdże piekarskie zawieraja enzym zwany -inwertaza, który katalizuje hydrolize
wiązania -glikozydowego rozkładajac sacharoze na glukoze i fruktozę.
Wykonanie:
Do trzech probówek wprowadzić po 0,5 ml zawiesiny drożdży w wodzie. Do pierwszej
(próba kontrolna) dodać 0,5 ml H2O. Drugą wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 min.
Po upływie tego czasu do probówek drugiej i trzeciej dodać po 0,5 ml roztworu
sacharozy i wymieszać. Następnie z każdej probówki pobrać po 0,5 ml roztworu
i przenieść do oddzielnych probówek, po czym wykonac próbę Benedicta zgodnie
z procedura podana poniżej.
Tabela 1
Nr probówki
Zawiesina drożdży [ml]
H2O [ml]
Ogrzewanie/czas
Sacharoza [ml]
1
0,5
0,5
Temp. Pok./10 min.
-
7
2
0,5
100oC/10 min.
0,5
3
0,5
100oC/10 min.
0,5
Próba Benedicta
Zasada metody:
Próba Benedicta należy do najbardziej specyficznych i czułych prób redukcyjnych na
cukry. Wolne grupy aldehydowe węglowodanów w środowisku zasadowym wykazują
właściwości redukujące. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa redukuje jony
miedzi(II) z odczynnika Benedicta do jonów miedzi(I). Powstający w tej reakcji Cu 2O w
zależności od ilości cukru redukujacego ma różne zabarwienie (od zielonożółtego przez
pomarańczowe do czerwonego).
Odczynniki:
odczynnik Benedicta: 173 g cytrynianu sodu i 90 g bezwodnego węglanu sodu
rozpuszczono w 60 ml gorącej wody. Po przesączeniu roztworu, do przesączu dodano
100 ml 17,3% roztworu CuSO4 · 5H2O. Mieszaninę uzupełniono w kolbie miarowej
do 1000 ml.
Wykonanie:
Do każdej probówki dodać po 2,5 ml odczynnika Benedicta, następnie wszystkie
probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 min. Zaobserwować, w której probówce
pojawia się zielone zabarwienie albo żółty, pomarańczowy lub czerwony osad (barwa
powstającego osadu zależy od ilości cukru redukującego w roztworze). Zaznaczyć w
których probówkach próba wypada ujemnie i wyjaśnic dlaczego.
CuSO 4
OH - , cytrynian
Cu(OH) 2
CuO
O
+
H2 O
O
C
H
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
+
2 CuO
CH2 OH
C
OH
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
+
Cu2O
CH2 OH
Tabela 2. Ocena ilosci cukru w próbce na podstawie próby Benedicta
Barwa
Niebieska
Zielona
Zielona
Zółtozielona
pomarańczowa
czerwona
(11)
Osad
brak
brak
osad
osad
osad
osad
8
Stężenie cukru [%]
0
0,1 – 0,3
0,5
1,0
1,5
>2,0
(12)
Schemat analizy jakościowej węglowodanów
+
PRÓBA MOLISHA
+
PRÓBA Z JODEM
BRAK CUKROWCA
+
PRÓBA TOLLENSA
SKROBIA
+
PRÓBA SELIWANOWA
+
PRÓBA BARFOEDA
SACHAROZA
+
PRÓBA BIALA
PRÓBA WOHLKEGO
GLUKOZA
FRUKTOZA
KSYLOZA
LAKTOZA
MALTOZA
PRÓBA SELIWANOWA
FRUKTOZA
GLUKOZA
9