spec model-II

Polyclonal Rabbit
Anti-Human
Lactoferrin/FITC
Nr kat. F 0395
Wydanie z 01.08.2003
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Produkt o nr kat. F 0395, Polyclonal Rabbit Anti-Human Lactoferrin/FILC, jest przeznaczony do użytku
w cytometrii przepływowej. Produkt o nr kat. F 0395 został zoptymalizowany w zakresie znakowania
laktoferryny wewnątrzkomórkowej, podczas stosowania wraz z zestawem Dako IntraStain Fixation and
Permeabilization Kit, nr kat. K 2311. Interpretację wyników powinien przeprowadzić pracownik uprawniony do
wykonywania takich badań, na podstawie historii choroby pacjenta oraz innych testów diagnostycznych.
Wstęp
Laktoferryna jest kationową glikoproteiną wiążącą żelazo, o masie cząsteczkowej 80 kDa; uważa się, że ma
działanie immunoregulacyjne, bakteriobójcze i bakteriostatyczne (1, 2). Laktoferryna w stanie wolnym
występuje w wydzielinach ssaków, takich jak mleko, łzy i nasienie (1). We krwi laktoferryna występuje we
wtórnych ziarnistościach granulocytów obojętnochłonnych oraz rzadko w monocytach i limfocytach (3).
W komórkach układu krwiotwórczego ekspresja jest ograniczona do kompartmentu dojrzewania
pomitotycznego linii granulocytarnej, począwszy od etapu mielocytu. Zdrowe oraz złośliwe mieloblasty
i promielocyty są laktoferryno-ujemne (4). W cytometrii przepływowej przeciwciała przeciwko laktoferrynie są
przydatne do podklasyfikacji ostrej białaczki szpikowej (AML) (4, 5), ponieważ laktoferryna wykazuje tendencję
do występowania w subpopulacji bardziej dojrzałych komórek szpiku.
Odczynnik dostarczony
Produkt o nr kat. F 0395 jest oczyszczoną frakcją immunoglobulin z surowicy odpornościowej królika,
skoniugowanych z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Koniugat jest dostarczany w postaci płynnej
w buforze zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3 o pH 7,2. Każda fiolka
zawiera 100 testów (10 µL koniugatu przeznaczone jest dla maksymalnie 106 leukocytów z normalnej ludzkiej
krwi obwodowej).
Stężenie immunoglobulin g/L: patrz informacja podana na etykiecie fiolki.
Wskaźnik F/P: E495 nm/E278 nm = 1,00 ± 0,15 odpowiada molowemu stosunkowi FITC/białko 4.
Immunogen
Laktoferryna wyizolowana z siary ludzkiej.
Swoistość
Przeciwciało reaguje z ludzką laktoferryną. Ślady przeciwciał powodujących skażenie zostały usunięte przez
absorpcję w fazie ciekłej z użyciem białek osocza ludzkiego.
Swoistość stwierdzono następująco:
Immunoelektroforeza krzyżowa: Przy zastosowaniu 12,5 µL nieskoniugowanego przeciwciała na 1 cm2 żelu z 2 µL
ludzkiego mleka pojawia się łuk precypitacyjny dla laktoferryny; przy zastosowaniu 2 µL ludzkiego osocza łuk
precypitacyjny nie pojawia się. Barwienie: barwnik Coomassie Brilliant Blue.
Immunologiczna mikroskopia elektronowa pozwala zaobserwować, że nieskoniugowane przeciwciało znakuje
wtórne ziarnistości granulocytów obojętnochłonnych, natomiast ziarnistości pierwotne, mitochondria, aparat
Golgiego i jądra dają reakcję ujemną (6).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować
z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych
azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu
w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, należy stosować
prawidłowe procedury postępowania.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze 2–8°C. Nie używać po dacie ważności podanej na etykiecie
fiolki. Jeśli odczynniki są przechowywane w innych warunkach niż podane powyżej, użytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pacjenta należy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne.
Nie przechowywać rozcieńczonych koniugatów. Jeśli wystąpi nieoczekiwany wzór barwienia, którego nie można
wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, że przyczyną może być problem
z przeciwciałem, należy niezwłocznie skontaktować się z Działem Pomocy Technicznej naszej firmy.
Procedura barwienia
(108077-002)
1.
Przenieść 50 µL (maksymalnie 106 komórek) zawiesiny komórek badanych (komórki pełnej krwi, szpiku
kostnego lub jednojądrzaste) do probówki.
2.
Dodać 100 µL odczynnika Dako IntraStain Reagent A (Fixation), nr kat. K 2311. Delikatnie wymieszać na
wytrząsarce w celu uzyskania zawiesiny komórek.
3.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4.
Dodać 2 mL zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) i delikatnie wymieszać na wytrząsarce.
F 0395/PL/MTH/01.08.03 str. 1/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
5.
Wirować 300 × g przez 5 minut, następnie zassać supernatant, pozostawiając około 50 µL płynu.
6.
Dokładnie wymieszać na wytrząsarce w celu uzyskania zawiesiny komórek, następnie dodać 100 µL
odczynnika Dako IntraStain Reagent B (Permeabilization), nr kat. K 2311. Dodać 10 µL odczynnika o nr
kat. F 0395. Delikatnie wymieszać na wytrząsarce w celu uzyskania zawiesiny komórek.
7.
Jako kontrolę ujemną stosować niereaktywne poliklonalne przeciwciało królicze skoniugowane z FITC.
8.
Inkubować w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
9.
Powtórzyć czynności wymienione w punktach 4 i 5.
10.
Ponownie wykonać zawiesinę peletek w płynie odpowiednim do analizy cytometrycznej, np. w 0,3 mL
1% paraformaldehydzie (utrwalacz) w 0,01 mol/L PBS o pH 7,4.
11.
Analizować w cytometrze przepływowym.
W celu zapewnienia kontroli odczynników i przygotowania próbek zalecane jest stosowanie podczas każdego
testu odpowiednich próbek kontroli dodatniej i ujemnej. Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromu są
wrażliwe na działanie światła, dlatego podczas procedury barwienia i do chwili wykonania analizy należy chronić
próbki przed działaniem światła.
Piśmiennictwo
1.
Német K, Simonovits I. The biological role of lactoferrin. Haematologia 1985; 18:3–12.
2.
Brock J. Lactoferrin: a multifunctional immunoregulatory protein? Immunol Today 1995; 16:417–9
3.
Butler TW, Heck LW, Huster WJ, Grossi CE, Barton JC. Assessment of total immunoreactive lactoferrin
in hematopoietic cells using flow cytometry. J Immunol Methods 1988; 108:159–70.
4.
Knapp W, Strobl H, Majdic O. Flow cytometric analysis of cell-surface and intracellular antigens in
leukemia diagnosis. Cytometry 1994; 18:187–98.
5.
Koníková E, Glasová M, Kusenda J, Babušíková O. Intracellular markers in acute myeloid leukemia
diagnosis. Neoplasma 1998; 45:282–91.
6.
Esaguy N, Águas AP, Silva MT. High-resolution localization of lactoferrin in human neutrophils: labeling
of secondary granules and cell heterogeneity. J Leukoc Biol 1989; 46:51–62.
Objaśnienia symboli
(108077-002)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Zużyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed światłem
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
F 0395/PL/MTH/01.08.03 str. 2/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17