spec model-II

Polyclonal Rabbit
Anti-Human
Lysozyme EC 3.2.1.17/FITC
nr kat. F 0372
Wydanie z 01.12.03
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Produkt o nr kat. F 0372, Polyclonal Rabbit Anti-Human Lysozyme EC 3.2.1.17/FITC, jest przeznaczony do
badań cytometrii przepływowej. Produkt o nr kat. F 0372 został zoptymalizowany w zakresie znakowania
lizozymu wewnątrzkomórkowego podczas stosowania wraz z zestawem Dako IntraStain Fixation and
Permeabilization Kit, nr kat. K 2311. Interpretację wyników powinien przeprowadzić uprawniony pracownik w
kontekście historii choroby pacjenta oraz innych testów diagnostycznych.
Wstęp
Lizozym, zidentyfikowany i nazwany przez Aleksandra Fleminga w 1922 r. oraz określony jako składnik tkanek
niszczący bakterie, jest wszechobecny wśród organizmów żywych, a u człowieka jego obecność wykazano w
kilku organach i płynach tkankowych (1). W zakresie układu krwiotwórczego, lizozym jest znany jako
wewnątrzkomórkowa cząsteczka markera szpikowego z selektywną ekspresją przez komórki linii granulomonocytowej. Normalne prekursory monocytowe wydają się najpierw syntetyzować lizozym, a następnie
mieloperoksydazę, podczas, gdy synteza mieloperoksydazy wydaje się poprzedzać lizozym w rozwoju
neutrofili, odzwierciedlając w ten sposób schemat ekspresji w ostrej białaczce szpikowej (AML). Uważa się, że
dojrzałe monocyty syntetyzują w sposób ciągły i wydzielają lizozym, podczas gdy granulocyty nie syntetyzują a
jedynie wydzielają wstępnie utworzony enzym (2).
Odczynnik dostarczony
Produkt o nr kat. F 0372 jest oczyszczoną frakcją immunoglobulin z surowicy odpornościowej królika
skoniugowanej z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Koniugat jest dostarczany w postaci płynnej
w buforze zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3 o pH 7,2. Każda fiolka
zawiera 100 testów (10 µL koniugatu przeznaczone jest dla maksymalnie 10 6 leukocytów z normalnej ludzkiej
krwi obwodowej).
Stężenie immunoglobulin g/L: zob. informację podaną na etykiecie fiolki.
Wskaźnik F/P: E495 nm/E278 nm = 1,00 ± 0,15 odpowiada molowemu stosunkowi FITC/białko 4.
Immunogen:
Lizozym wyizolowany z moczu pacjentów z białaczką monocytową.
Swoistość
Przeciwciało reaguje z ludzkim lizozymem. Ślady przeciwciał powodujących skażenie zostały usunięte przez
absorpcję fazy stałej z plazmą ludzką i białkami moczu.
Swoistość stwierdzono następująco:
Immunoelektrofereza krzyżowa: Pojawia się wyłącznie łukowaty osad lizozymu, jeżeli użyje się 12,5 L
nieskoniugowanego przeciwciała na cm kwadratowy powierzchni żelu względem 2 L stężonego moczu od
pacjentów z białaczką monocytową. Nie pojawia się żaden łukowaty osad, jeżeli przeciwciało jest badane
wobec 2 L normalnego ludzkiego osocza lub 2 L stężonego normalnego ludzkiego moczu. Barwienie:
Barwnik Coomassie Briliant Blue.
W badaniu immunocytochemicznym przeciwciało znakuje cytoplazmę w leukocytach wielojądrzastych i
monocytach lecz rzadko w limfocytach (3). Przeciwciało jest zalecane jako część panelu przeciwciał
stosowanych w immunofenotypowaniu ostrej białaczki w próbkach biopsji szpiku kostnego, ponieważ pomaga
w odróżnieniu AML od przypadków ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL)(4). International Lymphoma Study
Group (ILSG, Międzynarodowa Grupa Badań Chłoniaków) zaleca stosowanie przeciwciała jako część panelu
przeciwciał dla immunocytochemicznego immunofenotypowania nowotworów komórek histiocytowych i
dendrytycznych (5).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować
z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych
azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w
kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych należy stosować
prawidłowe procedury postępowania.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemnym miejscu w temp. 2-8 C. Nie używać po upływie daty ważności podanej na etykiecie
fiolki. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pacjenta należy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne.
Nie przechowywać rozcieńczonych koniugatów. Jeśli wystąpi nieoczekiwany wzór barwienia, którego nie można
wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, że przyczyną może być problem z
przeciwciałem, należy niezwłocznie skontaktować się z Działem Pomocy Technicznej naszej firmy.
Procedura barwienia
(107144-002)
1.
Przenieść 50 L (do 106 komórek) zawiesiny komórek badanych (komórki pełnej krwi lub szpiku
kostnego) do probówki.
F 0372/PL/MTH/01.12.03 p.1/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
2.
Dodać 100 L odczynnika Dako IntraStain Reagent A (Fixation), nr kat. K 2311. Delikatnie wymieszać
używając wytrząsarki, aby zapewnić powstanie jednorodnej zawiesiny komórek.
3.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4.
Dodać 2 mL zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) i delikatnie wymieszać przy pomocy
wytrząsarki.
5.
Wirować 300 x g przez 5 minut następnie zassać supernatant pozostawiając około 50 L płynu.
6.
Dokładnie wymieszać stosując wytrząsarkę, aby uzyskać zawiesinę komórek i dodać 100 L odczynnika
Dako IntraStain Reagent B (Permeabilization), nr kat. K 2311. Dodać 10 L F 0372. Delikatnie
wymieszać stosując wytrząsarkę, aby uzyskać zawiesinę komórek.
7.
Jako kontrolę ujemną stosować niereaktywne poliklonalne przeciwciało królicze skoniugowane z FITC.
8.
Inkubować w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
9.
Powtórzyć etapy 4 i 5.
10.
Ponownie wykonać zawiesinę peletek w płynie odpowiednim dla analizy cytometrycznej, np. w 0,3 mL 1
% paraformaldehydzie (utrwalacz) w 0,01 mol/L PBS o pH 7,4.
11.
Analizować na cytometrze przepływowym.
Dla zapewnienia kontroli odczynników i przygotowania próbek zalecane jest stosowanie podczas każdego testu
odpowiednich próbek kontroli dodatniej i ujemnej. Należy pamiętać, że Koniugaty fluorochromu są wrażliwe na
działanie światła, dlatego podczas procedury barwienia i do chwili wykonania analizy należy chronić próbki
przed działaniem światła.
Piśmiennictwo
1.
Aström M, Bodin L, Hörnsten P, Wahlin A, Tidefelt U. Evidence for a bimodal relation between serum
lysozyme and prognosis in 232 patients with acute myeloid leukaemia. Eur J Haematol 2003;70:26-33.
2.
Scheinecker C, Strobl H, Fritsch G, Csmarits B, Krieger O, Majdic O, et al. Granulomonocyte-associated
lysosomal protein expression during in vitro expansion and differentiation of CD34+ hematopoietic
progenitor cells. Blood 1995;86:4115-23.
3.
Krugliak L, Meyer PR, Taylor CR. The distribution of lysozyme, alpha-1-antitrypsin, and alpha-1antichymotrypsin in normal hematopoietic cells and in myeloid leukemias: an immunoperoxidase study
on cytocentrifuge preparations, smears, and paraffin sections. Am J Hematol 1986;21:99-109.
4.
Toth B, Wehrmann M, Kaiserling E, Horny H-P. Immunophenotyping of acute lymphoblastic leukaemia in
routinely processed bone marrow biopsy specimens. J Clin Pathol 1999;52:688-92.
5.
Pileri SA, Grogan TM, Harris NL, Banks P, Campo E, Chan JKC, et al. Tumours of histiocytes and
accessory dendritic cells: an immunohistochemical approach to classification from the International
Lymphoma Study Group based on 61 cases (review). Histopathol 2002;41:1-29.
Objaśnienia symboli
(107144-002)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Zużyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed światłem
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
F 0372/PL/MTH/01.12.03 p.2/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17