Wykład z dnia 16.11.2009

Laboratorium Laserowej Spektroskopii
Molekularnej PŁ
Mikroskop (gr. μικρόσ mikros - "mały" i ςκοπέω skopeo - "patrzę, obserwuję") –
jest urządzeniem służącym do obserwacji małych obiektów, zwykle
niewidocznych gołym okiem.
Pierwsze mikroskopy były mikroskopami
optycznymi, w których do oświetlania
obserwowanych obiektów wykorzystywano
światło dzienne. Za twórców tego rodzaju
mikroskopów uważa się Holendrów: Zachariasza
Janssena i jego ojca Hansa Janssena . Pierwsze
konstrukcje wykonali oni około roku 1590. Ze
względu na słabe powiększenie (10 razy)
mikroskopy nie zdobyły wtedy uznania jako
narzędzie badawcze.
mikroskop Carl Zeiss 1879
Przełomu dokonał wynalazca i przedsiębiorca Antonie van Leeuwenhoek, który
udoskonalił konstrukcję mikroskopu, a następnie rozwinął produkcję tych urządzeń w XVII
wieku. Leeuwenhoek jako pierwszy obserwował żywe komórki –pierwotniaki, erytrocyty itp.
Wykorzystanie mikroskopu przyczyniło się do ogromnego postępu w biologii.
Naukowcy mogli badać, co dzieje się we wnętrzu żywych organizmów. Powstały nowe
dziedziny nauki, cytologia oraz mikrobiologia. Dzięki wykorzystaniu mikroskopu możliwy był
ogromny postęp w leczeniu chorób zakaźnych. W roku 1882 Robert Koch odkrył z pomocą
mikroskopu bakterie gruźlicy.
Mikroskop wykorzystano do obserwacji podziału chromosomów w jądrze
komórkowym. W roku 1910 Thomas Hunt Morgan udowodnił, że chromosomy są nośnikami
genów dając początek genetyce. W technologii materiałowej mikroskopy wykorzystywano do
obserwacji struktur metali albo innych materiałów. W ten sposób możliwe stało się
opracowanie doskonalszych stopów metali wykorzystywanych w przemyśle.
Kolejnym przełomem stało się wykorzystanie w mikroskopie elektronów. W roku
1931 pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali Ernst Ruska i Maksem Knollem
w Berlinie. Możliwa stała się obserwacja najmniejszych struktur organelli komórkowych.
W technologii wykorzystanie mikroskopów elektronowych stało się podstawą rewolucji
krzemowej. Bez technik sprawdzania jakości wykonywanych w półprzewodnikach struktur nie
udałoby się dokonać tak ogromnego postępu w tej dziedzinie.
W roku 1982 mikroskopia uczyniła
pierwszy krok w kierunku świata atomów.
Pracujący w Zurychu naukowcy Gerd Binnig oraz
Heinrich Rohrer skonstruowali mikroskop STMskaningowy mikroskop tunelowy. Pozwolił on na
obserwację struktur złożonych z pojedynczych
atomów. Późniejsze prace doprowadziły do
budowy szeregu odmian tego mikroskopu
pozwalających na badanie różnych właściwości
materii w skali nanometra. Niezwykłą cechą
mikroskopu STM była jego zdolność nie tylko do
obserwacji atomów, ale również manipulacji
nimi.
Obecnie badacze przewidują, że
postęp w mikroskopii przyczyni się znacznie do
rozwoju nanotechnologii, która może znaleźć
zastosowanie w prawie każdej dziedzinie życia.
Mikroskop jest zbudowany z:
okularu, który służy do powiększenia obrazu tworzonego przez obiektyw mikroskopu, tubusa, który służy do formowania
powiększonego obrazu pośredniego, śruby makrometrycznej, która służy do wstępnej regulacji odległości, śruby mikrometrycznej,
która służy do ustalenia ostrości, rewolweru, który umożliwia prostą zmianę obiektywu, obiektywów, które zbierają światło
wychodzące z przedmiotu i tworzą jego powiększony obraz pośredni, kondensora, który koncentruje światło formując z niego
stożek, lusterka, które służy do naświetlania badanego obiektu;
Mikroskopia konfokalna jest odmianą mikroskopii świetlnej
charakteryzująca się zwiększonym kontrastem, a zatem i rozdzielczością.
W zwykłej mikroskopii (szerokiego pola, w tym mikroskopie
fluorescencyjnym) próbka jest oświetlana przez źródło światła w całości.
W odpowiedzi na to, albo odbija światło, albo fluoryzuje, przy czym sygnały te są
zbierane przez obiektyw. Obiektyw zbiera sygnał nie tylko z miejsca ogniskowania, ale
z całego przekroju próbki. Powoduje to, że tło wobec sygnału z miejsca ogniskowania
jest dość wysokie, co zmniejsza kontrast. Zastosowanie przesłony z małym otworem
przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza
płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego
obrazu.
Podstawy obrazowania konfokalnego zostały opatentowane przez Marvina Minsky'ego
w 1961.
Zasada działania mikroskopu konfokalnego
• Promień lasera pada na lustro dichroiczne
o selektywnym odbiciu fal świetlnych
• Wiązka przechodzi przez lustra skanujące,
które dzięki minimalnym ruchom obrotowym
mogą nią kierować
• Obiektyw skupia wiązkę w jednym punkcie,
która wzbudza wyznakowany barwnikiem
preparat co powoduje emisję dłuższej fali
świetlnej
• Wiązka powraca tą samą drogą przez lustra
skanujące i dichroiczne, po czym natrafia na
przesłonę z niewielkim otworem
• Wreszcie wiązka dociera do detektora.
Taki sygnał zostaje zamieniony przez
przetworniki analogowo-cyfrowe na postać
cyfrową i przeanalizowany przez komputer.
Mikroskopia konfokalna ma wiele zalet
w porównaniu z konwencjonalną
mikroskopią optyczną. Cechują ją wysoki
kontrast i rozdzielczość. Światło, które
jest wzbudzane w punktach leżących
poza ogniskiem jest eliminowane przez
system pinholi i nie bierze udziału
w tworzeniu obrazu. Wynikiem tego jest
obraz niezawierający składowych
pochodzących z płaszczyzn innych niż
ogniskowa. Dzięki temu rozdzielczość
i kontrast w tym mikroskopie są lepsze
niż w zwykłym mikroskopie
fluorescencyjnym.
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr
obasics.html
Porównanie skanowania szerokopasmowego i punktowego w mikroskopii
konwencjonalnej i konfokalnej
porównanie obrazów nabłonka skrzydła motyla barwionego jodkiem propidyny
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr
obasics.html
Znaczniki
Probe
Ex (nm)
Em (nm)
MW
Hydroxycoumarin
325
386
331
Aminocoumarin
350
445
330
Methoxycoumarin
360
410
317
Cascade Blue
Pacific Blue
Pacific Orange
Lucifer yellow
NBD
R-Phycoerythrin (PE)
(375);401
403
403
425
466
480;565
423
455
551
528
539
578
596
406
PE-Cy5 conjugates
480;565;650
670
294
240 k
Notes
Succinimidyl
ester
Succinimidyl
ester
Succinimidyl
ester
Hydrazide
Maleimide
NBD-X
aka Cychrome,
R670, Tri-Color,
Quantum Red
Rozpraszanie promieniowania
Czy promieniowanie elektromagnetyczne, w którym nie ma fotonów
pasujących do odstępów między poziomami energetycznymi, w ogóle nie oddziałuje
z molekułami ?
Molekuła jest zbiorem ładunków elektrycznych dodatnich i ujemnych.
Składowa elektryczna promieniowania elektromagnetycznego musi z nimi
oddziaływać. Indukuje ona w molekule moment dipolowy proporcjonalny do
natężenia E składowej elektrycznej pola, przy czym współczynnikiem
proporcjonalności jest polaryzowalność molekuły.
(1)
(2)
(3)
(4)
Opisane zjawisko nazywamy rozpraszaniem promieniowania
Ilustracja rozpraszania
Widmo RAMANA
Teoria polaryzowalności Placzka
(1)
polaryzowalność: potencjalna zdolność przemieszczania się elektronów względem
jąder w polu elektrycznym
(2)
(3)
(4)
(5)
polaryzowalność zmienia się z częstością drgania normalnego, ale tylko wtedy gdy
pochodna polaryzowalności po współrzędnej drgania nie jest równa zero
ostatecznie można pokazać, że:
(6)
rozpraszanie rozpraszanie Ramana
Rayleigha
skladowa stokesowska
rozpraszanie Ramana
skladowa antystokesowska

Zamiast wykrywać sumaryczną intensywność światła z danego
punktu próbki, sygnał rozkłada się na widmo za pomocą
spektrometru

Można uzyskiwać różne widma: absorpcji, transmisji,
odbiciowe, fluorescencji, Ramana, itp.

Technika Ramana znakomicie współgra z mikroskopią
konfokalną ze względu na wysoką specyficzność wykrycia
struktur chemicznych, brak konieczności skomplikowanego
przygotowana próbek, w odpowiednich warunkach – dobrą
jakość sygnału
http://www.mitr.p.lodz.pl/raman
http://www.witec.de
ZALETY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ:
 Zastosowanie pinhola przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina
sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa
kontrast i jakość uzyskanego obrazu – ostrość i barwność.
Możliwość rekonstrukcji obrazu 3D i 4D.
Pozwala na rejestrowanie obrazów cienkich warstw preparatu, czyli przekrojów
optycznych badanych obiektów. Z tego powodu jest on często stosowany do
rejestracji serii przekrojów optycznych na różnych głębokościach preparatu.
Eliminuje problem poświaty wynikającej z warstw preparatu leżących poza
płaszczyzną ostrości.
Oferuje lepszą rozdzielczość niż tradycyjna mikroskopia optyczna.
Możliwość wizualizacji żywych preparatów.
WADY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ :
Wpływ czynników otoczenia.
Blaknięcie.
Fototoksyczność.
Nadal gorsza rozdzielczość niż
w mikroskopie elektronowym.
Wysoka cena.
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr
obasics.html
Przykłady zastosowań:
1. Analiza tkanek gruczołu piersiowego
ex-vivo
http://www.mitr.p.lodz.pl/raman
http://www.witec.de
1. Analiza tkanek gruczołu piersiowego
ex-vivo
Widma Ramana a) i b) tkanka zdrowa
c) tkanka nowotworowa
http://www.mitr.p.lodz.pl/raman
http://www.witec.de
2. Analiza komórek skóry in-vivo
skóra sucha
http://www.horiba.com
skóra nawilżona
3. Widma komórek bakterii
widok kolonii bakterii
widmo Ramana pojedynczej komórki bakterii
http://www.horiba.com
4. Analizy farmaceutyczne
kofeina
kwas acetylosalicylowy
paracetamol- N-(4hydroksyfenylo)acetamid
widma Ramana
składników tabletki
http://www.horiba.com
5. Analiza polimerów
http://www.witec.de
Laboratorium Laserowej Spektroskopii
Molekularnej PŁ
Lasery impulsowe znalazły szerokie zastosowanie w spektroskopii rozdzielczej
w czasie.
Ze względu na rozdzielczość czasową metody, zależną od długości trwania impulsu,
spektroskopię dzielimy na:
 nanosekundową (10-9s)
 pikosekundową (10-12s)
 femtosekundową (10-15s)
Do najczęściej stosowanych metod spektroskopowych rozdzielczych w czasie
należą:
 Techniki badające zanik fluorescencji
 Techniki typu wiązka pompująca-wiązka sondująca (pump-probe)
 Metody nieliniowej wymuszonej spektroskopii Ramana
 Echo fotonowe
 Dudnienia kwantowe (quantum beats)
Techniki spektroskopii laserowej rozdzielczej w czasie
dostarczają informacji o dynamice różnych procesów takich jak:
 Relaksacja reorientacyjna
 Solwatacja nadmiarowego elektronu
 Dynamika różnych reakcji np. izomeryzacja cis- trans;
przeniesienie protonu w stanie wzbudzonym, przeniesienie
elektronu, zmiany konfirmacyjne
 Rozfazowanie wibracyjne T2 w podstawowym stanie elektronowym
 Relaksacja wibracyjna T1 w podstawowym i wzbudzonym stanie
elektronowym
 Wibracyjna predysocjacja
Schemat ilustrujący metodę wiązki pompującej -sondującej
wiązka sondująca
laser
próbka
detektor
wiązka pompująca
t
x
c
t- opóźnienie wiązki sondującej
względem pompującej
x- różnica dróg optycznych
c-prędkość światła
sygnał uzyskiwany w spektroskopii
absorpcyjnej
metodą wiązki pompującej-sondującej
Częstość wiązki pompującej lub sondującej można zmieniać w szerokich
granicach za pomocą przestrajalnych źródeł światła, takich jak:
 Generatory parametryczne (OPG)
 Oscylatory parametryczne (OPO)
 Wzmacniacze parametryczne (OPA)
 Źródła białego kontinuum (WC- emitujące niemonochromatyczne
promieniowanie w szerokim zakresie)
laser
wiązka sondująca
OPO
wiązka pompująca
próbka
detektor
Metody generowania krótkich
impulsów:
Q - switching
synchronizacja modów
 aktywna: modulowanie długości rezonatora L
przez wprowadzenie w drgania jednego ze zwierciadeł, zastosowanie przetwornika
optoakustycznego
 pasywne: nasycające się absorbenty, autosynchronizacja, modulowanie
współczynnika wzmocnienia ośrodka aktywnego
przetwornik optoakustyczny
periodyczne zmiany współczynnika
załamania ośrodka przez zmianę gęstości
wywołane fala dźwiękową
metoda nasycających się absorbentów
WZMOCNIENIE
527 nm YLF
pompowanie powodujące
inwersję obsadzeń
Tsunami 800 nm
Kryształ Ti+3:Al2O3
Jeżeli impuls przechodzi przez ośrodek
nieliniowy, w którym utrzymywana jest
inwersja obsadzeń (przez pompowanie
z innego źródła) to impuls przechodząc przez
ośrodek wywołuje emisję wymuszoną.
W rezultacie wychodzący impuls zostaje
wzmocniony.
wzmacniacz regeneratywny
(wielokrotne przejście światła po tej samej drodze w rezonatorze).
Tsunami-stretcher
/4
PC1
M1
Merlin (YLF)
250 ns, Q-switch
Input
ośrodek aktywny
(Ti+3:Al2O3)
Output
PC2
P
thin layer
polarizer
M2
Analiza fotouczulaczy
ZnPcS4-H2O, c=1x10-5M
MITR
MgPcS4-H2O, c=1x10-5M
Analiza wodnych roztworów elektrolitów
LOA
MITR
Dynamika femtosekundowa DPPC
porównania próbek DPPC „wet” i „dry”
MBI - Berlin
MITR
LABORATORIUM LASEROWEJ SPEKTROSKOPII MOLEKULARNEJ
Politechnika Łódzka
Międzyresortowy Instytut Techniki Radiacyjnej
93-590 Łódź
Wróblewskiego 15
tel:(48-42) 6313175, 6313162, 6313188
fax:(48-42) 6840043
http://www.mitr.p.lodz.pl/raman

Lasery światłowodowe.

Zasada działania światłowodu.

Zasada działania mikroskopu konfokalnego.

Sposoby pomiaru impulsu femtosekundowego.