Otrzymywanie i charakterystyka białek typu Dicer

Aleksander Tworak
Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu
Stypendysta projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych
za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
Otrzymywanie i charakterystyka białek typu Dicer pochodzących z
modelowej rośliny motylkowatej Medicago truncatula
W komórkach większości organizmów jednym z najważniejszych mechanizmów
regulacji ich funkcjonowania jest działanie krótkich regulatorowych cząsteczek RNA.
Zjawisko regulacji ekspresji informacji genetycznej w komórkach przez krótkie fragmenty
RNA, o długości ok. 21-24 nukleotydów, zostało odkryte niewiele ponad 20 lat temu. Pomimo
iż od tego czasu pozostaje jednym z intensywniej badanych zjawisk biologicznych wciąż
nieznanych jest wiele szczegółów jego funkcjonowania. Wiadomo jednak, że biorące w nim
udział krótkie regulatorowe RNA wpływają na funkcjonowanie komórek w niemal wszystkich
jego aspektach, takich jak wzrost, różnicowanie, podziały, sygnalizacja komórkowa czy
programowana śmierć komórek. Ponadto krótkie RNA są wykorzystywane m.in. jako element
specyficznej obrony antywirusowej, na najszerszą skalę w organizmach roślinnych.
Jedną z kluczowych ról w procesie powstawania krótkich regulatorowych RNA w
komórkach pełnią białka Dicer. Białka te odpowiadają za wycięcie z dłuższych prekursorów
fragmentów o długości odpowiadającej krótkim regulatorowym RNA. U kręgowców, nicieni, a
także niektórych drożdży i alg występuje jedno uniwersalne białko Dicer odpowiedzialne za
generowanie całej puli krótkich regulatorowych RNA w komórce. Z kolei rośliny, owady,
pierwotniaki oraz niektóre grzyby posiadają z reguły kilka podobnych do siebie białek Dicer.
Białka występujące u roślin zwane są białkami typu Dicer (ang. Dicer-like, DCL). Są to białka
o niemal identycznej budowie (kompozycji domen funkcjonalnych), lecz każde z nich
wyspecjalizowane jest w generowaniu cząsteczek krótkich regulatorowych RNA innego typu,
o ściśle określonej długości (np. 21 nukleotydów).
Głównym celem realizowanej przeze mnie pracy doktorskiej jest poznanie szczegółów
funkcjonowania białek typu Dicer u modelowej rośliny motylkowatej Medicago truncatula
(lucerna). Badania rozpocząłem od sklonowania sekwencji kodujących białka DCL1 i DCL2 z
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
lucerny. Białka te odpowiadają za generowanie krótkich RNA mających inne znaczenie
funkcjonalne, inną długość (odpowiednio 21 i 22 nukleotydy) i pochodzących z całkowicie
odmiennych prekursorów. Sklonowane sekwencje zostały wykorzystane do produkcji
zmodyfikowanych białek DCL1 i DCL2 pełnej długości oraz białek skróconych o pewne
fragmenty (domeny). Następnie szczegółowo scharakteryzowałem aktywność katalityczną
przygotowanych białek. Analizy te miały na celu m.in. wykazanie różnic w funkcjonowaniu
obu białek, i odpowiadających za nie cech strukturalnych zarówno samych białek jak i ciętych
przez nie prekursorów RNA. Otrzymane białka DCL1 i DCL2 z lucerny, poza wykorzystaniem
do badań własnych, posiadają potencjał komercyjny. Preparaty roślinnych białek typu Dicer
przeznaczone do celów badawczych nie są jeszcze obecne na rynku, stąd ich produkcja we
współpracy z lokalnym przedsiębiorstwem biotechnologicznym mogłaby pomóc w rozwoju
tego sektora przemysłu w regionie.
W ostatnich latach krótkie regulatorowe RNA znajdują coraz szersze zastosowanie w
genetyce, biotechnologii oraz medycynie. Techniki bazujące na krótkich regulatorowych RNA
są stosowane zarówno w celach poznawczych (np. do badania funkcji genów) jak i
praktycznych (np. do uzyskania określonych efektów w organizmach roślinnych i
zwierzęcych). Opracowywane są także nowe metody terapeutyczne bazujące na
preparatach wykorzystujących działanie wyselekcjonowanych krótkich RNA. W procesie
projektowania
i
wdrażania
tych
technik
duże
znaczenie
ma
wiedza
dotycząca
funkcjonowania krótkich regulatorowych RNA w komórkach i kluczowych w procesie ich
powstawania białek Dicer. Prowadzone przeze mnie badania mogą się zatem przyczynić do
rozwoju zaawansowanych technik modyfikacji roślin uprawnych czy metod terapeutycznych.
Krótkie regulatorowe RNA mają duży potencjał jako metoda skutecznej i bezpiecznej
modyfikacji cech użytkowych roślin oraz zwierząt, w tym gatunków o znaczeniu
gospodarczym. W najbliższej przyszłości narastać będzie potrzeba polepszania plonów
roślin uprawnych oraz wzmacniania ich odporności na patogeny i nieprzyjazne warunki
środowiskowe (np. suszę). Potrzeby te będą miały swe źródło w stale rosnącej liczbie
ludności na Ziemi, globalnych zmianach klimatycznych, niedoborze ziem uprawnych i
zasobów wody pitnej oraz coraz większym zapotrzebowaniu na odnawialne biopaliwa.
Globalne problemy, szczególnie dotyczące zmian klimatu i malejących zasobów wodnych,
nie są obecne także na obszarze województwa wielkopolskiego. Stąd rozwój badań nad
krótkimi regulatorowymi RNA ma szansę pomóc rozwiązać istotne problemy z którymi będą
się musiały zmierzyć rolnictwo i cała gospodarka w regionie.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego