Stezenie wybranych biomarkerów toksycznosci dymu tytoniowego u

St´˝enie wybranych biomarkerów toksycznoÊci dymu
tytoniowego u osób palàcych tytoƒ chorych na raka krtani
The concentration of the chosen smoke toxicity biomarkers
among smokers suffering from larynx cancer
Beata Winiarczyk1, Grzegorz Namys∏owski2, Mariusz Oleksiak1
1
Oddzia∏ Laryngologii, Szpital Specjalistyczny w Dàbrowie Górniczej
Ordynator: lek. med. M. Oleksiak
2
II Katedra i Oddzia∏ Kliniczny Laryngologii Âl.AM w Zabrzu
Kierownik: prof. dr hab. n. med. G. Namys∏owski
F
Summary
Introduction: An incidence of laryngeal cancer is strongly connected with exposure to tobacco smoke containing dozens of
carcinogens. Genotoxic agents such as polycyclic aromatic hydrocarbons present in tobacco smoke are responsible for lesions
of structure DNA and formation of DNA adducts by metabolically activated intermediates. Detecting the presence of DNA
adducts in human tissues is therefore, a tool for studies of cancer. An evidence demonstrates that DNA adducts are useful
markers of carcinogen exposure. The aim of this work was estimation of relationship between cigarette smoke exposure,
determined as urinary cotinine and urinary 1-hydroxypyrene concentration, and number of aromatic-DNA adducts in blood
lymphocytes. Material and methods: The study group consisted of 60 men at the age of 45 up to 65 years – 20 healthy nonsmokers, 20 healthy current smokers and 20 current smokers with primary larynx cancer, which was classified histopathologically as squamous cell carcinoma. The cotinine and 1-hydroxypyrene were determined in the urine with high performance liquid chromatography. Analysis of DNA adducts was performed by the 32P – postlabelling method. Results: Urinary
cotinine concentration in healthy smokers and cancer subjects in comparison with non-smokers was significant higher than
in non-smokers, respectively, 29- and 31-fold higher but differences between healthy and sicks smokers were insignificant.
Concentration of 1-hydroxypyrene in urine of healthy and cancer subjects was significantly higher (9- and 10-fold higher,
respectively) compared with non-smokers. The highest level of aromatic-DNA adducts was found in lympfocytes of healthy
smokers but differences between number of adducts in healthy smokers compared with non-smokers (+35%) and cancer subjects (+7,1%) were insignificant. The Pearson’s coefficient (r) for the correlation between aromatic-DNA level and urinary
cotinine or 1-hydroxypyrene concentration were significant only in cancer subjects group (r = 0,676, p = 0,011 and r = 0,465,
p = 0,039, respectivelly). Conclusions: The results suggest that cotinine and 1-hydroxypyrene concentration in urine are useful biomarkers of the tobacco smoke exposure. In contrast the levels of aromatic-DNA adducts in lymphocytes are not suitable for that purpose. It seems that none of investigated compounds are the risk predictor of larynx cancer.
H a s ∏ a i n d e k s o w e : rak krtani, addukty WWA-DNA, palenie papierosów
K e y w o r d s : larynx cancer, DNA-PAH, tobacco smoking
Otolaryngol Pol 2007; LXI (1): 39–46
© 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów G∏owy i Szyi
F
Rak krtani jest najcz´Êciej spotykanym nowotworem z∏oÊliwym g∏owy i szyi. Do chwili obecnej
poznano kilka czynników zwi´kszajàcych ryzyko
zachorowania na raka krtani. Jednym z nich jest pa-
lenie tytoniu. W Polsce od poczàtku lat osiemdziesiàtych ubieg∏ego wieku obserwuje si´ tendencj´
spadkowà cz´stoÊci palenia, a pomimo to Polska
nale˝y do krajów o najwy˝szej konsumpcji tytoniu
Autorzy nie zg∏aszajà konfliktu interesów.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
39
B. Winiarczyk i inni
na Êwiecie. Wed∏ug raportu Âwiatowej Organizacji
Zdrowia – WHO z 2002 roku, w Polsce dziennie pali∏o papierosy 51% m´˝czyzn i 29% kobiet powy˝ej
pi´tnastego roku ˝ycia [34]. Dym tytoniowy jest heterogennà mieszaninà gazów, nieskondensowanej
pary lotnych zwiàzków chemicznych i substancji
smolistych. Liczb´ zwiàzków chemicznych wchodzàcych w sk∏ad dymu tytoniowego ocenia si´ na
ok. 4800. Wed∏ug Mi´dzynarodowej Agencji Badaƒ
nad Rakiem – IARC, w dymie tytoniowym wyst´puje 67 zwiàzków o w∏asnoÊciach rakotwórczych
[12–14]. Wyst´pujàce w dymie tytoniowym substancje kancerogenne powodujà zmiany w strukturze DNA. Aminy aromatyczne i wielopierÊcieniowe w´glowodory aromatyczne (WWA) tworzà obj´toÊciowe addukty, N-nitrozoaminy alkilujà zasady
DNA, a reaktywne formy tlenu prowadzà do powstania utlenionych zasad purynowych i pirymidynowych. Ponadto wymienione grupy kancerogenów indukujà powstawanie jednoniciowych
przerw w ∏aƒcuchu DNA [26]. Warunkiem powstania adduktów DNA-WWA jest obecnoÊç miejsca
o zwi´kszonej g´stoÊci elektronowej w obr´bie w´glowodoru. Obszar ten nazywany jest bay region.
Szczególnie podatne na tworzenie adduktów sà
struktury epoksydów dihydrodioli [29]. Miernikiem umo˝liwiajàcym ocen´ zagro˝enia cz∏owieka
zwiàzanego z obecnoÊcià czynników szkodliwych
w Êrodowisku jest analiza jego tkanek lub p∏ynów
ustrojowych prowadzàca do wykrycia w nich egzogennych substancji chemicznych, ich metabolitów,
zmienionych poziomów aktywnoÊci enzymatycznej oraz innych substancji biochemicznych zwiàzanych z interakcjà szkodliwych zwiàzków chemicznych z systemem biologicznym cz∏owieka [21].
Zwiàzki oznaczane w tych analizach nazywamy
markerami biologicznymi (biomarkerami). Biomarkery stanowià konkretne ogniwa nast´pujàcych po
sobie przemian zapoczàtkowanych ekspozycjà na
czynniki szkodliwe i zakoƒczonych stanem chorobowym. W zale˝noÊci od tego, jakie procesy sà
okreÊlane z u˝yciem biomarkerów, klasyfikuje si´
je jako biomarkery nara˝enia/ekspozycji (dostarczajàce informacji o rozmiarach nara˝enia), biomarkery efektu biologicznego (informujàce o skutkach
biologicznych, jakie powodujà czynniki szkodliwe)
oraz biomarkery wra˝liwoÊci osobniczej (pozwalajàce identyfikowaç osoby o szczególnie wysokim
ryzyku zachorowania) [7]. Biologicznymi biomarkerami dymu tytoniowego mogà byç zarówno niektóre jego sk∏adniki, jak i powstajàce w ustroju metabolity poszczególnych sk∏adników dymu tytonio-
40
wego. Przeglàd piÊmiennictwa pozwala na wyodr´bnienie dwóch grup biomarkerów. Grupa pierwsza obejmuje zwiàzki, które pe∏nià przede wszystkim rol´ markerów nara˝enia na zwiàzki o w∏asnoÊciach rakotwórczych znajdujàce si´ w dymie tytoniowym (metabolity wielopierÊcieniowych w´glowodorów aromatycznych). Do drugiej grupy nale˝y
zaliczyç powszechnie stosowane biomarkery, za
pomocà których oznaczamy nara˝enie na dym tytoniowy (nikotyna, kotynina, 1-hydroksypiren). Najcz´Êciej stosowanym biomarkerem nara˝enia na
sk∏adniki dymu tytoniowego jest kotynina, metabolit nikotyny. Kotynina jest najodpowiedniejszym
biomarkerem nara˝enia na dym tytoniowy, a pomiar st´˝enia kotyniny w moczu jest uwa˝any za
najbardziej niezawodnà metod´ oceny indywidualnego nara˝enia na dym tytoniowy i to wÊród palaczy zarówno czynnych, jak i biernych. Mocz wydaje si´ najlepszym materia∏em do oznaczania kotyniny, poniewa˝ w jego przypadku istnieje mo˝liwoÊç
nieinwazyjnego pobierania próbek. Jednak wydalanie kotyniny zale˝y od sprawnoÊci funkcjonowania
nerek i pH moczu [18]. Aby wyeliminowaç b∏´dy
wynikajàce z nieprawid∏owego funkcjonowania nerek oraz w celu uwzgl´dnienia stopnia zag´szczania/rozrzedzania moczu wielu autorów pos∏uguje
si´ wartoÊcià ilorazu st´˝eƒ kotynina/kreatynina
w moczu [8, 10, 28]. Z kolei st´˝enie 1-hydroksypirenu jest powszechnie akceptowane jako wskaênik
nara˝enia na wielopierÊcieniowe w´glowodory aromatyczne zawarte zarówno w dymie tytoniowym,
jak i pochodzàce z innych êróde∏. Piren jest sta∏ym
sk∏adnikiem WWA wyst´pujàcych w dymie tytoniowym. W przeciwieƒstwie do metabolitów WWA
o wy˝szych od niego masach czàsteczkowych jest
wydzielany w postaci 1-OHP z moczem, który jest
∏atwo dost´pnym materia∏em do analizy [15]. Addukty DNA-WWA nale˝à do grupy biomarkerów
efektu biologicznego.
Celem pracy by∏o:
– okreÊlenie st´˝enia biomarkerów nara˝enia (kotynina i 1-hydroksypiren) w moczu oraz biomarkera
efektu biologicznego (addukty aromatyczne – DNA)
w limfocytach niepalàcych i palàcych osób zdrowych oraz palàcych osób chorych na raka krtani,
– ocenienie na drodze analizy korelacyjnej,
uwzgl´dniajàcej wyniki oznaczeƒ kotyniny, mo˝liwoÊci wykorzystania 1-hydroksypirenu i adduktów
aromatycznych DNA jako wskaêników nara˝enia
na dym tytoniowy,
– weryfikacja mo˝liwoÊci zastosowania oznaczania st´˝enia adduktów aromatycznych DNA w lim-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
St´˝enie biomarkerów toksycznoÊci
Tabela I. Charakterystyka osób badanych
Parametr
Niepalàcy
Palàcy zdrowi
Palàcy chorzy na raka krtani
LiczebnoÊç
Wiek
(lata)
Przedzia∏ wieku
(lata)
Liczba dziennie wypalonych papierosów
(szt.)
Okres palenia
(lata)
IloÊç spo˝ywanego alkoholu
(ml/tydzieƒ)
Kreatynina w moczu
(mmol/l)
20
52,2 ± 4,9
45 – 60
–
–
55 ± 40
9,0 ± 1,4
20
54,6 ± 7,0
45 – 65
19,5 ± 5,1
28,3 ± 6,5
138 ± 85
9,3 ± 1,5
20
53,3 ± 6,3
45 – 65
22,8 ± 5,0
30,5 ± 5,6
355 ± 245
8,5 ± 1,2
focytach jako biomarkera efektu biologicznego,
– dokonanie analizy, czy badane parametry biochemiczne (kotynina, 1-hydroksypiren, addukty
DNA-WWA) mogà byç czynnikami prognostycznymi ryzyka zachorowania na raka krtani.
MATERIA∏ I METODY
Do badaƒ w∏àczono 60 m´˝czyzn w wieku
45–65 lat (Êrednia 53 lata) podzielonych na 3 podgrupy:
– grupa kontrolna – 20 m´˝czyzn, niepalàcych
i niezamieszkujàcych we wspólnych pomieszczeniach z osobami palàcymi papierosy,
– grupa palàcych zdrowych – 20 m´˝czyzn wypalajàcych dziennie Êrednio 19,5 ± 5,1 papierosów
i palàcych przez okres 28,3 ± 6,5 lat. Dziewi´ciu
m´˝czyzn pali∏o papierosy bez filtra.
– grupa palàcych chorych – 20 m´˝czyzn z potwierdzonym histopatologicznie rakiem krtani, wypalajàcych Êrednio 22,8 ± 5,0 papierosów dziennie
i palàcych przez okres 30,5 ± 5,6 lat. Dwunastu
m´˝czyzn pali∏o papierosy bez filtra.
Pacjenci zamieszkiwali region Górnego Âlàska,
˝adna z badanych osób nie by∏a zatrudniona w jakiejkolwiek ga∏´zi przemys∏u chemicznego bàdê koksowniczego. Na podstawie standardowych badaƒ
biochemicznych u ˝adnej z osób nie stwierdzono cukrzycy, zaburzeƒ funkcji wàtroby, trzustki, uk∏adu
pokarmowego oraz zaburzeƒ gospodarki lipidowej.
U nikogo nie stwierdzono ostrych stanów zapalnych.
Wszyscy palàcy byli palaczami czynnymi w chwili
przyj´cia na oddzia∏. Chorzy z histopatologicznie potwierdzonym rakiem krtani zostali zakwalifikowani
do grupy T3N0M0. Badaniem histopatologicznym
rozpoznano 20 przypadków carcinoma planoepitheliale. U czternastu chorych guz zajmowa∏ górne pi´tro krtani a u szeÊciu pi´tro Êrodkowe. Charakterystyk´ osób badanych przedstawiono w tabeli I.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Ryc. 1. Przyk∏adowe radiogramy kontroli enzymatycznej, wzorca dG – BPDE oraz adduktów DNA izolowanych z limfocytów
Materia∏ do badaƒ stanowi∏a krew ˝ylna w iloÊci
2 ml – w materiale tym oznaczano w limfocytach
addukty DNA-WWA technikà 32P-postlabelling (trawienie P1 nukleazà, rozdzia∏ mieszaniny poreakcyjnej za pomocà HPLC, detekcja sygna∏u za pomocà autoradiografii) w 30 ml moczu z rannej zbiórki
– oznaczano st´˝enie kotyniny – metodà Nakajima
[24], st´˝enie 1-hydroksypirenu – metodà Jongeneelena [19] oraz st´˝enie kreatyniny – podstawà
oznaczenia by∏a reakcja Jaffe’go. Do oznaczeƒ u˝ywano zestawu diagnostycznego „Biochemtest- Kreatynina” firmy POCH, Gliwice, nr kat. 178196149.
St´˝enie kreatyniny oznaczano w celu wyeliminowania b∏´du wynikajàcego z nieprawid∏owego
funkcjonowania nerek oraz w celu uwzgl´dnienia
stopnia zag´szczenia/rozcieƒczenia moczu. Próbki
do badaƒ pobierano rano przed wypaleniem pierwszego papierosa. Uzyskane wyniki przedstawiono
w tabelach II i III.
WYNIKI
W stosunku do grupy niepalàcych, która w prezentowanych badaniach jest grupà kontrolnà, odnotowano ponad 29-krotnie wi´ksze st´˝enie kotyniny w moczu zdrowych osób palàcych papierosy
oraz prawie 31-krotnie wi´ksze st´˝enie kotyniny
41
B. Winiarczyk i inni
Tabela II. Wyniki oznaczania st´˝enia kotyniny i stosunku st´˝eƒ kotynina/kreatynina w moczu, st´˝enia 1-OHP i stosunku st´˝eƒ
1-OHP/kreatynina w moczu oraz st´˝enia adduktów DNA w limfocytach
Parametr
Kotynina
Kotynina/kreatynina
1-hydroksypiren
1-OHP/kreatynina
Addukty DNA
Liczba adduktów /108 nukleotydów
(μg /l)
(μg /g)
(1-OHP) μg/l
(μmol/mol)
(fmol/μgDNA)
Niepalàcy
x ± SD
(min: max)
Palàcy zdrowi
x ± SD
(min: max)
Palàcy chorzy na raka krtani
x ± SD
(min: max)
65,5±49,9 (2,3:156,7)
64,3±50,0 (2,2:147,8)
0,22±0,11 (0,05:0,44)
0,11±0,055 (0,025:0,20)
0,123±0,091 (0,034:0,354)
4,10±0,45 (1,13:11,8)
1910±473 (1045:2876)
1854±569 (1100:3507)
2,01±1,04 (0,24:4,56)
1,02±0,62 (0,14:2,88)
0,166±0,121 (0,050:0,586)
5,55±4,04 (1,67:19,5)
2021±554 (1199:3245)
2172±726 (1376:3687)
2,20±0,77 (0,98:3,32)
1,20±0,43 (0,40:2,21)
0,155±0,108 (0,028:0,466)
5,18±3,60 (0,9:15,5)
x±SD – wartoÊç Êrednia i jej odchylenie standardowe; min, max wartoÊç minimalna i maksymalna
Tabela III. Wspó∏czynnik korelacji Pearsona (r), poziom istotnoÊci (p) dla zale˝noÊci pomi´dzy st´˝eniem kotyniny oraz 1-OHP w
moczu a wartoÊciami ilorazu tych st´˝eƒ do st´˝enia kreatyniny w moczu, dla zale˝noÊci pomi´dzy st´˝eniem kotyniny oraz 1-OHP w
moczu, dla zale˝noÊci pomi´dzy st´˝eniem kotyniny i 1-OHP w moczu a st´˝eniem adduktów DNA w limfocytach.
Zale˝noÊç (zmienna 1 vs zmienna 2)
Kotynina (μg/l) vs. kotynina /kreatynina (μg/g)
1-OHP (μmol/l) vs. 1-OHP/kreatynina (mol/mol)
Kotynina (μg/l) vs. 1-OHP (μg/l)
Kotynina (μg/l) vs. addukty DNA (fmol/g DNA)
1-OHP (μg/l) vs. addukty DNA (fmol/g DNA)
Grupa
Parametr (r)
Parametr (p)
Niepalàcy
Palàcy zdrowi
Palàcy chorzy
Niepalàcy
Palàcy zdrowi
Palàcy chorzy
Niepalàcy
Palàcy zdrowi
Palàcy chorzy
Niepalàcy
Palàcy zdrowi
Palàcy chorzy
Niepalàcy
Palàcy zdrowi
Palàcy chorzy
0,971
0,920
0,922
0,953
0,959
0,908
0,074
0,501
0,397
0,306
0,251
0,676
0,014
0,336
0,465
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
Ns
0,025
0,083
0,189
0,286
0,011
0,953
0,147
0,039
ns – nieznamienne statystycznie
w moczu palàcych chorych na raka krtani. W bardzo zbli˝ony sposób kszta∏tujà si´ relacje pomi´dzy
wartoÊciami stosunku kotynina/kreatynina w moczu w poszczególnych grupach. Omawiana wartoÊç
w grupie zdrowych osób palàcych papierosy jest
prawie 29-krotnie wi´ksza ni˝ w grupie kontrolnej,
a w grupie osób palàcych papierosy chorych na raka krtani jest nieca∏e 34 razy wi´ksza. Analogiczne
obliczenia przeprowadzono dla st´˝enia 1-OHP
oznaczonego w moczu badanych osób. W stosunku
do st´˝enia 1-OHP w moczu osób z grupy kontrolnej, jego st´˝enie w moczu osób palàcych papierosy zdrowych i chorych jest odpowiednio 9,1 razy
i 10 razy wi´ksze. Przeliczenie st´˝enia 1-OHP na
st´˝enie kreatyniny w moczu nie powoduje zmian
42
zale˝noÊci. Poziom wartoÊci ilorazu st´˝eƒ 1OHP/kreatynina jest wi´kszy 9,3 razy (osoby palàce
zdrowe) oraz 11,1 razy (osoby palàce chore na raka
krtani) od wartoÊci tego stosunku w grupie kontrolnej. Analizujàc st´˝enie adduktów DNA w limfocytach zauwa˝amy, ˝e osoby palàce zdrowe wykazujà o 35% a palacze chorzy o 26% wy˝sze st´˝enie
adduktu DNA w limfocytach w porównaniu z grupà kontrolnà. Do tej pory w publikowanych pracach porównywano st´˝enie adduktów DNA-WWA
u osób niepalàcych i palàcych chorych na raka krtani. W omawianej pracy porównano st´˝enie adduktów DNA-WWA u osób palàcych zdrowych i palàcych chorych na raka krtani i stwierdzono, ˝e osoby palàce zdrowe mogà mieç wy˝sze st´˝enie ad-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
St´˝enie biomarkerów toksycznoÊci
duktów DNA-WWA ni˝ osoby palàce chore na raka
krtani.
We wszystkich badanych grupach wspó∏czynnik korelacji r mi´dzy st´˝eniem kotyniny a wartoÊcià stosunku kotynina/kreatynina w moczu osób
badanych osiàga wartoÊci powy˝ej 0,9, co oznacza
korelacj´ prawie pe∏nà. Bardzo podobne wartoÊci
r i p znaleziono dla zale˝noÊci st´˝enia 1-OHP od
wartoÊci stosunku st´˝eƒ 1-OHP/kreatynina.
W grupie kontrolnej korelacja pomi´dzy st´˝eniem
kotyniny a st´˝eniem 1- OHP w moczu osób badanych jest nik∏a. Natomiast osoby palàce papierosy
zarówno zdrowe jak i chore na raka krtani wykazujà korelacj´ przeci´tnà pomi´dzy badanymi wielkoÊciami. W grupie niepalàcych st´˝enie adduktów
w limfocytach wykazuje przeci´tnà korelacj´ ze st´˝eniem kotyniny oraz nik∏à ze st´˝eniem 1-OHP
w moczu. W grupie osób palàcych zdrowych, korelacja pomi´dzy st´˝eniem kotyniny i 1-OHP w moczu a st´˝eniem adduktów w limfocytach jest s∏aba
dla kotyniny, a dla 1-OHP przeci´tna. Natomiast
w grupie palàcych chorych korelacja pomi´dzy st´˝eniem kotyniny a st´˝eniem adduktów DNA jest
wysoka, a pomi´dzy st´˝eniem 1-OHP a st´˝eniem
adduktów DNA wyst´puje korelacja przeci´tna.
DYSKUSJA
Monitorowanie ryzyka wystàpienia schorzeƒ
wywo∏anych paleniem tytoniu powinno byç zwiàzane ze Êledzeniem i ocenà wielkoÊci nara˝enia na
dym tytoniowy i to zarówno wÊród palaczy czynnych, jak i osób niepalàcych, ale nara˝onych na
dym tytoniowy. Wymaga to zastosowania obiektywnych wskaêników nara˝enia, efektu i wra˝liwoÊci. Sà nimi biomarkery umo˝liwiajàce wykrywania zmian o charakterze przedklinicznym, które poprzedzajà wystàpienie jawnej postaci choroby, co
stwarza warunki dla podejmowania bardziej skutecznych dzia∏aƒ profilaktycznych. Kotynina jest
najodpowiedniejszym biomarkerem nara˝enia na
dym tytoniowy, a pomiar st´˝enia kotyniny w osoczu lub moczu uwa˝any jest za najbardziej niezawodnà i wiarygodnà metod´ oceny indywidualnego nara˝enia na dym tytoniowy i to wÊród palaczy
zarówno czynnych, jak i biernych. Znalaz∏o to odzwierciedlenie w zaleceniach komisji powo∏anej
w ramach Society for Research on Nicotine and Tobacco (SRNT, 2002). Najcz´Êciej przyjmowane
w piÊmiennictwie wartoÊci graniczne, na podstawie których dokonuje si´ rozgraniczenia osób nie-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
palàcych i niepalàcych, ale nara˝onych na ETS (palacze bierni) to 50 μg/l [16, 17, 27] lub 100 μg/l [9,
11]. W prezentowanej pracy wykazano, ˝e Êrednie
st´˝enie kotyniny w moczu osób niepalàcych i nienara˝onych na dym tytoniowy wynosi 65,5 μg/l
i cechuje si´ znacznà rozpi´toÊcià wyników od 2,3
do 156,7 μg/l. Niewàtpliwie jest to spowodowane
tym, ˝e cz´Êç badanych osób tej grupy, chocia˝ nie
zamieszkiwa∏a wspólnie z osobà palàcà, to mog∏a
byç nara˝ona na ETS w miejscu pracy lub w innym
Êrodowisku. Ârednia wartoÊç st´˝enia kotyniny
w moczu osób zdrowych, palàcych papierosy, obliczona w wyniku przeprowadzonych badaƒ, wynosi
1910 μg/l. Osoby chore na raka krtani, palàce papierosy, wykazujà podobne st´˝enie kotyniny
w moczu – 2021 μg/l. Nieznacznie wi´ksza, ale statystycznie nieznamienna wartoÊç st´˝enia kotyniny
w moczu osób chorych, w porównaniu z osobami
zdrowymi, mo˝e mieç swojà przyczyn´ w wi´kszej
liczbie spalanych papierosów, jak i w wi´kszym
okresie ich palenia deklarowanym przez osoby chore na raka krtani. Zdaniem niektórych badaczy st´˝enie kotyniny w moczu powinno si´ przeliczaç na
st´˝enie kreatyniny wydzielanej wraz z moczem.
Ma to zwiàzek ze sprawnoÊcià funkcjonowania nerek oraz mo˝liwymi przypadkami zag´szczania/rozcieƒczania moczu [5, 31]. Majàc to na uwadze przeprowadzono oznaczenia kreatyniny w moczu wszystkich badanych osób i wyznaczono wartoÊç stosunku st´˝eƒ kotynina/kreatynina. Stwierdzono, ˝e wyznaczone parametry sà ze sobà ÊciÊle
skorelowane. Z grupy biomarkerów nara˝enia na
WWA na pierwszy plan wysuwa si´ g∏ówny metabolit 1-OHP [20].
Zdecydowana wi´kszoÊç badaczy stwierdza
znamiennie wi´ksze st´˝enie 1-OHP w moczu osób
palàcych tytoƒ w porównaniu z grupà kontrolnà
niepalàcych. W obecnej pracy st´˝enie 1-OHP
w moczu palaczy zdrowych i chorych na raka krtani, w porównaniu z grupà kontrolnà, wzrasta∏o odpowiednio 9,3 razy i 11,1 razy. Obserwowane ró˝nice krotnoÊci wzrostu st´˝enia 1-OHP w moczu
osób palàcych w stosunku do jego st´˝enia w moczu niepalàcych wynikajà przypuszczalnie z kilku
powodów. Pierwszy to obecnoÊç egzogennych êróde∏ WWA (a tym samym pirenu), wyst´pujàcych
szczególnie w aglomeracjach miejskich. Drugi powód to odniesienie zmian w st´˝eniu 1-OHP do
liczby wypalanych papierosów (wywiad ankietowy), co nie musi odzwierciedlaç iloÊci WWA inhalowanych wraz z dymem tytoniowym. Natomiast
inne powody to ró˝na ekspozycja zawodowa na
43
B. Winiarczyk i inni
WWA (hutnicy, koksownicy, pracujàcy przy produkcji asfaltu), czy te˝ mo˝liwoÊç pojawienia si´
polimorfizmu genetycznego enzymów metabolizujàcych WWA w organizmie [1, 23, 25, 32]. Podobnie jak w przypadku kotyniny, przeliczenie st´˝enia 1-OHP na iloÊç kreatyniny wydalanej z moczem
da∏o bardzo zbli˝one wyniki. Wspó∏czynnik korelacji Pearsona pomi´dzy st´˝eniem 1-OHP oraz wartoÊcià stosunku st´˝enia 1-OHP/kreatynina w moczu we wszystkich trzech grupach osiàga wartoÊç
powy˝ej 0,9 przy wysokiej znamiennoÊci statystycznej p< 0,001, co oznacza korelacj´ prawie pe∏nà. Wzrost nara˝enia na dym tytoniowy powinien
skutkowaç zwi´kszonà iloÊcià sk∏adników dymu
tytoniowego i ich metabolitów w organizmie cz∏owieka. Oznacza to, ˝e wzrost st´˝enia kotyniny
w moczu powinien odpowiadaç zwi´kszonej iloÊci
WWA dostajàcych si´ do organizmu osoby palàcej.
Tymczasem w opublikowanych w piÊmiennictwie
danych, a tak˝e z badaƒ w∏asnych wynika, ˝e korelacja st´˝enia kotyniny i 1-OHP nie osiàga wartoÊci
przypisanych korelacji bardzo wysokiej lub prawie
pe∏nej. Niewàtpliwie przyczynà jest spalanie przez
osoby badane papierosów o ró˝nej zawartoÊci nikotyny (prekursora kotyniny) i substancji smolistych
(g∏ównego êród∏a WWA). Wysokiej zawartoÊci nikotyny mo˝e towarzyszyç niska zawartoÊç substancji smolistych lub na odwrót. Rozpatrujàc st´˝enie
adduktów DNA w materiale biologicznym nale˝a∏oby spodziewaç si´ Êcis∏ej korelacji pomi´dzy ich
st´˝eniem a nara˝eniem na dym tytoniowy. Tymczasem nale˝y zwróciç uwag´ na warunki, które
muszà byç spe∏nione, aby dosz∏o do powstania adduktów DNA. Tworzenie adduktów jest mo˝liwe
tylko w okreÊlonych miejscach ∏aƒcucha DNA;
WWA musi posiadaç miejsce o zwi´kszonej g´stoÊci elektronowej. Mo˝na za∏o˝yç, ˝e w pewnym
momencie nast´puje wysycenie miejsc zdolnych
do przy∏àczenia struktur aromatycznych. W zwiàzku z tym, zwi´kszenie nara˝enia na WWA od pewnego momentu nie b´dzie powodowaç wzrostu
liczby adduktów. Takie wnioski wyciàgn´li niektórzy badacze stwierdzajàc, ˝e st´˝enie adduktów
DNA w limfocytach zwi´ksza si´ wraz z liczbà wypalanych papierosów, ale poczàwszy od ponad
dwudziestu papierosów wypalanych dziennie ju˝
si´ nie zmienia [3, 4, 33]. Nale˝y równie˝ zwróciç
uwag´ na funkcjonowanie mechanizmów obronnych organizmu cz∏owieka. Komórki majà bardzo
sprawny mechanizm prowadzàcy do wykrywania
i usuwania uszkodzeƒ DNA. Tak˝e du˝à rol´ odgrywa metabolizm kancerogenów, po wnikni´ciu
44
wraz z dymem tytoniowym do organizmu. Substancje te ulegajà aktywacji metabolicznej polegajàcej
na zmianie w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych czàsteczki celem zwi´kszenia jej rozpuszczalnoÊci.
Wià˝e si´ to zazwyczaj ze zwi´kszeniem reaktywnoÊci chemicznej takiego metabolitu. Aktywacja
metaboliczna przebiega przy udziale enzymów aktywacyjnych, które nale˝à do bia∏ek zale˝nych od
cytochromu P450. Gen CYP1A1 koduje bia∏ka aktywujàce policykliczne w´glowodory aromatyczne.
Wykazano, ˝e polimorfizm genu CYP1A1, bioràcego udzia∏ w biotransformacji WWA do fenoli
i epoksydów, wp∏ywa na poziom aromatycznych
adduktów DNA w organizmie osób palàcych tytoƒ
[30]. Ekspresja tego genu w tkance mo˝e zmieniaç
si´ nawet 50-krotnie, co t∏umaczy du˝e mi´dzyosobnicze ró˝nice w metabolizmie WWA [2].
Stwierdzono zwiàzek pomi´dzy polimorfizmem genów katalizujàcych mechanizmy naprawy DNA
a uszkodzeniami DNA w leukocytach krwi obwodowej zdrowych osób palàcych papierosy [22]. Najwy˝szy wspó∏czynnik korelacji pomi´dzy poziomem adduktów DNA a obni˝eniem potencja∏u naprawy stwierdzono dla genu XPD, który uczestniczy w naprawie DNA wed∏ug mechanizmu NER
(nucleotide excision repair), polegajàcego na wycinaniu zmienionych nukleotydów. W Êwietle obecnych badaƒ wydaje si´, ˝e st´˝enie adduktów
WWA-DNA w organizmie osoby palàcej jest wypadkowà wielu czynników, nie tylko iloÊci WWA
dostajàcych si´ do organizmu wraz z dymem tytoniowym, ale równie˝ aktywnoÊci enzymów aktywacyjnych, detoksykacyjnych oraz naprawczych.
Oznacza to, ˝e polimorfizm genów odpowiedzialnych za aktywacj´, detoksykacj´ i napraw´ uszkodzeƒ DNA ma wp∏yw na oznaczany poziom adduktów WWA-DNA. Âwiadczà o tym tak˝e wyniki
otrzymane w prezentowanej pracy.
Przypisanie paleniu papierosów g∏ównej roli
w etiologii raka krtani nie budzi wàtpliwoÊci, ale
stawia pytania o udzia∏ indywidualnej podatnoÊci
na szkodliwe dzia∏anie dymu tytoniowego. Chocia˝
uwa˝a si´, ˝e palenie tytoniu odpowiada za wystàpienie ponad 35% wszystkich nowotworów, to nawet w grupach intensywnych palaczy papierosów
tylko u cz´Êci rozwijajà si´ nowotwory [35]. Utworzenie adduktów DNA jest niewàtpliwie dowodem
kontaktu z kancerogenem, ale nie dowodzi podj´cia
procesu kancerogenezy. W prezentowanych badaniach liczba adduktów aromatycznych DNA, nara˝enie na dym tytoniowy (okreÊlone przez st´˝enie
kotyniny i 1-OHP), czas palenia i wiek badanych sà
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
St´˝enie biomarkerów toksycznoÊci
na zbli˝onym poziomie wÊród osób palàcych, a m imo to jedynie u cz´Êci palaczy wykryto raka krtani.
Zatem sama wartoÊç st´˝enia aromatycznych adduktów DNA nie jest prognostykiem wystàpienia
raka krtani. Obecnie uwa˝a si´, ˝e g∏ównà rol´
w etiologii raka krtani odgrywa polimorfizm genów
CYP1A1, NAT2, GSTM1 i XPD. Tym samym okreÊlenie genotypów mo˝e byç wykorzystane w charakterze markerów przebiegu choroby i prognozy,
ale wymaga to dalszych badaƒ [6]. Przeprowadzone
korelacje pomi´dzy st´˝eniami kotyniny i 1-OHP
w moczu a st´˝eniem adduktów DNA w limfocytach pozwoli∏y wyciàgnàç nast´pujàce wnioski:
– badanie st´˝enia kotyniny i stosunku st´˝eƒ
kotynina/kreatynina w moczu sà u˝ytecznymi metodami okreÊlenia wielkoÊci ekspozycji na dym tytoniowy, u osób zarówno zdrowych, jak i chorych
na raka krtani,
– pomiar st´˝enia 1-hydroksypirenu lub wartoÊci stosunku st´˝eƒ 1-hydroksypiren/kreatynina
w moczu mo˝e byç wykorzystany do oceny nara˝enia na dym tytoniowy,
– wartoÊç diagnostyczna oznaczania st´˝enia
adduktów DNA w limfocytach, jako biomarkera
efektu biologicznego, jest nieprzydatna w ocenie
nara˝enia na dym tytoniowy,
– ˝aden z badanych biomarkerów (kotynina,
1-hydroksypiren, addukty DNA), analizowany oddzielnie lub wspólnie z innymi, nie jest czynnikiem
prognostycznym ryzyka powstania raka krtani.
PIÂMIENNICTWO
01. Alexandrie AK, Warholm M, Carstensen U, Axmon A, Hagmar L, Levin JO, i wsp. CYP1A1 and GSTM1 polymorphism
affect urinary 1-hydroxypyrene levels after PAH exposure.
Carcinogenesis 2000; 21: 669–676.
02. Alexandrov K, Cascorbi I, Rojas M, Bouvier G, Kriek E,
Bartsch H. CYP1A1 and GSTM1 genotypes affect benzo(a)pyrene DNA adducts in smokersí lung: comparison with aromatic/hydrophobic adduct formation. Carcinogenesis 2002;
23: 1969–1977.
03. Banaszewski J, Szmeja Z, Szyfter W, Szyfter K, Baranczewski P, Moller M. Analysis of aromatic DNA adducts
in laryngeal biopsies. Eur Arch Otorhinolaryngol 2000;
257; 149–153.
04. Dallinga JW, Pachen DM, Wijnhoven SW, Breedijk A,
vanít Veer L, Wigbout G, i wsp. The use of 4-aminobiphenyl
hemoglobin adducts and aromatic DNA adducts in lymphocytes of smokers as biomarkers of exposure. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1998; 7: 571–577.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
05. Fried PA, Perkins SL, Watkinson B, McCartney JS. Association between creatinine-adjusted and unadjusted urine cotinine values in children and the motherís report of exposure
to environmental tobacco smoke. Clin Biochem 1995; 28:
415–420.
06. Gajecka M, Rydzanicz M, Jasku∏a-Sztul R, Kujawski M, Szyfter W, Szyfter K. CYP1A1, CYP2D6, CYP2E1, NAT2, GSTM
and polymorphisms or their combinations are associated
with the increased risk of the laryngeal squamous cell carcinoma. Mutat Res. 2005; 574: 112–123.
07. Grandjean P. Biomarkers in epidemiology. Clin Chem 1995;
41: 1800–1803.
08. Greaves R, Trotter L, Brennecke S, Janus E. A simple highpressure liquid chromatography cotinine assay: validation of
smoking status in pregnant women. Ann Clin Biochem 2001;
38: 333–338.
09. Haufroid V, Lison D. Urinary cotinine as a tobacco-smoke
exposure index: a minireview. Int Arch Occup Environ Health 1998; 71: 162–168.
10. Henderson FW, Reid HF, Morris R, Wang OL, Hu PC, Helms
RW, i wsp. Home air nicotine levels and urinary cotinine
excretion in preschool children. Am Rev Respir Dis 1989;
140: 197–201.
11. Holl RW, Grabert M, Heinze E, Debatin KM. Objective assessment of smoking habits by urinary cotinine measurement in
addescents and young adults with type 1 diabetes. Diabetes
Care 1998; 21: 787–791.
12. IARC (International Agency for Research on Cancer). Monographs Programme on the Evaluation of Carcinogenic Risk to
Humans. Tobacco smoke and involuntary smoking. 2002;
Vol.83
13. IARC (Inernational Agency for Research on Cancer). Polynuclear aromatic compounds. Part1. Chemical, environmental and experimental data. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Human 1983; Vol. 32.
14. IARC (International Agency for Research on Cancer). Tobacco smoking. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenetic risk of chemicals to humans. 1986; Vol. 38,
Lyon, France.
15. Jacob J, Seidel A. Biomonitoring of polycyclic aromatic hydrocarbons in human urine. J Chromatogr B 2002; 778:
31–47.
16. Jarvis MJ, Russel MAH, Benowitz NL, Feyerabend C. Elimination of cotinine from body fluids: implications for non-invasive measurement of tobacco smokers exposure. Am J P ublic Health 1988; 78: 696–698.
17. Jarvis MJ, Tunstall-Pedoe H, Feyerabend C, Vesey C, Saloojee
Y. Comparison of tests used to distinguish smokers from
nonsmokers. Am J Public Health 1987; 77: 1435–1438.
18. Jatlow P, McKee S, O’Malley SS. Correction of urine cotinine concentrations for creatinine excretion: is it useful? Clin
Chem 2003; 49: 1932–1934.
45
B. Winiarczyk i inni
19. Jongeneelen FJ. 1-Hydroxypyrene. W: Angerer J, Schaller
KH, red. Analyses of hazardous substances in biological materials. Deutscheforschunggemeinschaft 1990; 3: 151–169.
20. Kim JY, Hecht SS, Mukherjee S, Carmella SG, Rodrigues EG,
Christiani DC. A urinary metabolite of phenanthrene as
a biomarker of polycyclic hydrocarbon metabolic activation
in workers exposed to residual oil fly ash. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev 2005; 14: 687–692.
21. Miel˝yƒska D. Nara˝enie na substancje o dzia∏aniu kancerogennym – biomarkery nara˝enia. (http://www.ietu.katowice.pl/wpr/Dokumenty/Materia∏y szkoleniowe/Szkol2/09mielzynska.pdf).
22. Matullo G, Palli D, Peluso M, Guarrera S, Carturan S, Celentano E, i wsp. XRCC1, XRCC3, XPD gene polymorphisms,
smoking and 32P-DNA adducts in a healthy subjects. Cancerogenesis 2001; 22: 593–597.
23. Nan HM, Kim H, Lim HS, Choi JK, Kawamoto T, Kang JW,
i wsp. Effects of occupation, lifestyle and genetic polymorphisms of CYP1A1, CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 on urinary
1-hydroxypyrene and 2-naphthol concentrations. Carcinogenesis 2001; 22: 787–793.
24. Nakajima M, Yamamoto T, Kuroiwa Y, Nunoya T. Improved
highly sensitive method for determination of nicotine and
cotinine in human plasma by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B 2000; 742: 211-215.
25. Nerurkar PV, Okinaka L, Aoki C, Seifried A, Lum-Jones A,
Wilkens LR, i wsp. CYP1A1, GSTM1, and GSTP1 genetic polymorphisms and urinary 1-hydroxypyrene excretion in nonoccupationally exposed individuals. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000; 9: 1119–1122.
26. Philips DH. Smoking-related DNA and protein adducts in
human tissues. Carcinogenesis 2002; 23: 1979–2004.
27. Savitz DA, Dle N, Terry Jr JW, Zhou H, Throp Jr JM. Smoking
and pregnancy outcome among African-American and white
women in Central North Carolina. Epidemiology 2001; 12:
636–642.
46
28. Secker-Walker RH, Vacek PM, Fynn BS, Mead PB. Exhaled
carbon monoxide and urinary cotinine as measures of smoking in pregnancy. Addict Behav 1997; 22: 671–684.
29. Szeliga J, Dipple A. DNA adduct formation by polycyclic aromatic hydrocarbon dihydrodiol epoxides. Chem Res Toxicol
1998; 11: 1–11.
30. Teixeira JP, Gaspar J, Martinho G, Silva S, Rodrigues S, Mayan O, i wsp. Aromatic DNA adduct levels in coke oven workers: correlation with polymorphisms in genes GSTP1,
GSTM1, GSTT1 and CYP1A1. Mutat Res 2002; 517: 147–155.
31. Thompson SG, Barlow RD, Wald NJ, Van Vunakis H. How
should urinary concentrations be adjusted for urinary creatinine concentration? Clin Chim Acta 1990; 187: 289–296.
32. Van Delft JH, Steenwinkel MS, van Asten JG, de Vogel N, Bruijntjes-Rozier TC, Schouten T, i wsp. Biological monitoring of
the exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons of coke oven
workers in relation to smoking and genetic polymorphism for
GSTM1 and GSTT1. Ann Occup Hyg 2001; 45: 395–408.
33. Van Schooten FJ, Godschalk RW, Breedijk A, Maas LM, Kriek
E, Sakai H, i wsp. 32 P-postlabelling of aromatic DNA adducts
in white blood cells and alveolar macrophages of smokers: saturation at high exposures. Mutat Res 1997; 378: 65–75.
34. WHO Regional Office for Europe, The European Health Raport 2002, Copenhagen, European Series No97.
35. Zatoƒski W, Becher H, Lissowska J, Wahrendorf J. Tobacco, alcohol and diet in the etiology of laryngeal cancer: a population based case-control study. Cancer Causes Control 1991; 2: 3–10.
Adres autora:
Oddzia∏ Laryngologii
Szpital Specjalistyczny
ul. Szpitalna 13
41-300 Dàbrowa Górnicza
Prac´ nades∏ano: 15.05.2006 r.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1