Ćwiczenie nr 2

Badanie właściwości fizyko-chemicznych białek
Właściwości amfoteryczne białek
Przygotować 2 kolbki.
a) Do kolbki odmierzyć 5 ml 0,5% roztwory żelatyny, dodać 2-3 krople zieleni
bromokrezolowej
i zawartość dobrze wymieszać. Następnie miareczkować 0,01 M HCl aż do żółtego
zabarwienia, co następuje przy pH roztworu ok. 3.
b) Powtórzyć doświadczenie używając jako wskaźnika błękit bromotymolowy i 0,01 M NaOH.
Miareczkować do uzyskania barwy niebieskiej, co następuje przy pH roztworu ok. 8,9.
Na podstawie przeprowadzonego miareczkowania porównać ilość HCl i NaOH zużytych do
zmiany zabarwienia roztworu żelatyny przy zastosowaniu obu składników.
Denaturacja cieplna białek
Ogrzać do zagotowania 2 ml roztworu białka jaja kurzego. Tworzy się biały osad
wytrąconego białka. Osad jest wyraźniejszy po dodaniu odrobiny NaCl lub zakwaszeniu kwasem
octowym.
Denaturacja białek stężonym kwasem azotowym
Do probówki odmierzyć około 1 ml stężonego roztworu HNO3 i następnie po ściance
nachylonej probówki dodać wolno około 1 ml roztworu białka jaja kurzego tak, aby nie ulegając
zmieszaniu nawarstwił się na roztwór kwasu. Na granicy obu cieczy powstaje biały pierścień
zdenaturowanego i skoagulowanego białka.
Działanie etanolu na białko
Do probówki dodać 1 ml roztworu białka jaja kurzego i 2 ml 96% etanolu. Po godzinie
rozcieńczyć zawartość probówki wodą. Strąt nie rozpuszcza się.
Strącanie białka za pomocą kationów (soli metali ciężkich)
a) Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 1% FeCl3. Wytrąca się
brunatny osad białczanu żelazowego, który rozpuszcza się w nadmiarze odczynnika.
b) Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli CuSO4. Powstaje jasnobłękitny
osad białczanu miedziowego rozpuszczający się w roztworze 0,01 M NaOH, dając kolor
fioletowy (reakcja biuretowa).
Strącanie białka za pomocą anionów
a) Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml 10% CCl3COOH (TCA).
b) Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 20% roztworu kwasu
sulfosalicylowego.
Właściwości ochronne koloidów hydrofilowych
Do 2 probówek odmierzyć po 1 ml 0,01 M roztworu AgNO3 i kilka kropli rozcieńczonego HNO3.
Do pierwszej dodać 1 ml 0,5% roztworu żelatyny, a do drugiej 1 ml wody. Po zmieszaniu do obu probówek
należy wprowadzić kroplami 2 ml 0,01 M roztworu NaCl. W probówce z żelatyną nie wytrąca się osad
AgCl.
1
Oznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny
Białka są amfoterami wieloelektrolitowymi, stąd zmiany pH roztworu powodują zmiany
jonizacji grup funkcyjnych łańcuchów białkowych, co wpływa na ich rozpuszczalność. W pH
różnym od pI cząsteczki białka posiadają ładunek, co zmniejsza ich wzajemne przyciąganie, a w
następstwie zwiększa się ich rozpuszczalność. Natomiast w punkcie izoelektrycznym, kiedy
cząsteczki pozbawione są ładunku elektrycznego, przyciąganie pomiędzy nimi jest największe, co
prowadzi do ich wytrącania z roztworu.
Kazeina charakteryzuje się najmniejszą rozpuszczalnością w punkcie izoelektrycznym.
Odpowiednio dobierając stężenia CH3COOH i CH3COONa przygotowuje się szereg probówek
z roztworami o różnych wartościach pH. Dodaje się do nich jednakową ilość kazeiny. Wartość pH
w probówce, w której wystąpi najobfitszy osad, odpowiada pI kazeiny.
Wykonanie
Przygotować 9 suchych probówek. Do pierwszej odmierzyć 3,2 ml 1 M roztworu CH 3COOH i 6,8
ml H2O, a do następnych ośmiu – po 5 ml H2O. Po dokładnym wymieszaniu zawartości w
probówce pierwszej, przenieść z niej 5 ml do drugiej, a z tej, po wymieszaniu, 5 ml do trzeciej itd.
Do każdej probówki dodać po 1 ml roztworu kazeiny i wymieszać. Obserwować roztwory
natychmiast po zamieszaniu i po 30 minutach. Wynik wpisać do tabelki:
Nr próbki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Liczba ml
1 M CH3COOH
pH roztworu
1,6
0,8
0,4
0,2
0,1
0,05
0,025
0,012
0,006
3,5
3,8
4,1
4,4
4,7
5,0
5,3
5,6
5,9
Zmętnienie
Osad
2
Dializa roztworu kazeiny i glicyny
W odróżnieniu od związków niskocząsteczkowych, białka jako koloidy nie przechodzą przez
błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowania materiału
biologicznego do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z roztworu białka
na przykład nadmiaru soli (odsolenie) lub niskocząsteczkowych związków organicznych. Do
oczyszczania stosuje się przeważnie dializę, wykorzystując zdolność przechodzenia jonów
i związków niskocząsteczkowych do wody lub buforu, znajdującego się po drugiej strony błony,
w naczyniu dializacyjnym (np.: w zlewce). Dializa jest procesem długotrwałym, niedającym
całkowitego oczyszczenia, po pewnym czasie ustala się bowiem równowaga Gibbsa-Donnana.
W
celu
przyśpieszenia
dializy
i
możliwie
maksymalnego
oczyszczenia
białka
od
niskocząsteczkowych związków zmienia się często roztwór do którego próbka jest dializowana,
a także stosuje mieszanie.
Wykonanie
Do woreczka dializacyjnego odmierzyć po 20 ml roztworu kazeiny i glicyny. Woreczek zawiesić na
bagietce umocowanej poziomo i zanurzyć w zlewce tak, by nie dotykał do dna. Przygotować dwa statywy
oznaczone symbolami I i II, w każdym po 12 probówek oznaczonych symbolami 1N, 1B, 2N, 2B.......6N,
6B. Do zlewki wlać wodę destylowaną tak, aby jej poziom nieznacznie przekraczał poziom cieczy w
woreczku dializacyjnym. W czasie 0, 15, 30, 45, 60 i 90 minut od początku dializy pobierać pipetą po 3ml
roztworu z woreczka dializacyjnego i po 3ml ze zlewki. Przenieść każdorazowo połowę pobranej próby
(tj. 1,5 ml) do probówki oznaczonej literą N, a drugą połowę do probówki oznaczonej literą B. Roztwór
z woreczka dializacyjnego przenieść do probówek w statywie I, a roztwór ze zlewki do probówek w statywie
II. Po zakończeniu doświadczenia do probówek z literą N dodać po 0,3 ml ninhydryny i gotować we wrzącej
łaźni wodnej przez 5 minut. Do probówek oznaczonych literą B dodać 0,2 ml 10% NaOH i po 3 krople 0,5%
CuSO4.
Wynik reakcji zaznaczyć zależnie od powstającego zabarwienia na +, ++, +++, ++++.
Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia uzupełnić następującą tabelę:
1
Analiza
dializatu I
r. ninhydrynowa
N
r. biuretowa
B
Analiza
dializatu II
r. ninhydrynowa
N
r. biuretowa
B
2
3
4
5
6
Zalecana literatura:
1. Ćwiczenia z biochemii pod redakcją Kłyszejko-Stefanowicz L., str: 232-246
2. Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami. Kędryna T., Gałka-Walczak M.,
Ostrowska B., str. 29-46.
3