Charakterystyka białka ERH człowieka
Transkrypt
Charakterystyka białka ERH człowieka
Projekt "Charakterystyka białka ERH człowieka" Dr Piotr Kozłowski Badania dotyczą bardzo słabo poznanego białka ERH (enhancer of rudimentary homolog) człowieka. Białko to jest niewielkim polipeptydem (104 aa, 12.3 kDa), zawierającym dwa potencjalne miejsca fosforylacji dla kinazy CK2 i jedno dla kinazy MAPK. ERH występuje także u zwierząt wyższych (mysz, żaba szponiasta) i niższych (wywilżna karłowata, wrzecioniec powabny1), roślin kwiatowych (rzodkiewnik pospolity), protistów (zarodziec) oraz niektórych grzybów (np. obecny jest u drożdży rozszczepkowych, ale brak go u drożdży piekarniczych i kropidlaka). Choć jego sekwencja aminokwasowa jest bardzo silnie konserwowana ewolucyjnie (np. białka ERH człowieka i żaby szponiastej są identyczne), to ze względu na swoją unikatowość nie dostarcza ona żadnych przesłanek co do funkcji, aktywności lub wewnątrzkomórkowej lokalizacji ERH; konsekwentnie, unikatowa jest również jego struktura przestrzenna. Na podstawie analizy mutantów wywilżny (z niedoborem ERH) przypisano wstępnie temu białku wpływ na dostępność nukleotydów pirymidynowych w komórce (Genetics 138, 1163-70). Z racji naszego zainteresowania regulacją metabolizmu nukleotydów pirymidynowych przez czynniki zewnętrzne aktywujące kinazę MAPK (Nature 403, 328-32), postanowiliśmy poznać dokładniej rolę ERH w komórkach człowieka. W trakcie dotychczasowych badań, polegających na przeszukaniu proteomu człowieka za pomocą drożdżowego systemu dwuhybrydowego w połączeniu z techniką GST pull-down i tandemową spektrometrią mas oraz użyciu mikroskopii konfokalnej i hybrydyzacji DNA-RNA, ustaliliśmy, że ERH jest białkiem jądrowym, którego gen jest wyrażany we wszystkich głównych tkankach człowieka (patrz także profil dla ERH na stronie www.proteinatlas.org), zaś jego partnerami w komórce są dwa, nowe, równie słabo poznane, wyrażane powszechnie białka jądrowe: PDIP46/SKAR (polymerase delta-interacting protein of 46 kDa / S6 kinase 1 Aly/REF-like target) i Ciz1/NP94 (p21Cip1/Waf1-interacting zinc finger protein 1 / nuclear protein of 94 kDa) (FEBS J 273, 4728-41 i FEBS J 275, 332-40). Inni pokazali, że PDIP46/SKAR wydaje się być zaangażowany w regulację wielkości komórki (Curr Biol 17, 1540-9 i Cell 133, 303-13), zaś Ciz1/NP94 w inicjację replikacji DNA (J Cell Sci 118, 101-12, J Cell Sci 120, 115-24 i J Cell Sci 123, 1108-15), a także w powstawanie nowotworów (rdzeniaka i raka piersi; Cancer Res 22, 11021-9). Ustaliliśmy także, że białko ERH wiąże się ze swoimi partnerami w miejscach, w których mogą one oddziaływać jeszcze z innymi białkami, odpowiednio p21Cip1/Waf1 (inhibitorem kinaz zależnych od cyklin) i S6K1 (kinazą białka S6 rybosomu). Ponadto pokazaliśmy, że kiedy ERH jest wyrażany razem z Ciz1/NP94, to są one rekrutowane do miejsc inicjacji replikacji DNA (replication foci), zaś kiedy ERH jest współwyrażane z PDIP46/SKAR, to kolokalizują się one w skupiskach ziarnistości interchromatynowych (nuclear speckles), będących magazynami czynników splicingowych. Wykazaliśmy zatem związek między trzema bardzo słabo scharakteryzowanymi białkami człowieka. Wszystkie one wydają się brać udział w kluczowych procesach dla funkcjonowania komórki oraz zdrowia człowieka, a które, choć badane od wielu lat, ciągle jeszcze wymagają wyjaśnienia, m.in. poprzez uwzględnienie pomijanych dotąd białek. Jednocześnie, nasze odkrycie prowokuje pytanie, czy ERH rzeczywiście działa w komórce poprzez wpływ na poziom nukleotydów pirymidynowych, czy też raczej bierze udział w niektórych procesach zależnych od ich dostępności (np. replikacji DNA, wzroście komórki) i jego brak wpływa na te procesy w inny sposób. Obecnie dążymy do dalszego poznania roli ERH w komórce człowieka, teraz już w kontekście jego interakcji z obydwoma uniwersalnymi partnerami - PDIP46/SKAR i Ciz1/NP94. Eksperymenty będą wykonywane w komórkach linii HeLa człowieka i będą bazowały na naszych obserwacjach zachowania się białka ERH w żywej komórce. Używając zróżnicowanego asortymentu, w dużej mierze stworzonych przez nas, narzędzi biologii molekularnej: mutantów ERH w miejscach fosforylacji przez kinazy CK2 i MAPK, inhibitorów i stymulacji kinaz CK2 i MAPK oraz konkurencyjnych białek p21Cip1/Waf1 i S6K1, będziemy sprawdzać wewnątrzkomórkową lokalizację ERH oraz jego zdolność do oddziaływania z PDIP46/SKAR i Ciz1/NP94. Ponadto ustalimy, czy zmiany poziomu białka ERH wywołane wyciszeniem za pomocą shRNA przeciwko transkryptowi ERH oraz nadekspresją ERH z silnego konstytutywnego promotora wywierają wpływ na procesy, z którymi związane są PDIP46/SKAR i Ciz1/NP94, odpowiednio regulację wielkości komórki i inicjację replikacji DNA. Badania prowadzone będą przy wykorzystaniu mikroskopii konfokalnej, real-time PCR i cytometrii przepływowej. Wyniki tych eksperymentów pozwolą ustalić w jakich kombinacjach (kompleksach) białka te występują w komórce, jak na ich skład wpływa fosforylacja - bardzo dobrze udokumentowany mechanizm regulacji zachowywania się białek w komórce oraz jakie jest ich znaczenie funkcjonalne. Równolegle prowadzimy badania z wykorzystaniem drożdży rozszczepkowych, u których ostatnio odkryliśmy obecność białka ERH. Mają one na celu pełną charakterystykę tego białka, z nadzieją na wskazanie jego funkcji i procesów, w które jest ono zaangażowane, uniwersalnych dla wszystkich organizmów eukariotycznych, w których ono występuje, co pomoże zrozumieć jego rolę u człowieka. Zakład Biologii Molekularnej UW jest obecnie jedynym laboratorium na świecie prowadzącym systematyczne badania mające na celu ustalenie roli ERH w komórkach człowieka. Kierownikiem projektu jest dr Piotr Kozłowski. Projekt jest dostępny dla licencjatów i magistrantów Zakładu Biologii Molekularnej. 1 Wrzecioniec powabny to nazwa polska dla nicienia Caenorhabditis elegans zaproponowana przez kierownika tego projektu.