Ćwiczenie I - Wydział Biologii UW

ĆWICZENIE I
BADANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI I
CHEMIOTERAPEUTYKI
Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak
Wstęp
Jednym z najważniejszych etapów rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń
bakteryjnych jest oznaczenie wrażliwości patogenu na leki. Szerokie stosowanie
antybiotyków/chemioterapeutyków pociąga za sobą ciągły wzrost oporności na leki wśród
wielu klinicznie ważnych drobnoustrojów, a także pojawienie się nowych mechanizmów
oporności. W chwili obecnej stosuje się wiele różnych metod identyfikacji oporności od
prostych testów fenotypowych po metody wykorzystujące techniki biologii molekularnej.
Współczesne laboratorium mikrobiologiczne posiada możliwość oznaczania lekowrażliwości
różnymi metodami fenotypowymi:
1. metoda jakościowa – metoda dyfuzyjno-krążkowa, wykorzystująca zjawisko powstawania
w podłożu gradientu stężeń w trakcie dyfuzji substancji czynnej z krążka antybiogramowego.
2. metodami ilościowymi, pozwalającymi na określenie najmniejszego stężenia hamującego
leku (ang. minimal inhibitory concentration, MIC).
2.1. metoda rozcieńczeń w podłożu stałym – antybiotyk obecny w podłożu agarowym w
malejących stężeniach, na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o określonej j gęstości
2.2. metoda rozcieńczeń w podłóżu płynnym– antybiotyk obecny w malejących stężeniach w
bulionie;
2.3. E-testy – metoda łącząca w sobie cechy metody rozcieńczeniowej i metody dyfuzyjnej,
polegająca na wytwarzaniu stabilnego, ciągłego gradientu stężeń antybiotyku w podłożu
agarowym.
Celem ćwiczenia jest oznaczenie wrażliwości szczepów bakteryjnych na związki
antybakteryjne z zastosowaniem metod fenotypowych i molekularnych.
Wykonanie ćwiczenia
Materiały
Szczepy bakteryjne
Staphylococcus aureus ATCC 29231
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Listeria monocytogenes ATCC13932
Antybiotyki
wodny roztwór tetracykliny (10 mg/ml)
wodny roztwór wankomycyny (10 mg/ ml)
wodny roztwór ampicyliny (10 mg/ml)
roztwór cyprofloksacyny w 0.1 M HCl (10 mg/ml)
Podłoża
(skład w przeliczeniu na 1 litr)
Antybiogramowe Muellera-Hintona II pH-7,3
wyciąg wołowy
3,0 g
kwaśny hydrolizat kazeiny 17,5 g
skrobia
1,5 g
Antybiogramowe Muellera-Hintona II agar (MHA)
Bulion kazeinowo-sojowy z ekstraktem drożdżowym (TSYEB) pH-7,3
pepton K
17,0 g
pepton SP
3,0 g
glukoza
2,5 g
chlorek sodu
50g
fosforan dwupotasowy
2,5 g
ekstrakt drożdżowy
6,0
1. Badanie wrażliwości szczepów metodą dyfuzyjno-krążkową
Przygotować odpowiednie zawiesiny (gęstość 0,5 McFarlanda) następujących szczepów:
S. aureus, E. faecalis, E. coli, P. aeruginosa.
Na podłoże antybiogramowe Mueller-Hinton II, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść
zawiesinę bakteryjną. Po upływie 10 min nałożyć krążki bibułowe nasączone
antybiotykiem/chemioterapeutykiem w ściśle określonym stężeniu (Tabela 1). Po inkubacji,
prowadzonej w 35-37 oC przez 18-20 godz., zmierzyć średnicę strefy zahamowania wzrostu
bakterii wokół krążka antybiotykowego.
Określić wrażliwość badanego szczepy wykorzystując dane z Tabeli 1.
2. Określanie wartości minimalnego stężenia hamującego
2.1.Określanie
wartości
MIC
metodą
podwójnych
antybiotyku/chemioterapeutyku w podłożu płynnym na płytkach titracyjnych.
rozcieńczeń
2.1.1. Przygotować 5 ml podłoża MH II uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami w
stężeniu końcowym: wankomycyna - 16 g/ml; tetracyklina - 16 g/ml; ampicylina – 16
g/ml; ciprofloksacyna - 16 g/ml.
Stężenie wyjściowe każdego z antybiotyków: 1 mg/ml.
2.1.2. Przygotowanie hodowli bakteryjnej
Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń hodowli nocnych szczepów bakterii z rodzaju
Listeria w roztworze soli fizjologicznej (RF) tak, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie
hodowli 10-4 co odpowiadało około 104 jtk/ml.
2.1.3. Przygotowanie rozcieńczeń antybiotyku w podłożu
Na 96 dołkowe płytki titracyjne o końcowej objętości 200 μl, nanieść po 100 μl podłoża
MH II (począwszy od dołka B w każdej kolumnie). Następnie do dołka A w każdej kolumnie
nanieść 200 μl podłoża MH II uzupełnionego badaną substancję w odpowiednim stężeniu.
Począwszy od dołka A przenosić po 100 μl roztworu do kolejnych dołków, uzyskując w ten
sposób serię dwukrotnych rozcieńczeń badanej substancji.
Na koniec do każdego dołka dodać po 100 μl hodowli bakteryjnej z rozcieńczenia 10-5 .
2.1.4 Odczyt wyników
Hodowle bakteryjne na płytkach titracyjnych należy inkubować w temperaturze 35-37 oC
przez 18-20 godz. Odczyt będzie polegał na obserwacji zmętnienia podłoża. Za wartość MIC
należy przyjąć najmniejsze stężenie antybiotyku, przy którym nie zaobserwowano wzrostu
bakterii.
2.2. Określanie wartości MIC metodą E-testów
Na podłoże antybiogramowe MH II, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść zawiesinę
bakteryjną szczepów S. aureus/E. faecalis (gęstość 0,5 w skali McFarlanda). Po upływie 10
min nałożyć paski testowe (E-testy) ze stopniowo zmieniającymi się stężeniami antybiotyku.
Po inkubacji przez 20-24 godz. w temp. 37oC na skali testu odczytać wartość MIC.
Za MIC przyjąć wartość w punkcie przecięcia eliptycznej strefy zahamowania wzrostu
utworzonej wokół paska z jego brzegiem.
Określić wrażliwość badanego szczepy wykorzystując dane z Tabeli 2.