Modelowanie bioreaktora okresowego do enzymatycznej

Prosimy cytować jako: Inż. Ap. Chem. 2009, 48, 3, 53-54
Nr 3/2009
IN¯YNIERIA I APARATURA CHEMICZNA
Str. 53
MA£GORZATA M. JAWORSKA
Wydzia³ In¿ynierii Chemicznej i Procesowej, Politechnika Warszawska, Warszawa
Modelowanie bioreaktora okresowego
do enzymatycznej deacetylacji chitozanu
Wprowadzenie
Reaktor okresowy jest wygodnym uk³adem do prowadzenia
reakcji z wykorzystaniem natywnych enzymów. Najczêœciej,
w przypadku prostych reakcji enzymatycznych opisywanych
z wykorzystaniem modelu Michaelis-Menten, zmiany stê¿enia substratu w reaktorze przedstawiane s¹ zale¿noœci¹:
-
dS
k ES
= cat 0
dt
KM + S
(1)
która po sca³kowaniu przyjmuje postaæ:
t=
1
kcat E0
S0
é
ù
ê K m ln S + ( S0 - S )ú
ë
û
(2)
Stopieñ skomplikowania opisu zale¿eæ jednak bêdzie bardzo silnie od uwzglêdnienia dodatkowych efektów zachodz¹cych w uk³adzie takich jak np. inhibicja czy dezaktywacja
termiczna enzymu.
10 kDa) i zatê¿ano przez ultrafiltracjê (modu³ o cut-off 10
kDa). Stê¿enie enzymu w roztworze HCl pH 4.0 wynosi³o
41,09 mg/L
Chitozan – w doœwiadczeniu stosowano chitozan œredniocz¹steczkowy o stopniu acetylacji 39,7% stanowi¹cy darowiznê Mahtani-Gilett-Chitosan (Indie). Stê¿enie chitozanu
w roztworze wynosi³o 5.0 g/L co odpowiada³o stê¿eniu merów
N-acetylglukozaminy 11.13 mmol/L
Uk³ad doœwiadczalny – Wszystkie doœwiadczenia prowadzono w termostatowanym reaktorze (1300 mL) wyposa¿onym w mieszad³o magnetyczne. W reaktorze umieszczano
1000 mL roztworu chitozanu w HCl o pH 4.0 i mieszaj¹c
(250–300 obr/min) termostatowano przez 30 min w temperaturze 50oC. Reakcjê inicjowano dodaj¹c 50 mL roztworu enzymu preinkubowanego w 50oC przez 10 min. W odpowiednich
odstêpach czasu (co 10–20 min) pobierano próbki roztworu;
reakcja enzymatyczna zatrzymywana by³a przez dodanie 0,1
mL 1 M NaOH. Wytr¹cony chitozan usuwano poprzez wirowanie, a w klarownym roztworze oznaczano stê¿enie kwasu
octowego
Metody analityczne
Deacetylaza chitynowa jest enzymem, który hydrolizuje wi¹zania miêdzy grup¹ acetylow¹ a grup¹ aminow¹ w merach
N-acetyloglukozaminy przekszta³caj¹c je do glukozaminy.
Reakcja ta ma znaczenie w procesie enzymatycznej deacetylacji chitozanu. Daje ona mo¿liwoœæ modyfikowania stopnia
acetylacji polimeru bez zmiany jego masy cz¹steczkowej, co
nie jest mo¿liwe w przypadku deacetylacji chemicznej.
Stwierdzono jednak, ¿e uwalniany w procesie kwas octowy
jest inhibitorem dla deacetylazy chitynowej [1, 2]; mechanizm
tej inhibicji nie zosta³ dotychczas opisany. Dodatkowo wykazano tak¿e, ¿e deacetylaza chitynowa mo¿e ulegaæ dezaktywacji termicznej w trakcie d³ugotrwa³ego prowadzenia procesu [3–5].
Celem prezentowanej pracy by³o porównanie modelu enzymatycznej deacetylacji chitozanu przy i bez uwzglêdnienia inhibicji produktem oraz dezaktywacji termicznej z danymi doœwiadczalnymi uzyskanymi w reaktorze okresowym.
Materia³y i metody
Deacetylaza chitynowa – grzyby strzêpkowe Absidia orchidis vel coerulea NCAIM F 0642 namna¿ano w zmodyfikowanej po¿ywce YPG [6] w bioreaktorze Biostat ED (7.0 L
pod³o¿a, temp. 27ºC), a nastêpnie wydzielano z roztworu,
przemywano wod¹ destylowan¹ i homogenizowano, sta³¹ pozosta³oœæ odrzucono zaœ roztwór wysycono siarczanem amonu
(80%) i przechowywano przez noc w temperaturze 4–10oC. Po
odwirowaniu wysolonych bia³ek (6 000 obr/min, 15 min, 4oC),
roztwór dializowano wzglêdem HCl (pH 4.0, modu³ o cut-off
Stê¿enie bia³ka oznaczano kolorymetryczn¹ metod¹ Bradforda.
Stê¿enie kwasu octowego oznaczano metod¹ chromatograficzn¹ [7].
Wyniki doœwiadczeñ
Doœwiadczenia prowadzono w reaktorze okresowym przez
6 godzin. Zmiany stê¿enia kwasu octowego przeliczono na
zmiany stê¿enia merów N-acetylglukozaminy (reakcja jest
równomolowa), a nastêpnie przedstawiono w postaci zale¿noœci S od t. Dane doœwiadczalne porównano nastêpnie z modelem prostej reakcji enzymatycznej. Parametry w równaniu
Michaelis-Menten wyznaczono w niezale¿nych doœwiadczeniach metod¹ szybkoœci pocz¹tkowej: kcat = 11,21 1/min, KM =
2,45 mmol/L, (Rys. 1).
Porównanie danych doœwiadczalnych z modelem wskazuje
na wyraŸnie znaczne ró¿nice wynikaj¹ce z braku uwzglêdnienia inhibicji produktem. W niezale¿nych badaniach (metoda
Dixona) stwierdzono, ¿e kwas octowy jest inhibitorem wspó³zawodnicz¹cym, zaœ sta³a inhibicji ma wartoœæ Ki = 0,286
mmol/L. Sca³kowana zale¿noœæ bilansowa bêdzie zatem mia³a
postaæ:
t=
ù
æ
1 é
S ö S0 æ
Sö
+ ç 1÷ ln
÷ ( S0 - S )ú
ê KM ç 1+
kcat E0 ë
K
S
K
è
è
iø
iø
û
(3)
Dane modelowe wskazuj¹ na lepsz¹ zgodnoœæ z danymi doœwiadczalnymi (Rys. 1), jednak i w tym przypadku nie jest
ona zadowalaj¹ca. Przyczyn¹ tego mo¿e byæ brak uwzglêdnie-
Prosimy cytować jako: Inż. Ap. Chem. 2009, 48, 3, 53-54
Str. 54
IN¯YNIERIA I APARATURA CHEMICZNA
Nr 3/2009
Rys. 1. Porównanie danych doœwiadczalnych z proponowanymi
modelami
Rys. 2. Porównanie danych doœwiadczalnych z zaproponowanym
modelem
nia dodatkowo dezaktywacji termicznej deacetylazy chitynowej. Równanie bilansowe uwzglêdniaj¹ce dezaktywacjê termiczn¹ enzymu ma nastêpuj¹c¹ postaæ:
Wykreœlaj¹c zale¿noœæ F(t) vs S mo¿emy porównaæ dane doœwiadczalne z modelem uwzglêdniaj¹cym zarówno inhibicjê
produktem jak i dezaktywacjê termiczn¹ enzymu, (Rys. 2).
W tym przypadku uzyskano najlepsz¹ zgodnoœæ danych doœwiadczalnych z danymi modelowymi. Przedstawione wyniki
wskazuj¹ tak¿e, ¿e wp³yw dezaktywacji termicznej deacetylazy chitynowej na proces deacetylacji chitozanu jest istotniejszy ni¿ wp³yw inhibicji kwasem octowym.
-
dS
=
dt
kcat E( t )S
æ
I ö
KM ç 1+
÷ +S
Ki ø
è
(4)
W niezale¿nych badaniach stwierdzono, ¿e dezaktywacja
termiczna nie jest zgodna z modelem pierwszorzêdowym, lecz
mo¿e byæ opisana modelem trójparametrycznym Aymarda
i Belarbi [8]:
E( t )
= 0,6862 exp( -0,00197t ) + (1 - 0,6862) exp( -0,0309t ) (5)
E0
Zatem sca³kowane równanie bilansowe przyjmuje postaæ:
F( t) =
ù
æ
1 é
S ö S0 æ
K ö
+ ç 1 - M ÷ ( S0 - S )ú
÷ ln
ê KM ç 1+
K
S
K
kcat E0 ë
è
è
iø
i ø
û
(6)
gdzie:
F ( t ) = 358,47 - 348,31exp(0,00197t ) - 10,16 exp( -0,0309t ) (7)
LITERATURA
1. D. Kafetzopoulos, A. Martinou, V. Bouriotis: Proc Nat Acad Sci USA,
90, 2564 (1993).
2. K. Tokuyasu, M. Ohnishi-Kameyama, K. Hayashi: Biosci Biotech Biochem, 30, 239 (1996).
3. R.V.S. Amorim, W.M. Ledingham, K. Fukushima, G.M.J. Campos-Takaki: Ind. Microbiol. Biotechnol. 32, 19 (2005).
4. I. Ko³odziejska, M. Malesa-Cieæwierz, A. Lerska, Z. Sikorski: J Food
Biochem. 23, 45 (1999).
5. A. Martinou, D. Kafetzopoulos, V. Bouriotis: Carbohydrate Res., 273,
235 (1995).
6. M.M. Jaworska, E. Konieczna: Appl. Microbiol. Biotechnol, 56, 220
(2001).
7. M.M. Jaworska, J. Bryjak, J. Liesiene: Cellulose 16, 261 (2009).
8. Ch. Aymard, A. Belarbi: Enz Microb Tech, 27, 642 (2000).